Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Este sistema esferoide de co-cultivo 3D está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Será eficaz para evaluar los moduladores angiogénicos potenciales y proporciona información predecible antes de los estudios in vivo. Este sistema utiliza esferoides de co-cultivo formados por dos células progenitoras vasculares y se puede utilizar para investigar las interacciones celulares, la brotación, y la maduración tubular de la angiogénesis fisiológica.

Si podemos utilizar células de pacientes para formar esferoides de co-cultivo, podemos utilizar este sistema para desarrollar tratamientos personalizados para enfermedades anormales relacionadas con la angiogénesis, como el cáncer. Este sistema de ensayo puede aumentar la sensibilidad y la eficiencia de los estudios de angiogénesis y desarrollo de fármacos. Comience por usar 05%trypsin-EDTA para separar los ECFC y los MSC de 80 a 90%cultivos celulares confluentes durante tres o cinco minutos en una incubadora de cultivo celular, respectivamente.

Inactivar la trippsina con un medio DMEM completo y pipetear las células varias veces para generar una sola suspensión de células. Recoger las células por centrifugación, seguido de dos lavados con medio libre de suero. Después del segundo lavado, diluir los ECFC a tres veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media y los MSC a dos veces 10 a las seis células por milímetro de concentración media en tubos de microcentrífuga individuales de dos mililitros.

Pelecila las células por centrifugación, y aspirar cuidadosamente todas menos las últimas 15 a 25 microlitros de sobrenadante de cada muestra de célula. A continuación, resuspender cada pellet en 250 microlitros de diluyente C de un kit de tinte fluorescente, y pipetear suavemente las suspensiones celulares para asegurar una dispersión completa. Añadir 250 microlitros de 20 micromolares PKH67 recién preparados al tubo de ECFC.

Añadir 250 microlitros de 12 micromolar PKH26 al tubo de MSC. Mezclar inmediatamente ambas suspensiones celulares. Después de cinco minutos a temperatura ambiente con agitación, protegido de la luz, detenga el proceso de tinción con una incubación de un minuto en 0,5 mililitros de FBS por tubo.

Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación, y retirar cuidadosamente el sobrenadante, seguido de dos lavados en dos mililitros de medio fresco completo por lavado. Luego suspenda las células en el medio respectivo en tubos de 15 mililitros. Para la generación de esferoides, después del segundo lavado, primero diluir las suspensiones celulares en la concentración adecuada de medio de crecimiento celular endotelial MV2 complementado con 20%solución de celulosa metilo y 5%concentración sérica bovina fetal.

A continuación, agregue cada suspensión celular en un depósito rectangular de poliestireno esterilizado. Utilice una pipeta multicanal para añadir aproximadamente gotas de 125 microlitro de células a la cubierta de una placa de cultivo de 150 milímetros. Cuando se hayan añadido todas las células, invierta la cubierta sobre la parte inferior de un plato que contenga 15 mililitros de PBS, y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.

Al día siguiente, enjuague las cubiertas de los platos con cinco mililitros de PBS en un tubo de 50 mililitros por plato. Enjuague las cubiertas con cinco mililitros adicionales de PBS para recoger los esferoides restantes, y pelete los esferoides por centrifugación. Deseche cuidadosamente todos los últimos 100 a 200 microlitros de sobrenadantes, y toque suavemente en la pared del tubo para que los esferoides se suspendan libremente en el sobrenadante restante.

Añadir el volumen adecuado de medio de crecimiento celular endotelial MV2 complementado con 5%suero bovino fetal y 40%solución de celulosa de metilo a cada tubo para resuspender los esferoides a 100 esferoides por mililitro de concentración media. Utilice una punta de pipeta de un mililitro cortada a un diámetro de tres a cinco milímetros para mezclar suavemente las suspensiones de esferoides. Utilice una nueva pipeta de punta ancha de un mililitro para mezclar la solución de suspensión de esferoides con un gel de colágeno neutralizado tipo I en una proporción de uno a uno sobre hielo.

Agregue 900 microlitros de cada solución de gel de colágeno que suspenda el esferoides en los recipientes de una placa precalerada de 24 pozos. Permitir que las suspensiones se polimericen durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular, antes de cubrir los esferoides con 100 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales MV2 complementados con 2.5%FBS y 50 nanogramos por mililitro de VEGF a los esferoides solo ECFC y medio complementado con FBS sólo para los cultivos de esferoides MSC y ECFC-plus-MSC. A continuación, coloque cada placa en un grabador celular en tiempo real instalado en una incubadora de cultivo celular, y concéntrese aleatoriamente en cinco a 10 esferoides en un aumento de 10x para monitorear la formación de brotes de cada esferoide con etiqueta de fluorescencia cada hora durante 24 horas.

Para cuantificar la brotación del esferoide, importe los archivos de imagen a ImageJ y mida el número y la longitud de los brotes expresando la señal fluorescente adecuada de cinco esferoides seleccionados aleatoriamente por grupo experimental. Para los esferoides ECFC-plus-MSC, el número de brotes y la longitud acumulada del brote son significativamente mayores en comparación con los de los esferoides solo ECFC en todos los puntos de tiempo. Los esferoides solo MSCs no forman brotes, sino que demuestran una migración individual del MSC fuera de los esferoides.

El etiquetado de ECFC con tinte verde-fluorescente y MSC con tinte rojo-fluorescente antes de combinarse para generar esferoides ECFC-plus-MSC demuestra que las estructuras de brotes mediados por ECFC están cubiertas con MSC, lo que sugiere que los MSC combinados funcionan como células perivasculares durante la formación de brotes, mejorando la estabilidad y durabilidad del brote mediante la estrecha asociación entre dos células vasculares. Los esferoides ECFC-plus-MSC pretratados con un inhibidor de la angiogénesis muestran una disminución del número de brotes y una longitud acumulada del brote de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control de los esferoides ECFC-plus-MSC. En experimentos paralelos, los esferoides solo ECFC pretratados con el inhibidor seguidos de estimulación con VEGF también demuestran una disminución del número de brotes inducidos por el factor de crecimiento y la longitud acumulada del brote de una manera dependiente de la dosis.

Cabe destacar que se necesita una mayor concentración de inhibidores de la angiogénesis para inhibir los esferoides ECFC-plus-MSC en comparación con los esferoides solo ECFC. El crecimiento tumoral se inhibe significativamente en animales tratados con inhibidores de la angiogénesis en dosis altas en comparación con animales tratados con control y animales tratados con inhibidores de la angiogénesis de baja dosis en un modelo de ratón tumoral de xenoinjerto humano. La concentración plasmática de bevacizumab en ratones tratados con dosis altas fue de 568 más o menos 40,62 microgramos por mililitro, que estaba más cerca del valor IC50 de bevacizumab para inhibir la longitud acumulada del brote en esferoides ECFC-plus-MSC en lugar de esferoides solo ECFC.

Esto sugiere que el sistema de esferoides de co-cultivo ECFC-plus-MSC es adecuado para predecir concentraciones plasmáticas efectivas antes de un estudio en animales. El uso de una pipeta de punta ancha de un ml para mezclar suavemente los esferoides mientras están en gel de colágeno sobre hielo es importante para proteger la integridad de los esferoides. Podemos modificar este sistema para introducir otros tipos de células como células inmunitarias y otras matrices extracelulares para investigar la interferencia de la matriz celular durante la angiogénesis.