Name: Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a evaluar moduladores angiogénicos con un sistema de esferoides tridimensional de cocultivo ECFC-MSC. Este ensayo imita la angiogénesis fisiológica y mejora la eficiencia en el desarrollo de fármacos.

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Esta investigación fue apoyada por una subvención (17172MFDS215) del Ministerio de Seguridad Alimentaria y de Drogas, la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de Ciencia Básica a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del Programa de Investigación de Ciencias Básicas a través del Gobierno de Corea (MSIP) (2017R1A2B4005463), y el Programa de Investigación de CienciaS Básicas a través del Programa de Investigación de Cienciabásica básica a través del National Research Foundation of Korea(NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2016R1A6A1A03007648).

Los EFCC humanos se aislaron de la sangre periférica humana, como se describe en un informe anterior27. Brevemente, la capa de células mononucleares fue separada de toda la sangre usando el Ficoll-Paque Plus, y cultivada en el medio adecuado hasta que aparecieron las colonias endoteliales. Se recogieron colonias y se aislaron los EFC utilizando perlas magnéticas recubiertas de CD31. Los MSC se aislaron de la fracción de células mononucleares adherentes (MNC) de la médula ósea adulta humana. El protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad de Mujeres de Duksung (IRB No. 2017-002-01).
1. Cultivo celular
<ol><li>
Preparación de eFC y PLACAs de capa medianas y de MSC
	<ol>
<li>Preparar el medio de crecimiento de células endoteliales MV2 (ECGM-MV2, excepto hidrocortisona) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de glutamina-penicilina-estreptomicina (GPS).</li>
		<li>Preparar el crecimiento de células madre mesenquimales medio-2 (MSCGM-2) que contiene 10% FBS y 1% GPS.</li>
		<li>Para el cultivo ECFC, cubra las placas de cultivo celular con una solución de gelatina al 1%. Para preparar 1% solución de gelatina, disolver 1 g de gelificación en polvo en 500 ml de PBS con el agitador magnético, y esterilizar con autoclave. Las placas se pueden recubrir con 3 ml/60 mm, 5 ml/100 mm o 15 ml/150 mm de solución de gelatina al 1%. Incubar placas recubiertas durante 15 minutos en una incubadora de cultivo celular (37 oC y 5% CO2). Después de eso, retire el 1% restante de la solución de gelatina por aspiración y lave las placas recubiertas una vez con PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Crecientes EFCCs y MSCs
	<ol>
<li>Semilla 1 x 106 EFC en placas 1% recubiertas de gelatina de 150 mm, y crecen usando ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) en una incubadora de cultivo celular (37oC y 5% CO2)a 80-90% de confluencia. Utilice los FCFC en los números de paso 7-10 para obtener resultados consistentes.</li>
		<li>Semilla 1 x 106 MSC en placas no recubiertas de 150 mm, y crecen usando MSCGM-2 en una incubadora de cultivo celular (37oC y 5% CO2)a 80-90% de confluencia. Utilice los MSC en los números de paso 7-10 para obtener resultados consistentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de 1,2% p/v Solución de metilcelulosa
<ol><li>Mida 6 g de celulosa metilenenenenta en una botella de vidrio de 500 ml y esterilizar en un autoclave.</li>
	<li>Calentar ECGM-MV2 (sin FBS y GPS) a 60 oC durante 20 min, y añadir 250 ml de ECGM-MV2 calentado a polvo de metilcelulosa esterilizado. Para mantener condiciones estériles, lleve a cabo el proceso dentro de la campana de flujo.</li>
	<li>Agregue una barra de agitación magnética esterilizada y mezcle la solución durante 20 minutos en el agitador magnético hasta que la celulosa metilse se humedezca completamente y se disperse uniformemente sin grumos. Añadir 250 mL de ECGM-MV2 frío (4 oC) (sin FBS y GPS) bajo la condición estéril y mezclar durante 10 minutos adicionales en el agitador magnético. A continuación, enfríe la solución en un frigorífico (4oC) durante la noche. NOTA: La metilcelulosa es un polímero de carbohidratos que se disuelve bien en temperaturas frías debido a la hinchazón y posterior hidratación.</li>
	<li>Al día siguiente, alícuota la solución en un tubo de 50 ml y centrífuga a 5.000 x g durante 3 h a 4 oC. Tomar la solución de sobrenadante viscoso transparente y almacenar a 4 oC hasta su uso durante un máximo de 3-6 meses. NOTA: El sedimento puede contener fibra residual de celulosa, por lo que tomar suavemente la solución sobrenadante dejando atrás al menos 5 ml de volumen. Este volumen se puede ajustar según las condiciones experimentales.</li>
</ol>3. Generación e incrustación de esferoides de ECFCs, solo para MSC y ECFCs-MSCs
Día 1
<ol><li>Preparación de la suspensión celular de los EFCC y los MSC
	<ol>
<li>Lave los eFC y MSC confluentes del 80-90% añadiendo solución salina tamponada de fosfato (PBS) sin calcio y magnesio, y aspirar.</li>
		<li>Para separar los EFC y los MSC de la placa de cultivo, incubarlos con 0,05% de trippsina-EDTA durante 3 min y 5 min en una incubadora de cultivo celular (37oC y 5% CO2),respectivamente, en una incubadora de cultivo celular.</li>
		<li>Inactivar la trippsina añadiendo un medio DMEM que contenga 10% FBS y 1% GPS. Pipetear las celdas hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión de una sola celda.</li>
		<li>Sedimentar las células por centrifugación a 282 x g durante 5 min a RT.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio respectivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Etiquetado de EFC y MSC con tinte fluorescente NOTA: Realizar el etiquetado de membrana celular de eFC con PKH67 (verde) y MSCs con PKH26 (rojo) colorante fluorescente siguiendo las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones de la siguiente manera.<ol>
<li>Lave las células dos veces con un medio libre de suero para eliminar el FBS. NOTA: Las proteínas y los lípidos de FBS reducen la concentración efectiva de tinte para el etiquetado de las células mediante la unión.</li>
		<li>Cuente los EFC y los MSC utilizando un hemocitómetro bajo el microscopio, y transfiera 3 x 106 EFCC y 2 x 106 MSC a microtubos de 2 ml. NOTA: Estas son las densidades celulares óptimas para el etiquetado de células con tendedes. El uso de un gran número de células causa una tinción deficiente y heterogénea, mientras que el uso de muy pocas células produce una recuperación deficiente de las células.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 100 x g durante 5 min a RT para obtener un pellet celular. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante dejando no más de 15-25 l de volumen residual.</li>
		<li>Vuelva a suspender los EFC y los MSC en 250 ml de diluyente C del kit de tinte. Pipetee suavemente la suspensión celular para asegurar una dispersión completa. NOTA: El diluyente C es una sal fisiológica, y puede reducir la eficiencia de tinción del tinte mediante la formación de micelas. Por lo tanto, no deje que las células se pongan de pie en el diluyente C durante mucho tiempo, y no vórtice los tubos.</li>
		<li>Preparar la solución de tinción para los FCE añadiendo 5 l de PKH67 a 250 l de diluyente C (concentración final de 20 m) y para los MCS añadiendo 3 ml de PKH26 a 250 l de diluyente C (concentración final de 12 m). NOTA: Las concentraciones finales de tinte son diferentes de las recomendaciones del fabricante. Una alta concentración conduciría a aglutinamiento celular y toxicidad celular. La baja concentración no sería suficiente para la tinción.</li>
		<li>Añadir 250 l de suspensión celular de EFC a 250 ml de solución de tinte PKH67, y 250 ml de MSC a 250 ml de solución de tinte PKH26. Mezcle inmediatamente las células con colorantes pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para obtener mejores resultados, cubra el tubo con papel de aluminio y colóquelo en una coctelera para asegurar una mezcla suficiente durante la tinción.</li>
		<li>Detenga el proceso de tinción agregando 0,5 ml de FBS a la suspensión de células manchadas y, a continuación, incuba durante 1 min para permitir que FBS se adhiera al exceso de tinte no unido. Sedimentar las células manchadas por centrifugación a 100 x g durante 5 min. NOTA: Los peletes EFC y MSCson son de color amarillo claro y rosa, respectivamente, después de la tinción.</li>
		<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y lave las células dos veces con un medio completo para eliminar el exceso de tinte. Centrifugar los tubos a 100 x g durante 5 min y volver a suspender el pellet en 2 ml de cada medio completo.</li>
	</ol></li>
	<li>Generación de esferoides ECFC, MSC o ECFC+MSC NOTA: Aplique la técnica de caída colgante para generar esferoides como se describió anteriormente28. Los pasos para la preparación de esferoides se indican a continuación.<ol>
<li>Cuente los EFC manchados y los MSC.</li>
		<li>Suspenda los FCFC manchados, los MSC o los FCM+MSC en ECGM-MV2 que contengan una solución de metilcelulosa al 20% y un 5% de FBS. Prepárese a una densidad celular de 4 x 104 células/ml para EFC o MSC (25 ml de suspensión celular contiene 1.000 células). Para la suspensión de dos células de los EFC y los MSC, prepárese a una densidad celular de 2 x 104 células/mL de EFCC y 0,4 x 104 MSC de célula/ml (25 ml contiene 500 EFCC y 100 MSC). NOTA: La relación entre los FCFC y los MSC no debe exceder de 5:1. Un mayor número de MSC podría conducir a una migración excesiva y a una morfología irregular de los brotes. Un número menor de MSC podría causar una mala interacción entre las células, produciendo una mala brotación.</li>
		<li>Prepare una unidad de hidratación añadiendo 15 ml de PBS en la parte inferior de una placa de cultivo de 150 mm.</li>
		<li>Transfiera la suspensión celular al depósito rectangular de poliestireno esterilizado para el uso de pipetas multicanal. Disperse la suspensión de las células uniformemente pipeteando.</li>
		<li>Deposite 25 s/L gotas de suspensión celular en la cubierta de una placa de cultivo de 150 mm utilizando una pipeta multicanal (aproximadamente 100 gotas/cubierta de la placa de 150 mm). Invierta la cubierta sobre una unidad de hidratación llena de PBS e incubar en una incubadora de cultivo celular durante 24 horas. NOTA: La solución de metilcelulosa proporciona una viscosidad adecuada a la solución de suspensión. Cuando el método de caída colgante se realizó sin solución de metilcelulosa, las gotas se deslizaron fácilmente cuando la cubierta se invirtió(Figura suplementaria 1). Además, después de la incubación durante la noche, los esferoides no se formaron perfectamente sin solución de metilcelulosa. Este resultado indica que la viscosidad adecuada por solución de metilcelulosa es necesaria para formar forma redonda de los esferoides.</li>
	</ol></li>
</ol>Día 2
<ol start="4"><li>Incrustar esferoides en gel de colágeno neutralizado
	<ol><li>FbS caliente y ECGM-MV2 (sin FBS y GPS) en un baño de agua (37 oC). Coloque la solución de metilcelulosa fría en un banco de trabajo para llevar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque una placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo celular (37 oC) para calentarla.</li>
		<li>Corte las puntas puntiagudas de 1 ml de pipeta de 3-5 mm para aspirar esferoides y suspensiones viscosas, como la solución de metilcelulosa y el colágeno tipo I, de forma cómoda y precisa.</li>
		<li>Preparar 3 mg/ml de gel de colágeno tipo I neutralizado en hielo siguiendo las instrucciones del fabricante del gel de colágeno tipo I. NOTA: La neutralización debe realizarse sobre hielo para evitar la gelación de colágeno a temperatura ambiente. Para un pozo de una placa de 24 pocillos, se necesitan 500 ml de colágeno neutralizado. Preparar siempre 1 ml de volumen extra de colágeno. Gel de colágeno se puede utilizar hasta 2-3 h después de la neutralización si se mantiene en hielo.</li>
		<li>Cosecha los esferoides encerrando la cubierta que contiene esferoides con 5 ml de PBS. Recoger la solución suspendida por esferoides en un tubo cónico de 50 ml. Vuelva a enjuagar la cubierta con 5 ml de PBS para obtener los esferoides restantes. NOTA: Durante la cosecha, observar de cerca para confirmar la existencia de esferoides. Para una inspección más visual, transfiera alrededor de 50-100 l de solución suspendida por esferoides en el vidrio deslizante y compruebe la forma redonda de los esferoides bajo el microscopio.</li>
		<li>Sedimentar los esferoides centrifugando a 282 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante cuidadosamente sin molestar a los esferoides dejando atrás no más de 100-200 l de volumen residual.</li>
		<li>Toque suavemente en la pared del tubo para que los esferoides se suspendan libremente en la solución residual restante de 100-200 l.</li>
		<li>Agregue ECGM-MV2 que contenga 5% de FBS y 40% de solución de metilcelulosa al tubo que contiene esferoides. El volumen añadido se determina sobre la base de aproximadamente 100 esferoides/ml. Mezcle suavemente la suspensión esferoide pipeteando con una punta de pipeta contundente de 1 ml. NOTA: La solución de metilcelulosa se utiliza ampliamente como un agente de suspensión que no permite que los esferoides sedimenten. La concentración de FBS debe ser del 5%. Mayor concentración de FBS causa brotes anormales debido a factores de crecimiento excesivos. La concentración más baja de FBS no puede mantener condiciones saludables para las células.</li>
		<li>Mezclar la solución de suspensión de esferoides y el gel de colágeno de tipo neutralizado I (3 mg/ml) en una proporción de 1:1 en hielo. Utilice una punta de pipeta contundente de 1 ml para evitar la rotura de esferoides. NOTA: Se requiere 1 ml de la solución de gel de colágeno que suspende los esferoides para un pozo de una placa de 24 pocillos. Haga una solución de suspensión mixta adicional si es posible.</li>
		<li>Si es necesario probar las propiedades angiogénicas de cualquier agente o producto químico, transfiera 1 ml de la solución de gel de colágeno que suspende los esferoides en un microtubo de 1 ml y añada los agentes o productos químicos seguidos de una mezcla suave con una punta de pipeta de 1 ml. NOTA: El volumen de agente y producto químico puede sumar 200 ml, lo que diluye la concentración de gel de colágeno tipo I de 1,5 mg/ml a 1,25 mg/ml, pero no afecta a la polimerización de gel de colágeno tipo I. Añade el mismo volumen de vehículo a los esferoides de control.</li>
		<li>Agregue la solución de gel de colágeno que suspende el esferoide en los pozos de una placa precalentada de 24 pocillos (0,9 ml/pozo) mediante pipeteo, y luego incubar durante 30 minutos en una incubadora de cultivo celular para la polimerización. NOTA: Durante el proceso de incrustación de esferoides, no moleste el gel agitando la placa.</li>
		<li>Cubrir el gel de colágeno que suspende el esferoide añadiendo 100 ml de ECGM-MV2 que contiene 2,5% DE FBS con/sin VEGF. Para los esferoides solo ECFC, estimule las células con la adición exógena de VEGF (concentración final de 50 ng/ml) para formar brotes adecuados. Los esferoides ECFC+MSC no requieren estimulación exógena por ningún factor de crecimiento.</li>
		<li>Coloque la placa en una grabadora celular en tiempo real instalada en una incubadora de cultivo celular (37 oC y 5% CO2),y concéntrese aleatoriamente en 5-10 esferoides (10x lente objetivo). Supervise la formación de brotes de cada esferoides etiquetados con fluorescencia cada 1 h durante 24 horas sin ninguna perturbación.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Cantidad de brotes de esferoides
<ol><li>Importe los archivos de imagen al software ImageJ para cuantificar el número de brotes y medir la longitud de cada brote. Para los esferoides de cocultura, etiquete los EFC con un tinte fluorescente verde antes de hacer esferoides. A continuación, mida el número y la longitud de los brotes teñidos con fluorescencia verde(Figura suplementaria 2). Se cuantificaron cinco esferoides seleccionados al azar por grupo experimental. NOTA: Los brotes son estructuras alargadas colaborativamente formadas por varios EFC que se extienden a partir de esferoides. La longitud del brote se mide como la longitud desde el punto de origen de los brotes desde la superficie de los esferoides hasta la punta de los brotes.</li>
	<li>Exprese los valores como medios de SEM de al menos tres experimentos independientes. Determine la diferencia estadísticamente significativa por ANOVA unidireccional para comparaciones múltiples o la prueba tdel estudiante para las comparaciones emparejadas. NOTA: P a 0,05 se considera estadísticamente significativa.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente estudio introduce un sistema de ensayo de angiogénesis in vitro mejorado utilizando esferoides de cocultivo formados por dos progenitores de células vasculares humanas, EFCC y MSC. interacción e incorporación entre células endoteliales y pericítas. En comparación con otros ensayos de angiogénesis in vitro que reflejan sólo la angiogénesis mediada por los CE, este sistema de ensayo de cocultura es más representativo de la cascada multipaso de angiogénesis fisiológica, incluida la interacción celular, la brotac...

Se espera que aproximadamente 500 millones de personas en todo el mundo se beneficien de la terapia moduladora de la angiogénesis para enfermedades asociadas a la malformación vascular, como la artritis reumatoide, la oculopatía, las enfermedades cardiovasculares y la metástasis tumoral1. Por lo tanto, el desarrollo de fármacos que controlan la angiogénesis se ha convertido en un importante área de investigación en la industria farmacéutica. Durante el proceso de desarrollo de fármacos, es necesario estudiar en animales in vivo para explorar los efectos de los candidatos a fármacos en las funciones fisiológicas y las interacciones sistémicas entre los órganos. Sin embargo, las cuestiones éticas y de costos han aumentado las preocupaciones con respecto a los experimentos con animales2. Por lo tanto, se necesitan sistemas de ensayo in vitro mejorados para obtener datos más precisos y predecibles que conduzcan a una mejor toma de decisiones antes de los experimentos con animales. Los ensayos actuales de angiogénesis in vitro suelen medir la proliferación, invasión, migración o formación de estructura tubular de células endoteliales (EC) sembradas en placas de cultivo bidimensionales (2D)3. Estos ensayos de angiogénesis 2D son rápidos, simples, cuantitativos y rentables, y han contribuido significativamente al descubrimiento de fármacos moduladores de angiogénesis. Sin embargo, quedan varias cuestiones por mejorar.
Estos sistemas de ensayo in vitro 2D no pueden reflejar eventos complejos de angiogénesis en varios pasos que se producen en condiciones fisiológicas in vivo, lo que conduce a resultados inexactos que causan discrepancias entre los datos de ensayo in vitro y los resultados de los ensayos clínicos4. Las condiciones de cultivo 2D también inducen el cambio de fenotipos celulares. Por ejemplo, después de la proliferación en placas de cultivo 2D, los ECs tienen un fenotipo celular débil como se manifiesta por la expresión reducida de CD34 y varias señales que rigen las respuestas celulares5,6. Para superar las limitaciones de los sistemas de ensayo de angiogénesis basados en cultivos 2D, se han desarrollado sistemas de ensayo de angiogénesis esferoide tridimensionales (3D). La formación de la estructura tubular a partir de esferoides formados por eCs refleja los procesos de neovascularización in vivo7,8. Por lo tanto, el ensayo de angiogénesis esferoide 3D se ha considerado un sistema de ensayo eficaz para la detección de posibles fármacos pro o anti-angiogénesis.
La mayoría de los ensayos de angiogénesis esferoide 3D utilizan únicamente eCs, principalmente células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) o células endoteliales microvasculares dérmicas humanas (HDMC) para centrarse en la respuesta celular de las EC durante la angiogénesis. Sin embargo, los capilares sanguíneos se componen de dos tipos de células: eCs y pericitas. La elaboración de la interacción bidireccional entre los eCs y los pericitas es fundamental para la correcta integridad y función vascular. Varias enfermedades, como el accidente cerebrovascular hereditario, la retinopatía diabética y la malformación venosa, se asocian con una densidad de pericita alterada o una disminución de la unión pericita al endotelio9. Pericytes también se conocen como un elemento clave del proceso angiogénico. Los pericíticos son reclutados para estabilizar las estructuras de buques recién formados por las CE. En este sentido, el ensayo de angiogénesis esferoide monocultivo no incorpora pericitos7,10. Por lo tanto, los esferoides cocultivoformados por eCs y pericitas pueden proporcionar un enfoque valioso para imitar más estrechamente los eventos angiogénicos fisiológicos.
El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un ensayo de angiogénesis esferoide cocultivo 3D con una combinación de células formadoras de colonias endoteliales humanas (ECFC) y células madre mesenquimales (MSC) para reflejar más de cerca la angiogénesis in vivo. El sistema esferoide de cocultura como un conjunto de representación in vitro de un vaso sanguíneo normal fue establecido por primera vez por Korff et al. en 200111. Combinaron HUVECs y células musculares lisas de la arteria umbilical humana (HMM), y demostraron que el cocultivo de dos células vasculares maduras disminuyó el potencial de brotación. Se sabe que las EC maduras (HUVEC) pierden progresivamente su capacidad de proliferar y diferenciar, lo que afecta negativamente a sus respuestas de angiogénesis12,13. Las células perivasculares maduras (HusMC) pueden causar inactivación de células endoteliales a través de la abrogación de la capacidad de respuesta del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)11. La principal diferencia entre Korff y nuestro sistema de esferoides de cocultura son los tipos de células utilizados. Aplicamos dos precursores vasculares, los FCFC y los MSC, para establecer un sistema de ensayo de angiogénesis adecuado para examinar e investigar agentes pro-o-anti-angiogénicos. Los FCFC son el precursor de las CE. Los FCFC tienen una capacidad de proliferación sólida en comparación con los CEmaduros 14,lo que permite superar la limitación de los CE. Los FCFC contribuyen a la formación de nuevos buques en muchas condiciones fisiopatologías post-natales15,16,17. Los MSC son células madre pluripotentes que tienen la capacidad de diferenciarse en pericitos, contribuyendo así a la angiogénesis18,19.
En informes anteriores, los FCFC y los MSC mostraron efectos sinérgicos en la formación de tubos in vitro20, in vivo neo-vascularización21,22, y mejor reperfusión de tejidos isquémicos23,24. En el presente estudio, los EFCC y los MSC se utilizaron para formar esferoides de cocultura e incrustados en gel de colágeno tipo I para reflejar un entorno 3D in vivo. El colágeno se considera como un componente importante de la matriz extracelular (ECM) que rodea a los CE25. El ECM desempeña un papel crítico en la regulación del comportamiento celular26. El protocolo de ensayo propuesto aquí se puede llevar a cabo fácil y rápidamente en un plazo de dos días utilizando técnicas de laboratorio comunes. Para un seguimiento eficaz de las celdas durante el proceso de brotación, cada tipo de celda se puede etiquetar fluorescentemente y supervisarse mediante una grabadora de celdas en tiempo real. El sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea de cocultivo 3D recientemente establecido está diseñado para aumentar la sensibilidad para evaluar posibles moduladores angiogénicos y proporcionar información predecible antes del estudio in vivo.

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Bevacizumab</td><td>Roche</td><td>NA</td><td>Nombre comercial: Avastin</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbeco (10x)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>PBS (10x)</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbeco (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td>PBS (1x)</td></tr><tr><td>Célula endotelial Medio de crecimiento MV2 kit</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>ECGM-MV2</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Atlas</td><td>FP-0500A</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>BD Sciences</td><td>214340</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&ndash; Penicilina &ndash; Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>GPS</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células madre mesenquimales-2</td><td>Promocell</td><td>C-28009</td><td>MSCGM-2</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kits de enlace de células fluorescentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 PKH67</td></tr><tr><td>Kits de enlace de células fluorescentes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67</td><td>PKH67</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Gel de colágeno tipo I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento endotelial vascular A</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td>VEGF</td></tr></tbody></table>

sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Estudios en el campo de la angiogénesis han ido creciendo agresivamente en las últimas décadas con el reconocimiento de que la angiogénesis es un sello distintivo de más de 50 condiciones patológicas diferentes, como artritis reumatoide, oculopatía, enfermedades cardiovasculares , y metástasis tumoral. Durante el desarrollo de fármacos de angiogénesis, es crucial utilizar sistemas de ensayo in vitro con tipos celulares adecuados y condiciones adecuadas para reflejar el proceso fisiológico de angiogénesis. Para superar las limitaciones de los sistemas actuales de ensayo de angiogénesis in vitro utilizando principalmente células endoteliales, desarrollamos un sistema de ensayo de brote de esferoides de cocultivo tridimensional (3D). Los esferoides de cocultivo fueron producidos por dos precursores de células vasculares humanas, células formadoras de colonias endoteliales (EFC) y células madre mesenquimales (MSC) con una proporción de 5 a 1. Los esferoides ECFCs+MSCs se incrustaron en la matriz de colágeno de tipo I para imitar el entorno extracelular in vivo. Se utilizó un grabador celular en tiempo real para observar continuamente la progresión de la brotación angiogénica de esferoides durante 24 h. La técnica de etiquetado fluorescente de células vivas también se aplicó para tratar la localización de cada tipo de célula durante la formación de brotes. El potencial angiogénico se cuantificó contando el número de brotes y midiendo la longitud acumulada de los brotes generados a partir de los esferoides individuales. Se analizaron cinco esferoides seleccionados al azar por grupo experimental. Los experimentos de comparación demostraron que los esferoides de eCFCs+MSC mostraron un mayor número de brotes y una longitud de brote acumulativa en comparación con los esferoides solo de eFCCs. Bevacizumab, un inhibidor de la angiogénesis aprobado por la FDA, fue probado con el sistema de ensayo esferoide de cocultivo recientemente desarrollado para verificar su potencial para detectar fármacos antiangiogénicos. El valoric 50 para los esferoides de ECFCs+MSC en comparación con los esferoides solo de eFCC sin lugar a la concentración plasmática efectiva de bevacizumab obtenida del modelo de ratón tumor xenoinjerto. El presente estudio sugiere que el sistema de ensayo de angiogénesis esferoidea 3D ECFCs+MSCs es relevante para la angiogénesis fisiológica, y puede predecir una concentración plasmática efectiva antes de experimentos con animales.

Los experimentos de comparación se realizaron utilizando esferoides monocultivos (solo EFCC) y esferoides de cocultura (ECFCs+MSCs) para examinar si los MSC desempeñan un papel considerable en la angiogénesis mediada por los FCFC. La formación de brotes de cada esferoide fue monitoreada durante 24 horas por un grabador celular en tiempo real que podía capturar la progresión de la brotación angiogénica de esferoides. El potencial angiogénico se cuantificó contando el número de brotes y midiendo la longitud acumulada de lo...

El sistema de ensayo de angiogénesis esferoide cocultura tridimensional está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Los esferoides de cocultivo están formados por dos precursores de células vasculares humanas, EFCC y MSC, e incrustados en gel de colágeno. El nuevo sistema es eficaz para evaluar moduladores angiogénicos y proporciona información más relevante al estudio in vivo.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Este sistema esferoide de co-cultivo 3D está diseñado para imitar la angiogénesis fisiológica. Será eficaz para evaluar los moduladores angiogénicos potenciales y proporciona información predecible antes de los estudios in vivo. Este sistema utiliza esferoides de co-cultivo formados por dos células progenitoras vasculares y se puede utilizar para investigar las interacciones celulares, la brotación, y la maduración tubular de la angiogénesis fisiológica.Si podemos utilizar células de pacientes para formar esferoides de co-cultivo, podemos utilizar este sistema para desarrollar tratamientos personalizados para enfermedades anormales relacionadas con la angiogénesis, como el cáncer. Este sistema de ensayo puede aumentar la sensibilidad y la eficiencia de los estudios de angiogénesis y desarrollo de fármacos. Comience por usar 05%trypsin-EDTA para separar los ECFC y los MSC de 80 a 90%cultivos celulares confluentes durante tres o cinco minutos en una incubadora de cultivo celular, respectivamente.Inactivar la trippsina con un medio DMEM completo y pipetear las células varias veces para generar una sola suspensión de células. Recoger las células por centrifugación, seguido de dos lavados con medio libre de suero. Después del segundo lavado, diluir los ECFC a tres veces 10 a las seis células por mililitro de concentración media y los MSC a dos veces 10 a las seis células por milímetro de concentración media en tubos de microcentrífuga individuales de dos mililitros.Pelecila las células por centrifugación, y aspirar cuidadosamente todas menos las últimas 15 a 25 microlitros de sobrenadante de cada muestra de célula. A continuación, resuspender cada pellet en 250 microlitros de diluyente C de un kit de tinte fluorescente, y pipetear suavemente las suspensiones celulares para asegurar una dispersión completa. Añadir 250 microlitros de 20 micromolares PKH67 recién preparados al tubo de ECFC.Añadir 250 microlitros de 12 micromolar PKH26 al tubo de MSC. Mezclar inmediatamente ambas suspensiones celulares. Después de cinco minutos a temperatura ambiente con agitación, protegido de la luz, detenga el proceso de tinción con una incubación de un minuto en 0,5 mililitros de FBS por tubo.Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación, y retirar cuidadosamente el sobrenadante, seguido de dos lavados en dos mililitros de medio fresco completo por lavado. Luego suspenda las células en el medio respectivo en tubos de 15 mililitros. Para la generación de esferoides, después del segundo lavado, primero diluir las suspensiones celulares en la concentración adecuada de medio de crecimiento celular endotelial MV2 complementado con 20%solución de celulosa metilo y 5%concentración sérica bovina fetal.A continuación, agregue cada suspensión celular en un depósito rectangular de poliestireno esterilizado. Utilice una pipeta multicanal para añadir aproximadamente gotas de 125 microlitro de células a la cubierta de una placa de cultivo de 150 milímetros. Cuando se hayan añadido todas las células, invierta la cubierta sobre la parte inferior de un plato que contenga 15 mililitros de PBS, y coloque las placas en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.Al día siguiente, enjuague las cubiertas de los platos con cinco mililitros de PBS en un tubo de 50 mililitros por plato. Enjuague las cubiertas con cinco mililitros adicionales de PBS para recoger los esferoides restantes, y pelete los esferoides por centrifugación. Deseche cuidadosamente todos los últimos 100 a 200 microlitros de sobrenadantes, y toque suavemente en la pared del tubo para que los esferoides se suspendan libremente en el sobrenadante restante.Añadir el volumen adecuado de medio de crecimiento celular endotelial MV2 complementado con 5%suero bovino fetal y 40%solución de celulosa de metilo a cada tubo para resuspender los esferoides a 100 esferoides por mililitro de concentración media. Utilice una punta de pipeta de un mililitro cortada a un diámetro de tres a cinco milímetros para mezclar suavemente las suspensiones de esferoides. Utilice una nueva pipeta de punta ancha de un mililitro para mezclar la solución de suspensión de esferoides con un gel de colágeno neutralizado tipo I en una proporción de uno a uno sobre hielo.Agregue 900 microlitros de cada solución de gel de colágeno que suspenda el esferoides en los recipientes de una placa precalerada de 24 pozos. Permitir que las suspensiones se polimericen durante 30 minutos en la incubadora de cultivo celular, antes de cubrir los esferoides con 100 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales MV2 complementados con 2.5%FBS y 50 nanogramos por mililitro de VEGF a los esferoides solo ECFC y medio complementado con FBS sólo para los cultivos de esferoides MSC y ECFC-plus-MSC. A continuación, coloque cada placa en un grabador celular en tiempo real instalado en una incubadora de cultivo celular, y concéntrese aleatoriamente en cinco a 10 esferoides en un aumento de 10x para monitorear la formación de brotes de cada esferoide con etiqueta de fluorescencia cada hora durante 24 horas.Para cuantificar la brotación del esferoide, importe los archivos de imagen a ImageJ y mida el número y la longitud de los brotes expresando la señal fluorescente adecuada de cinco esferoides seleccionados aleatoriamente por grupo experimental. Para los esferoides ECFC-plus-MSC, el número de brotes y la longitud acumulada del brote son significativamente mayores en comparación con los de los esferoides solo ECFC en todos los puntos de tiempo. Los esferoides solo MSCs no forman brotes, sino que demuestran una migración individual del MSC fuera de los esferoides.El etiquetado de ECFC con tinte verde-fluorescente y MSC con tinte rojo-fluorescente antes de combinarse para generar esferoides ECFC-plus-MSC demuestra que las estructuras de brotes mediados por ECFC están cubiertas con MSC, lo que sugiere que los MSC combinados funcionan como células perivasculares durante la formación de brotes, mejorando la estabilidad y durabilidad del brote mediante la estrecha asociación entre dos células vasculares. Los esferoides ECFC-plus-MSC pretratados con un inhibidor de la angiogénesis muestran una disminución del número de brotes y una longitud acumulada del brote de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control de los esferoides ECFC-plus-MSC. En experimentos paralelos, los esferoides solo ECFC pretratados con el inhibidor seguidos de estimulación con VEGF también demuestran una disminución del número de brotes inducidos por el factor de crecimiento y la longitud acumulada del brote de una manera dependiente de la dosis.Cabe destacar que se necesita una mayor concentración de inhibidores de la angiogénesis para inhibir los esferoides ECFC-plus-MSC en comparación con los esferoides solo ECFC. El crecimiento tumoral se inhibe significativamente en animales tratados con inhibidores de la angiogénesis en dosis altas en comparación con animales tratados con control y animales tratados con inhibidores de la angiogénesis de baja dosis en un modelo de ratón tumoral de xenoinjerto humano. La concentración plasmática de bevacizumab en ratones tratados con dosis altas fue de 568 más o menos 40,62 microgramos por mililitro, que estaba más cerca del valor IC50 de bevacizumab para inhibir la longitud acumulada del brote en esferoides ECFC-plus-MSC en lugar de esferoides solo ECFC.Esto sugiere que el sistema de esferoides de co-cultivo ECFC-plus-MSC es adecuado para predecir concentraciones plasmáticas efectivas antes de un estudio en animales. El uso de una pipeta de punta ancha de un ml para mezclar suavemente los esferoides mientras están en gel de colágeno sobre hielo es importante para proteger la integridad de los esferoides. Podemos modificar este sistema para introducir otros tipos de células como células inmunitarias y otras matrices extracelulares para investigar la interferencia de la matriz celular durante la angiogénesis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

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Aquí, presentamos un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico donde prelabelled las células mesenquimales son cultivadas conjuntamente con redes endotelial derivado de aorta de rata. Este novedoso método permite la visualización de autoguiado hacia el blanco las células estromales mesenquimales (MSCs) y la integración con redes endoteliales, cuantificación de propiedades de red y la evaluación del MSC immunophenotypes y expresión genética.

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Se establece un novedoso modelo de esferoides tridimensional basado en la interacción heterotípica de células tumorales y fibroblastos estromales. Aquí, presentamos cocultivo de células tumorales y fibroblastos estromales, imágenes de lapso de tiempo y microscopía confocal para visualizar la formación de esferoides. Este modelo tridimensional ofrece una plataforma pertinente para estudiar las interacciones tumor-stroma y probar las terapias contra el cáncer.

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Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales (Video) | JoVE Journal

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

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