Name: Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a medir tracciones y tensiones intercelulares en células endoteliales mediante la interrupción mecánica de la connexina 43. Este protocolo integra análisis biomecánico y bioquímico para estudiar procesos fisiopatológicos como metástasis y aterosclerosis.

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Este trabajo fue apoyado por los fondos de la Start-up de la Universidad de Florida Central y el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre del Instituto Nacional de Salud bajo el premio K25HL132098.

1. Fabricación de geles de poliacrilamida (PA)
<ol><li>
Preparación de plato de Petri
	<ol>
<li>Preparar la solución de silano de unión mezclando 200 ml de agua ultrapura con ácido acético de 80 ml y 50 s de metacrilato de propilo de 3(trimetoxisilo). Bind silane es una solución utilizada para funcionalizar la superficie de la placa Petri inferior de vidrio para la fijación de hidrogel.</li>
		<li>Agitar la solución de silano de unión en una placa de agitación durante al menos 1 h.</li>
		<li>Tratar el pozo central de la placa Petri con solución de silano de unión durante 45 min.</li>
		<li>Retire la solución de silano de unión y enjuague la placa Petri con agua ultrapura 2x-3x.</li>
		<li>Seque la superficie del plato Petri y guárdela a temperatura ambiente para su uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la solución de hidrogel
	<ol>
<li>Mezclar agua ultrapura, 40% acrilamida y 2% bis-acrilamida en un tubo centrífugo de 15 ml según la Tabla 1.</li>
		<li>Añadir 80 l de perlas fluorescentes a la solución de hidrogel.</li>
		<li>Agitar suavemente el tubo para mezclar las perlas con la solución de gel.</li>
		<li>Apriete ligeramente la tapa del tubo en el tubo de centrífuga y colóquela en una cámara de vacío.</li>
		<li>Desgasifique la solución de gel durante al menos 45 minutos en cámara de vacío.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polimerización de hidrogel
	<ol>
<li>En primer lugar, añadir 75 l de persulfato de amonio al 10% (disuelto en agua ultrapura) y luego añadir 8 l de TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletano-1,2-diamina) a la solución de hidrogel.</li>
		<li>Colocar 24 l de solución de hidrogel en el centro de la placa Petri (ver Tabla 2).</li>
		<li>Utilice un cubreobjetos de 18 mm para aplanar el hidrogel. Esto dará una altura de 100 m.</li>
		<li>Espere al menos 30-40 min para la polimerización en gel.</li>
		<li>Sumerja el hidrogel polimerizado en agua ultrapura para evitar la deshidratación del gel.</li>
		<li>Cubra el plato Petri con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de cuentas fluorescentes y guárdelo a 4 oC. NOTA: Los hidrogeles se pueden almacenar un período de hasta 3 meses, pero se sugiere que estos geles se utilicen no más de 1 semana después de la fabricación para obtener los mejores resultados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultivo celular
<ol><li>Cultivo de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) en el medio de cultivo celular 200 (ver Tabla de Materiales)complementado con 1% penicilina-estreptomicina en matraces recubiertos de gelatina al 0,1% a 37oC y 5% CO2.</li>
</ol>3. Preparación de la plantilla micropatrón
<ol><li>Curar una fina capa de polidimetilsiloxano (PDMS) en una placa Petri de 100 mm mezclando la base de silicona con el agente de curado de silicona en una proporción de 20:1 (base: agente de curado). NOTA: Es posible utilizar otras relaciones de base a agente de curado (por ejemplo, 10:1 o 30:1). Sin embargo, una relación de base más baja a agente de curado producirá un patrón más rígido, mientras que una relación de base a agente de curado más alta producirá un patrón más suave.</li>
	<li>Prepare una solución PDMS 20:1 (base:agente de curado) y mezcle cuidadosamente en un tubo centrífugo de 50 ml. Invierta el tubo boca abajo y agite vigorosamente varias veces para asegurar una mezcla adecuada de la solución PDMS, ya que la mezcla no uniforme dará como resultado una polimerización incompleta.</li>
	<li>Elimine las burbujas que se han introducido desde el paso anterior centrifugando la solución PDMS durante 1 min a 190 x g.</li>
	<li>Vierta 5-6 ml de la solución PDMS en el centro de una placa Petri de 100 mm y agite el plato hasta que la solución PDMS cubra toda la superficie de la placa Petri.</li>
	<li>Curar la solución PDMS durante la noche a 50-60 oC. PDMS también se puede curar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire una plantilla PDMS circular de 16 mm de diámetro con un perforador de orificios.</li>
	<li>Utilice un punzón de biopsia para crear pequeños agujeros en la galería de símbolos PDMS. Este protocolo utiliza un punzón de biopsia de 1,25 mm de diámetro.</li>
	<li>Sterilice las plantillas PDMS sumergiéndolas primero en etanol al 70% durante 2-3 min, aspirando el exceso de etanol y luego colocándolas bajo una luz UV durante 5 min.</li>
</ol>4. Recubrimiento de hidrogel colágeno-I
<ol><li>Retire el cubreobjetos del hidrogel y aspire cualquier exceso de líquido.</li>
	<li>Coloque la plantilla PDMS sobre la superficie del hidrogel. NOTA: Las pinzas se pueden utilizar para aplicar presión lustral a la plantilla PDMS para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y la superficie del hidrogel. Nuestras plantillas PDMS son herméticas y, por lo tanto, evitan el acceso al agua entre la superficie superior del gel y la superficie inferior de la plantilla PDMS. Además, no es necesario ajustar la rigidez del hidrogel con respecto a la rigidez de PDMS.</li>
	<li>Cubrir la superficie del hidrogel con hexanoato de sulfosuccinimidil-6-(4-azido-2-nitrofenilendamino) (sulfo-SANPAH) disuelto en una solución tampón HEPES de 0,1 M (4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic) a una concentración de 1 : 1000 y colocar bajo un ácido UV UV lámpara (potencia 36 W) durante 8 min.</li>
	<li>Aspirar el exceso de sulfo-SANPAH y HEPES solución y enjuagar el hidrogel dos veces con 0.1 M HEPES seguido de dos enjuagues adicionales con agua ultrapura.</li>
	<li>Aspirar el exceso de agua ultrapura e recubrir los hidrogeles con 0,1 mg/ml de colágeno-I durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Cubrir los platos y proteger las cuentas fluorescentes de fotoblanqueo. NOTA: Las plantillas PDMS se utilizan para crear monocapas micropatrónadas. Las monocapas micropatrónadas se utilizan, ya que permiten observar simultáneamente varias monocapas de la misma geometría y dimensiones durante cada experimento. Sin embargo, si no se desean micropatrones, los pasos anteriores se pueden seguir con la excepción del paso 4.2.</li>
</ol>5. Creación de monocapas HUVEC en hidrogeles
<ol><li>Use 1x trippsina para separar las células de los matraces de cultivo de tejido durante 3-5 minutos en la incubadora.</li>
	<li>Después de la trippsinización, agregue medios de cultivo celular a la solución de tripsina y agregue al tubo centrífugo de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar la solución celular durante 3 min a 1710 x g. Un pequeño pellet blanco de células debe ser visible en la parte inferior del tubo centrífugo.</li>
	<li>Aspirar las células sobrenadantas y resuspender en medios a una concentración de 50 x 104 células/ml.</li>
	<li>Retire el colágeno-I del hidrogel y enjuague 1x con PBS.</li>
	<li>Añadir 75 x 103 células a la parte superior de la plantilla PDMS y permitir que las células se adhieran a la superficie del hidrogel durante al menos 1 h en la incubadora a 37oC y 5%CO2.</li>
	<li>Retire la plantilla PDMS y añada al menos 2 ml de soporte a la placa Petri. Sumerja la plantilla PDMS en 10x trippsina para eliminar las células adheridas y esterilizar rociando con 70% de etanol y luego colocando bajo la luz UV durante 5 min.</li>
	<li>Coloque el plato Petri en la incubadora y espere al menos 36 h o hasta que se observe una monocapa confluente.</li>
</ol>6. Tratamiento de 2,5 dihidroxichalcona para la interrupción de Cx43
<ol><li>Disolver 2,5 dihidroxichalcona (chalcone) en dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución de stock de 0,1875 mg/ml.</li>
	<li>Diluir la solución de stock con medios de cultivo celular para hacer una alícuota baja en concentración de chalcone (0,2 g/ml) y una alícuota de alta concentración de chalcone (2 g/ml).</li>
</ol>7. Adquisición de datos
<ol><li>Localice las islas celulares con un microscopio.</li>
	<li>Adquiera imágenes de contraste de fase y cuentas para la morfología celular de la imagen y los desplazamientos de hidrogel, respectivamente. NOTA: Este protocolo utilizaba un objetivo 10x para la adquisición de datos.</li>
	<li>Al final del experimento, separe las células con 10x trippsina y adquiera una imagen de la superficie de gel sin células (imagen de referencia).</li>
</ol>8. Inmunomanchación
<ol><li>Arreglar monocapas con 4% de formaldehído e incubar a 37oC durante 15 min.</li>
	<li>Retire el 4% de formaldehído y agregue 0.2% Triton X-100 durante 5 min a 37 oC para permeabilizar las células.</li>
	<li>Retire 0.2% Triton X-100 y enjuague monocapas con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Cubrir monocapa con 2% de solución de albúmina sérica bovina (BSA) durante 45 min a 37 oC.</li>
	<li>Retire la solución de BSA al 2% y enjuague las monocapas con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo primario Cx43 a una concentración de 1:400 a la muestra e incubar durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Retire el anticuerpo primario y enjuague la muestra con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Añadir anticuerpo secundario a una concentración de 3:200 e incubar durante 2 h a 37oC. NOTA: Las muestras deben cubrirse para evitar el fotoblanqueo.</li>
	<li>Retire el anticuerpo secundario y enjuague con PBS 2x-3x.</li>
	<li>Cubra la muestra con medio de montaje (Fluromount-G DAPI) y selle con un resbalón de cubierta de 18 mm.</li>
</ol>9. Implementación de microscopía de fuerza de tracción (TFM) y microscopía de tensión monocapa (MSM)
<ol><li>
Cálculo de deformación de hidrogel NOTA: A continuación se muestra un procedimiento de cálculo de desplazamiento paso a paso mediante MATLAB.<ol>
<li>Abra el archivo traction.m principal en MATLAB (para todas las rutinas de MATLAB, consulte Materiales complementarios). NOTA: Siga las instrucciones proporcionadas en el código para establecer el directorio MATLAB.</li>
		<li>Defina las siguientes variables: formato de imagen, conversión de píxel a micra, módulo de Young, relación de Poisson y objetivo del microscopio.</li>
		<li>Busque el cordón, la imagen de trippsina y la imagen de fase mediante la subrutina OpenFiles. NOTA: Para grandes conjuntos de datos, es mejor nombrar archivos en orden secuencial. Por ejemplo, los archivos deben llamarse "filename1.tif", "filename2.tif", etc.</li>
		<li>Defina un ROI cuadrado (región de interés) alrededor de la monocapa de celda y ejecute la subrutina cell_cropper para recortar la imagen original.</li>
		<li>Ejecute la subrutina displacement_finder para calcular los desplazamientos.</li>
		<li>Ejecute la subrutina Dedrift para eliminar cualquier desplazamiento no celular adicional que pueda deberse a la deriva de la etapa del microscopio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cálculo de las tracciones NOTA: Aquí, las tracciones sin restricciones se calculan utilizando nuestra rutina MATLAB personalizada. A continuación se muestra el cálculo de la tracción paso a paso utilizando la rutina de MATLAB mencionada anteriormente.<ol>
<li>Defina las siguientes variables dentro de la rutina traction.m: condición de contorno, espesor de gel, altura del gel y desderivación.</li>
		<li>Ejecute la subrutina traction_finder para calcular las tracciones y ejecute la subrutina plot_traction para trazar las tracciones. Todas las tracciones en dirección x (Tx) y dirección Y (Ty) junto con sus ubicaciones de píxeles correspondientes se pueden encontrar en un archivo traction.dat que será generado por el código.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cálculo de tensiones intercelulares NOTA: A continuación se indican las instrucciones paso a paso para el cálculo de tensión intercelular utilizando la rutina de MATLAB mencionada anteriormente.<ol>
<li>Ejecute la subrutina mark_circular_domain para especificar el límite de monocapa. Esta rutina solicitará todas las imágenes de fase recortadas secuencialmente para que el usuario dibuje manualmente un límite alrededor de la monocapa. Mantenga una nota de los nXPts generados en la ventana de comandos y utilícelos más adelante como parámetros de cuadrícula en el eje X y en el eje Y para el análisis FEM (consulte el paso 9.3.2).</li>
		<li>Ejecute Run_StressCode para calcular las tensiones intercelulares. Esta subrutina lee directamente los parámetros del archivo "model.in" y ejecuta "island.exe" para realizar el análisis FEM. Antes de ejecutar esta rutina, asegúrese de que todos los parámetros del archivo model.in, es decir, los parámetros de cuadrícula en X e Y, la conversión de píxela a micra, el módulo de Young del gel, la relación de Poisson, la altura de la monocapa y el patrón monocapa (tira o agujero), se editan Correctamente.</li>
		<li>Trazar todos los resultados de FEM utilizando la subrutina plot_FEM_results. NOTA: Todos los resultados generados se almacenarán automáticamente en la carpeta Resultados del directorio MATLAB.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soine, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).</li>
<li>Style, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+in+physics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy in physics and biology.</a> Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).</li>
<li>Colin-York, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+%28STFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+stress+reconstitution+from+traction+force+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intercellular stress reconstitution from traction force data.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).</li>
<li>Islam, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Experimental+Methods+of+Cellular+Force+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Journal+of+Science+%26+Technical+Research%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing.</a> Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).</li>
<li>Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear%2C+intercellular+stress%2C+and+endothelial+cell+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).</li>
<li>Trepat, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+forces+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Physical forces during collective cell migration.</a> Nature Physics. 5, 426-430 (2009).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+forces%3A+a+useful+parameter+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research.</a> Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).</li>
<li>Brugues, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial wound healing.</a> Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).</li>
<li>Pasqualini, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of engineered cardiac tissues.</a> PLoS One. 13 (3), e0194706(2018).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+guidance+by+cooperative+intercellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Collective cell guidance by cooperative intercellular forces.</a> Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).</li>
<li>Tambe, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+stress+microscopy%3A+limitations%2C+artifacts%2C+and+accuracy+of+recovered+intercellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses.</a> PLoS One. 8 (2), e55172(2013).</li>
<li>Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).</li>
<li>Hardin, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+stress+transmission+guides+endothelial+gap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-range stress transmission guides endothelial gap formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).</li>
<li>Krishnan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffening+promotes+endothelial+monolayer+disruption+through+enhanced+physical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).</li>
<li>Islam, M. M., Steward, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Endothelial+Cell+Mechanics+through+Connexin+43+Disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption.</a> Experimental Mechanics. 59, 327(2019).</li>
<li>Figueroa, X. F., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+the+control+of+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in the control of vascular function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sohl, G., Willecke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+and+the+connexin+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gap junctions and the connexin protein family.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).</li>
<li>Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+connexins+to+the+function+of+the+vascular+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Contribution of connexins to the function of the vascular wall.</a> Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).</li>
<li>Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+phosphorylation+in+brain%2C+cardiac%2C+endothelial+and+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).</li>
<li>Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+knockout+of+connexin+43+causes+hypotension+and+bradycardia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).</li>
<li>Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin43+deficiency+causes+dysregulation+of+coronary+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis.</a> Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).</li>
<li>Lee, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C5%27-Dihydroxychalcone+down-regulates+endothelial+connexin43+gap+junctions+and+affects+MAP+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation.</a> Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).</li>
<li>Bazellieres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).</li>
<li>Nam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+cytotoxicity+of+2%2C5-dihydroxychalcones+and+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds.</a> Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro grupo, así como otros, ha estado utilizando con éxito TFM y MSM para sondear la influenciade las uniones celulares en diversos procesos celulares patológicos y fisiológicos in vitro7,15,18,27 . Por ejemplo, Hardin et al. presentaron un estudio muy perspicaz que sugiere que la transmisión de tensión intercelular guía la formación de brechas paracelulares en las células endoteliales<sup c...

El campo que se refiere al estudio de los efectos de las fuerzas físicas y de las propiedades mecánicas en la fisiología celular y tisular y la patología se conoce como mecanobiología1. Algunas técnicas útiles que se han utilizado en la mecanobiología son la microscopía de tensión monocapa y la microscopía de fuerza de tracción. La microscopía de fuerza de tracción permite el cálculo de las tracciones generadas en la interfaz célula-sustrato, mientras que la microscopía de tensión monocapa permite el cálculo de tensiones intercelulares generadas entre células adyacentes dentro de una monocapa2 ,3,4,5,6. Los resultados obtenidos de métodos anteriores han sugerido que las tensiones mecánicas derivadas de células desempeñan un papel crucial en la determinación del destino de una serie de procesos celulares3,4,5. Por ejemplo, al exponerse a una fuerza mecánica externa, un grupo de células que migran como colectivo puede alterar su morfología y polarizar su forma para alinear y migrar a lo largo de la dirección de la fuerza aplicada, en parte, generando tracción7, 8. Las tracciones proporcionan una métrica que se puede utilizar para evaluar la contractilidad celular y se calculan mediante microscopía de fuerza de tracción (TFM). La microscopía de fuerza de tracción (TFM) comienza con la determinación de deformaciones de sustrato inducidas por células seguidas por el cálculo del campo de tracción utilizando un enfoque computacional matemáticamente riguroso y basado en la mecánica. Dado que la capacidad de calcular las tracciones ha existido durante bastante tiempo, los investigadores han utilizado TFM para revelar el impacto que las tracciones tienen en una serie de procesos, incluyendo el cáncer9,la cicatrización de heridas10 y la evaluación de tejido11.
La implementación de TFM y MSM juntos se puede dividir en tres pasos esenciales que deben ejecutarse en el siguiente orden: primero, se determinan las deformaciones de hidrogel producidas por las células; en segundo lugar, las tracciones se recuperan de las deformaciones de hidrogel; y en tercer lugar, se utiliza un enfoque de elementos finitos para calcular tensiones intercelulares normales y cortantes dentro de toda la monocapa. Para calcular los desplazamientos de gel, las imágenes de perlas de fluorescencia con células se compararon con la imagen del cordón de referencia (sin celdas) mediante una rutina de velocimetría de imagen de partículas (PIV) escrita a medida. El tamaño de la ventana de correlación cruzada y la superposición para el análisis PIV se eligieron para ser de 32 x 32 píxeles y 0,5, respectivamente. En este momento, los cambios de píxeles se convirtieron en micras multiplicando con un factor de conversión de píxel a micra (para nuestro microscopio, este factor de conversión es 0,65) para obtener desplazamientos en el plano. Los errores asociados con ignorar desplazamientos fuera del plano son insignificantes12,13. Después del cálculo de los desplazamientos de gel, hay dos tipos de mediciones de tracción que se pueden utilizar, tracciones restringidas y tracciones sin restricciones8,14. Las tracciones sin restricciones proporcionan el campo de tracción para todo el campo de visión (incluidas las regiones con y sin celdas), mientras que las tracciones restringidas proporcionan el campo de tracción solo para las regiones que incluyen las celdas14. A continuación, las tensiones intercelulares se calculan mediante microscopía de tensión monocapa (MSM), que es una extensión de la microscopía de fuerza de tracción. La implementación de MSM se basa en la suposición de que las tracciones locales ejercidas por una monocapa de células en la interfaz célula-sustrato deben equilibrarse mediante fuerzas mecánicas transmitidas entre células en la interfaz de células celulares según lo exigido por las leyes 7 de Newton ,12,13. Una suposición clave aquí es que la monocapa de celda se puede tratar como una hoja elástica delgada porque se conoce la distribución de tracción en la monocapa y el equilibrio de fuerza no depende de las propiedades del material celular. Otra suposición clave es que las fuerzas de tracción están equilibradas por tensiones intercelulares locales dentro del campo de visión óptico (dentro de la monocapa) y la influencia de este equilibrio de fuerza es mínima en la región distal (fuera de la monocapa)13. Por lo tanto, las condiciones límite definidas por tensiones intercelulares, desplazamientos o una combinación de ambos en el límite monocapa son cruciales para realizar MSM13. Teniendo en cuenta la información anterior, utilizamos MSM para realizar un análisis de elementos finitos (FEM) para recuperar la tensión principal máxima(máx.)y la tensión principal mínima(min)girando el plano de tensión en cada punto dentro del Monocapa. Estas tensiones principales se utilizan posteriormente para calcular la tensión intercelular normal promedio 2D [((max + ?min) /2] y la tensión intercelular de cizallamiento máxima 2D [(máx. -min) /2] dentro de toda la monocapa 12,13. Este procedimiento es descrito con más detalle por Tambe et al.12,13
La microscopía de tensión monocapa (MSM) permite el cálculo de tensiones intercelulares de células celulares generadas dentro de una monocapa6,7,8,12,13. Estas tensiones intercelulares se han sugerido para ser importantes para el crecimiento y reparación de tejidos, cicatrización de heridas, y metástasis de cáncer12,15,16,17. Además, se ha sugerido que las tensiones intercelulares también son importantes en la migración de células endoteliales y la función de barrera endotelial17,18. Mientras que las uniones de células celulares tales como uniones estrechas y uniones adheridas han sido sugeridas para desempeñar un papel crítico en la generación y transmisión de estrés intercelular endotelial, el papel de las uniones de separación sigue siendo esquivo. Las uniones de brecha conectan físicamente las células adyacentes y proporcionan una vía para que la corriente eléctrica y las moléculas (<1 KDa) pasen entre las células vecinas19,20,21. Aunque las células endoteliales expresan las uniones de brecha Cx37, Cx40 y Cx4319,22, Cx43 es posiblemente la más importante en términos de progresión de la enfermedad23. La evidencia de la importancia de Cx43 se puede encontrar en el hecho de que la eliminación genética de Cx43 en ratones resulta en hipotensión24 y tiene efectos adversos sobre la angiogénesis25. Además, se ha documentado que Cx43 es importante para la migración y proliferación celular y para la progresión de la aterosclerosis18,22,23,24,25 .
En este protocolo, utilizamos TFM y MSM para investigar si la tracción y la generación de tensión intercelular dentro del confluente, monocapa endotelial se vería afectada por la interrupción de la unión de brecha endotelial Cx43. Interrumpimos Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molécula documentada para inhibir cx43 expresión26. Chalcone se utilizó para interrumpir Cx43 en lugar de siRNA como chalcone ha sido reportado previamente por Lee y otros para interrumpir la expresión26de Cx43. Además, estábamos particularmente interesados en la influencia de chalcone en el endotelio, ya que también se ha informado de que es un compuesto antiinflamatorio y antiplaquetario que potencialmente se puede utilizar para la prevención y el tratamiento de varios vasculares patologías26. Los tratamientos de Chalcone se realizaron una hora después del inicio del experimento, se tomaron imágenes monocapas tratadas con chalcone durante un total de seis horas, y el procesamiento de imágenes se realizó con un código MATLAB escrito a medida para determinar las tracciones y, posteriormente, intercelulares Tensiones. Nuestros resultados mostraron una disminución general en las tracciones y tensiones intercelulares, lo que sugiere que Cx43 desempeña un papel clave en la biomecánica endotelial.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de 18 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>18CIR-1</td><td>Esencial para aplanar geles de poliacrilamida</td></tr><tr><td>2% bis-acrilamida</td><td>BIO-RAD</td><td>1610143</td><td>Componente de gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>2&prime;,5&prime;-Dihidroxichalcona</td><td>SIGMA</td><td>IDF00046</td><td>Para alterar la estructura Cx43</td></tr><tr><td>Metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo</td><td>SIGMA</td><td>2530-85-0</td><td>Solución madre para hacer una mezcla de silano aglutinante con ácido acético y agua ultrapura</td></tr><tr><td>40% Acrilamida</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>1610140 Componente del gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>64-19-7</td><td>Esencial para hacer solución salina aglutinante</td></tr><tr><td>Alexa Fluro 488 cabra anti-ratón IgG;</td><td>ThermoFisher</td><td>Catálogo # A-11001</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>BIO-RAD</td><td>1610700</td><td>Agente polimerizante en gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>9048-46-8</td><td>Para hacer solución bloqueante</td></tr><tr><td>Solución de atelocolágeno bovino tipo I, 3 mg/mL, 100 mL</td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005-100ML</td><td>Uso como matriz</td></tr> <tr><td>extracelularSolución salina tamponada con fosfato para cultivo celular de Corning (1x)</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>21040CV</td><td>Solución salina tampón necesaria para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, Fisher BioReactivos</td><td>Fisher-Sceintific</td><td>67-68-5</td><td>Para disolver el chalcona y hacer una solución madre</td></tr><tr><td>Fluoromount-G con DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4959-52 Medio de</td><td>montaje para inmunostaing utilizado para teñir para DAPI</td></tr><tr><td>Microesfera fluroscente Perlas modificadas con carboxilato</td><td>ThermoFisher</td><td>F8812</td><td>Perlas modificadas con carboxilato de 0,5 micras (rojo), 2% de sólidos</td></tr><tr><td>Solución tampón HEPES 1 M</td><td>SIGMA</td><td>7365-45-9</td><td>Esencial para</td></tr><tr><td>LVES</td><td>ThermoFisher</td><td>A1460801</td><td>Esencial Suplemento HUEVC media 200</td></tr><tr><td>Medio 200</td><td>ThermoFisher</td><td>M200500</td><td>Medios esenciales para el cultivo</td></tr> <tr><td>celular HUVECAnticuerpo monoclonal Cx43 de ratón (CX - 1B1)</td><td>ThermoFisher</td><td>Catálogo #13-8300</td><td>Anticuerpo primario para placa de Petri Cx43</td></tr><tr><td>(35 mm de diámetro)</td><td>CellVis</td><td>D35-20-1.5H Placa de</td><td>Petri de 35 mm con un pocillo central de 20 mm</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg</td><td>Proteochem</td><td>102568-43-4</td><td>Esencial para funcionalizar la superficie de gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>DOW corning</td><td>2646340</td><td>Elastómero de silicio con agente de curado para hacer PDMS</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1610801 <td>Agente polimerizante en gel de poliacrilamida</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>9002-93-1</td><td>Para permeabilizar las células Tripsina</td></tr><tr><td>-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td>Se utiliza para separar células</td></tr></tbody></table>

biomecánica endotelial perturbando a través de connexin 43 interrupción estructural

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Las células endoteliales se han establecido para generar tensiones y tracción intercelulares, pero actualmente se desconoce el papel que desempeñan las uniones de brecha en la generación de tensión y tracción intercelular endotelial. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo basado en la mecánica para sondear la influencia de la unión de brecha connexina 43 (Cx43) tiene en la biomecánica endotelial mediante la exposición de monocapas endoteliales confluentes a un conocido inhibidor Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) y medir el impacto que este inhibidor tiene en las tracciones y tensiones intercelulares. Presentamos resultados representativos, que muestran una disminución en las tracciones y tensiones intercelulares bajo una dosis alta de chalcone (2 g/ml) en comparación con el control. Este protocolo se puede aplicar no sólo a Cx43, sino también a otros cruces de separación, suponiendo que se utilice el inhibidor adecuado. Creemos que este protocolo será útil en los campos de la investigación cardiovascular y mecanobiología.

Las imágenes de contraste de fase de control, 0,2 g/ml y 2 monocapas tratadas con chalcono de g/ml se tomaron 30 minutos antes del tratamiento con chalcone(Figura 1A-C)y 2 horas después del tratamiento con chalcone(Figura 1D-F). Se observó que los desplazamientos de perlas inducidos por células (m) disminuyeron tanto en condiciones de chalcona de dosis baja como de alta dosis de chalcona<strong c...

Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.

Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

Este protocolo es significativo, ya que permite el esclarecido del papel que desempeñan las fuerzas celulares en muchos procesos fisiológicos y patológicos, como la cicatrización de heridas y las metástasis del cáncer, por ejemplo. La principal ventaja de esta técnica basada en la mecánica es su capacidad para interrumpir simultáneamente las uniones de células celulares y medir su impacto en las fuerzas mecánicas generadas por células, principalmente tracción y factores de estrés intercelulares. Nuestro protocolo es aplicable a una amplia gama de procesos fisiopatológicos, como metástasis de cáncer, aterosclerosas e hipertensión, por ejemplo.Nuestros métodos se pueden integrar para realizar análisis bioquímicos y biomecánicos con modelos de órgano en chip, construcciones de tejidos bio-ingeniería, sistemas de administración de fármacos in vitro y sistemas de cultivo de tejidos. Nuestro protocolo es bastante sencillo de realizar. Sin embargo, aconsejamos a aquellos que hacen este protocolo por primera vez que tengan paciencia y no se apresuren a través de los pasos de este protocolo.Nuestro protocolo tiene pasos únicos que pueden no ser claros para los usuarios por primera vez. Por lo tanto, animamos a los usuarios a seguir nuestros procedimientos paso a paso escritos y usar demostraciones visuales como guía. Para empezar, prepare la solución de cido-siano ciego mezclando 200 mililitros de agua ultra pura con 80 microlitros de ácido acético y 50 microlitros de metacrilato de silano.Revuelva la solución de Bind-silane en una placa de agitación durante al menos una hora. Trate bien el centro de un plato de Petri con la solución Bind-silane durante 45 minutos. Retire la solución de Bind-silane y enjuague el plato Petri con agua ultra pura de dos a tres veces.Seque la superficie de la placa Petri y guárdela a temperatura ambiente para su uso futuro. Para preparar la solución de hidrogel, mezcle 12,49 mililitros de agua ultra pura a 2,062 mililitros de 40% de acrilamida y 375 microlitros de 2% bisacrilamida en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Añadir 80 microlitros de perlas fluorescentes a la solución de hidrogel.Agitar suavemente el tubo para mezclar las perlas con la solución de gel. Mantenga la tapa suelta en el tubo de la centrífuga y colóquela en una cámara de vacío. Desa gasear la solución de gel durante al menos 45 minutos en la cámara de vacío.Para polimerizar el hidrogel, primero agregue 75 microlitros de 10% persulfo de amonio y luego agregue ocho microlitros de TEMED a la solución de hidrogel. Coloque 24 microlitros de la solución de hidrogel en el centro de la placa Petri. Presione sobre el hidrogel con un resbalón de cubierta de 18 milímetros para aplanar el hidrogel y hacer una altura de aproximadamente 100 micrómetros.Espere al menos de 30 a 40 minutos para la polimerización de gel. Sumerja el hidrogel polimerizado en agua ultra pura para evitar la deshidratación del gel. Cubra el plato Petri con papel de aluminio para evitar el fotoblanda de cuentas fluorescentes y guárdelo a cuatro grados centígrados.En primer lugar, mezcle la base de silicona PDMS con el agente de curado de silicona en una proporción de 20 a uno en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Invierta el tubo boca abajo y agite vigorosamente varias veces para garantizar una mezcla adecuada de la solución PDMS. Retire las burbujas de la solución PDMS centrifugando durante un minuto a 190 veces G.Pour cinco a seis mililitros de la solución PDMS en el centro de un plato Petri de 100 milímetros y agitar el plato hasta que la solución PDMS cubra toda la superficie de la placa Petri.Cure la solución PDMS durante la noche a 50 a 60 grados centígrados. A continuación, elimine una plantilla blanca PDMS de 16 milímetros de diámetro con un perforador. Utilice un punzón de biopsia de 1,25 milímetros de diámetro para crear pequeños agujeros en la plantilla PDMS.Esterilice las plantillas de PDMS sumergiéndolas en un 70% de etanol durante dos o tres minutos, aspirando el exceso de etanol y luego colocándolas bajo una luz UV durante cinco minutos. Aspirar cualquier exceso de líquido y retirar el resbalón de la cubierta del hidrogel. Coloque la plantilla PDMS en la superficie del hidrogel y utilice pinzas para aplicar presión ligera a la plantilla PDMS para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y la superficie del hidrogel.Cubra la superficie del hidrogel con Sulfo-SAMPA disuelto en una solución tampón HEPES molar 0.1 a una concentración de uno a 1.000 y coloque el hidrogel bajo una lámpara UV con una potencia de 36 vatios durante ocho minutos. Aspirar el exceso de solución de Sulfo-SAMPA y HEPES y enjuagar el hidrogel dos veces con 0,1 HEPES molar seguido de dos enjuagues adicionales con agua ultra pura. Aspirar el exceso de agua ultra pura y utilizar una pipeta de 200 microlitros para recubrir el hidrogel con 0,1 miligramos por mililitro de colágeno-1.Cubra el plato para proteger las cuentas fluorescentes de la fotoblancada y almacene el hidrogel a cuatro grados centígrados durante la noche. Ahora, agregue tres mililitros de 1X de tripsina en el matraz y colóquelo en la incubadora a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos para separar las células del matraz de cultivo de tejido. Después de la tripinación, agregue tres mililitros de medios de cultivo celular en el matraz, gire para mezclar y transfiera la mezcla a un tubo centrífugo de 15 mililitros.Centrifugar la solución celular durante tres minutos a 1, 710 veces G.Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en medios a una concentración de 50 veces 10 a las cuatro células por mililitro. Saca el plato de hidrogel del refrigerador. Retire el colágeno-1 del hidrogel y enjuague una vez con PBS.Agregue 75 veces 10 a las terceras celdas a la parte superior de la plantilla PDMS y permita que las células se adhieran a la superficie del hidrogel durante al menos una hora en la incubadora a 37 grados Centígrados y 5% dióxido de carbono. Quite la galería de símbolos de PDMS y sumerja la galería de símbolos de PDMS en 10X Trypsin durante 10 a 15 segundos para eliminar las celdas conectadas. Agregue al menos dos mililitros de medios a la placa Petri y esterilizar la plantilla rociando con 70% de etanol, y luego colocándolo debajo de la luz UV durante cinco minutos.Coloque el plato Petri en la incubadora durante al menos 36 horas, o hasta que se observe una monocapa confluente. Se compararon imágenes de contraste de fase de 30 minutos antes del tratamiento con chalcona y dos horas después del tratamiento con chalcona. Se observó que los desplazamientos de perlas inducidos por células disminuyen tanto en condiciones de chalcona en dosis bajas como en condiciones de chalcono en dosis altas en comparación con el control de las monocapas de HUVEC.Antes del tratamiento con chalcona, las tracciones RMS eran alrededor de 51 Pascals para todas las condiciones. Después del tratamiento con chalcona, hubo un pequeño aumento en las tracciones RMS a 59 Pascals en monocapas tratadas con chalcona en dosis bajas y una disminución casi doble en las tracciones RMS a 18 Pascals en monocapas tratadas con chalcono en dosis altas en comparación con el control. El tratamiento con Chalcone aumentó la magnitud media del estrés intercelular normal con dosis bajas, pero disminuyó significativamente la magnitud media de tensión intercelular normal con dosis altas en comparación con el control.El tratamiento con chalcona también disminuyó las tensiones intercelulares escuetas máximas a baja y alta concentración de chalcona en comparación con el control. El impacto del tratamiento con chalcona es estadísticamente significativo basado en pruebas T y pruebas ANOVA de factor único. Al colocar la plantilla PDMS encima del gel, asegúrese de que el gel esté lo suficientemente seco como para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y el gel.Este protocolo también se puede aplicar para sondear la contribución biomecánica de una variedad de uniones de células celulares, proteínas citoesqueléticas, moléculas de adhesión de matriz celular o moléculas extracelulares con imágenes vivas. Con este protocolo in vitro, los investigadores ahora pueden investigar con éxito una serie de propiedades biomecánicas, así como bioquímicas durante la reparación de tejidos, la cicatrización de heridas o las metástasis de cáncer sin modelo animal. Aconsejamos a nuestros espectadores a ser muy cuidadosos durante el manejo de chalcone y DMSO como inhalación de estos medicamentos se divulga para ser perjudicial.

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Research

Investigación

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