Name: Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Aprende a generar linfocitos T CD8+ específicos de VHB a partir de células iPSC para suprimir la replicación viral en ratones mediante transferencia adoptiva de células.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen al Dr. Adam J Gehring del Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto por proporcionar ADNc para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- genes TCR híbridos humano-murinos específicos restringidos en A2, y el Dr. Pei-Jer Chen de la Universidad Nacional de Taiwán para proporcionar construcción pAAV/HBV 1.2. Este trabajo es apoyado por el Instituto Nacional de Salud Grant R01AI121180, R01CA221867 y R21AI109239 a J. S.

Todos los experimentos con animales son aprobados por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Texas A&M (IACUC; #2018-0006) y se llevan a cabo de conformidad con las directrices de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. Los ratones se utilizan durante 6-9 semanas de edad.
1. Generación de células virales CP8+ T específicas de ag a partir de iPSC (células iPSC-CD8+ T)
<ol><li>Creación de las construcciones retrovirales NOTA: Los genes TCR y TCR están vinculados con la secuencia de autocorte 2A. El vector retroviral MSCV-IRES-DsRed (MiDR) es DsRed+ 23.<ol>
<li>Subclone HBs183-191 (FLLTRILTI) específicoS A2-murine híbrido sortino genes TCR (s183 TCR) (V-34 y V-28) en el MiDR para crear la construcción de MiDR s183(Figura 1A)25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transducción retroviral NOTA: Las células Platinum-E (Plat-E) se utilizan para empaquetar retrovirus (que transportan genes TCR s183), que se utilizarán para la transducción retroviral. Las células Plat-E son una célula de envasado retrovirus eficaz subyacente a las células 293T, que se desarrollaron mediante construcciones de envases únicas a través del promotor EF1 para expresar proteína de estructura retroviral, incluyendo gag, pol y ecotrópico env.<ol>
<li>En un plato de cultivo de 100 mm, semilla3 x 106 células Plat-E en 8 ml de medio de cultivo DMEM que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS) en una incubadora a 37 oC con 5% co2,1 día antes de la transfección.</li>
		<li>En el día 0, transfectar la construcción s183 MiDR en las células Plat-E utilizando un reactivo de transfección de ADN25.</li>
		<li>En el día 1, semilla 1 x 106 iPSCs (GFP+) en una placa de cultivo pre-revestida de gelatina.</li>
		<li>Los días 2–3, recopile el sobrenadante que contiene retrovirus del cultivo celular Plat-E para transducir los iPSC con el TCR s183 en presencia de 1,6-dibromohexane solución25.</li>
		<li>En el día 4, pruebe los ISPC transducidos por el gen TCR s183, centrífuga a 400 x g durante 5 min y las semillas 3 x 105 iPSC en una placa de cultivo de 100 mm precubierta con 3 x 106 irradiadas SNL76/7 (irSNL76/7) células alimentadoras25.</li>
		<li>En el día 5 o 6 de la confluencia, trippsinizar las células, centrifugar a 400 x g durante 5 min y proceso para la clasificación celular. La ampliación de células vivas, ordenar las células dobles positivas GFP y DsRED (los iPSC transducidos por el gen TCR s183) utilizando un clasificador celular de alta velocidad. Similar al paso 1.2.5, co-cultivo de las células ordenadas en las células de alimentación irSNL76/7 para uso futuro25.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación de células iPSC-CD8+ T específicas del VHB NOTA: Las células estromales OP9-DL1/DL4 sobreexpresan tanto los ligandos de notch DL1 y DL4, como los iPSC co-cultivadores con los iPSC pueden promover la diferenciación de células T mediada por la señalización de notch26.<ol>
<li>Cultivar iPSC transducidos por genes TCR s183 (s183/iPSC) en la monocapa celular OP9-DL1-DL4 en medios de medio esencial mínimo (MEM) que contengan un 20% de suero bovino fetal (FBS)27. Incluir ligando murine Flt3 (mFlt-3L; concentración final a 5 ng/mL) en el cultivo.</li>
		<li>En el día 0, semilla 0.5–1.0 x 105 S183/iPSCs en un plato de cultivo de 10 cm previamente cultivado con células OP9-DL1-DL4. Valide que las células OP9-DL1-DL4 están en una condición de 80%–90% de confluencia.</li>
		<li>En el día 5, enjuague los isPC con 10 ml de solución salina con fosfato (PBS), aspirar fuera del PBS, añadir esto a 4 ml de 0,25% de trippsina, e incubar en una incubadora de 37 oC durante 10 minutos después, añadir un suplemento de 8 ml de medios iPSC para poner fin a la digestión de la trippsina. Acumular todas las soluciones digestivas que contienen las células y centrifugar a 400 x g durante 5 min a 15–30 oC.</li>
		<li>Aspirar las células sobrenadant asindrantes y resuspender en 10 ml de medios iPSC. Transfiera la suspensión celular a una nueva placa Petri de 10 cm e incubar en una incubadora durante 30 min a 37 oC.</li>
		<li>Después de 30 min, recoja el medio iPSC que contiene las celdas flotantes. Pasar la suspensión celular a través de un colador de células de 70 m y calcular el número de celda.</li>
		<li>Semilla5 x 105 células en el plato de cultivo previamente cultivado OP9-DL1-DL4 células con una condición de 80% –90% confluente como se describe en el paso 1.3.1. NOTA: Para la diferenciación de células T, cada 2-3 días, las celdas derivadas de iPSC necesitan volver a sembrar con una capa nueva de las células OP9-DL1-DL4.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación<ol>
<li>Cambios morfológicos de iPSC diferenciadores<ol>
<li>Observe las células bajo un microscopio en varios días. NOTA: Para el día 5, las colonias tienen características similares a los mesodermos, exhibiendo una morfología clásica en forma de husillo que se asemeja a los fibroblastos dérmicos humanos y el crecimiento sostenido in vitro. Para el día 8, comienzan a aparecer pequeños grupos redondos de células.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análisis de la diferenciación de iPSC según la citometría de flujo<ol>
<li>En varios días de cocultivo, analice las celdas derivadas de iPSC como se describió anteriormente25 (Figura 1B,C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análisis funcional de iPSC diferenciadores<ol>
<li>En el día 28 de co-cultivo, recoger células iPSC-CD8+ T de cultivos a través de la cosecha de las células flotantes, trippsinizar las células sobrante con 0.25% de trippsina, volver a suspender en 8 mL de medios iPSC, centrifugar durante 5 min a 400 x g a 15-30 oC, eliminar los medios, luego resuspender las células en 10 mL de medios.</li>
			<li>Conservar las células resuspendidas en un plato fresco de 10 cm en una incubadora de 37 oC durante 30 minutos y ensamblar las celdas flotantes. Luego enjuague las células una vez con un PBS frío.</li>
			<li>Incubar 3 x 106 t de abetocitos cargados con células (CD4-CD8-) a partir de bazos de H-2 clase I knockout, ratones HLA-A2.1-transgénicos (HHD) con péptido de 5 m s183 (FLLTRILTI) en 200 oL de medios a 4 oC durante 30 min.</li>
			<li>Producir una mezcla de células iPSC-CD8+ T con esplenocitos pulsados con péptido s183 (células T: esplenocitos a 1:4; utilizar 0,75 x 106 células T). Incubar la mezcla de células a 37oC en una incubadora deCO2 durante 40 h. Durante las últimas 7 h, añadir 4 l de brefeldina A diluida en el cultivo (concentración final de 1.000x, que se diluirá en 1x medios de cultivo) para bloquear los procesos de transporte durante la activación celular.</li>
			<li>Manchar las células y realizar el análisis citométrico de flujo de IFN intracelular como se describió anteriormente(Figura 2).</li>
		</ol>

</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Inducción de la replicación del VHB a través de la entrega hidrodinámica de plásmido del VHB
NOTA: la construcción pAAV/HBV1.2 se generó como se describió anteriormente9. El ADN completo del VHB 1.2 se incorpora en el pAAV vectorial.
<ol><li>Entregas hidrodinámicas de plásmido del VHB a través de la vena de la cola<ol>
<li>Caliente los ratones HHD usando una lámpara de calor durante 5 minutos en la jaula con el fin de dilatar la vena de la cola.</li>
		<li>Deten al animal por medio de un restrainer, y limpie las colas de ratón con 70% de pulverización de etanol.</li>
		<li>Entrega de plásmido en el hígado.</li>
		<li>Mida el peso corporal del ratón utilizando una báscula de medición.</li>
		<li>Diluir 10 g de plásmido de VHB en el 8% equivalente de pbS de masa corporal (por ejemplo, 1,6 ml para un ratón de 20 g). Cargue el plásmido diluido en una jeringa de 3 ml con una aguja hipodérmica de 26 Ga 1" (0,45 x 12 mm).</li>
		<li>Localice una de las dos venas laterales de la cola en el tercio medio de la cola y coloque la aguja en cualquiera de las venas laterales. Administrar la inyección que contiene plásmido del VHB a través de la vena de la cola dentro de 3 - 5 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación de la viremia a partir del suero sanguíneo de ratones infectados NOTA: La replicación del VHB se produce del día 3 al 35 en el suero del ratón. La replicación del ADN alcanza su punto máximo en el día 7 y se reduce gradualmente. El ADN del VHB no se elimina del suero hasta el día 35.<ol>
<li>Recolección de suero sanguíneo de ratones infectados<ol>
<li>Recoger aproximadamente 0,1 ml de sangre en un tubo de microcentrífuga de cada ratón en 3, 5, 7 y 10 días después de la infección por sangrado retroorbital en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, luego incubar a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos.</li>
			<li>Centrifugar la muestra a 6.000 x g durante 15 min a 4oC y recoger el sobrenadante sérico después de la centrifugación.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Purificar el ADN del suero sanguíneo utilizando un kit de extracción de ADN disponible comercialmente siguiendo las recomendaciones del fabricante. Brevemente, lijar las células en una columna basada en sílice, realizar los lavados, y extraer ADN mediante la adición de 100% etanol a la columna de elución y centrifugación a 6000 x g durante 1 min. Elute el ADN en 50 l de agua libre de RNase.</li>
		<li>Utilice 100 ng de ADN del VHB de la elución para el análisis de PCR en tiempo real. Utilice las siguientes imprimaciones y sondas: forward 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; reverso 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; sonda 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.<ol>
<li>Utilice el genoma del VHB que contiene plásmido (pAAV/HBV1.2) para la curva estándar y realice PCR en tiempo real en un volumen total de 10 ml(Figura 3).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Configure la reacción de PCR en un volumen total de 10 l como se muestra en la Tabla 1.</li>
		<li>Configure el programa PCR en el termociclador como se muestra en la Tabla 2. La velocidad de transición de la temperatura programada es de 20 oC/s para la desnaturalización/recocido y de 5 oC/s para la extensión. Mida la fluorescencia al final de la fase de recocido para cada ciclo para la supervisión de PCR en tiempo real.</li>
	</ol>

</li>
</ol>3. Reducción de la replicación del VHB por ACT de células virales iPSC-CD8+ T específicas de Ag
<ol><li>Transferencia de celda adoptiva (ACT)<ol>
<li>Diferencie s183/iPSCs (1.3.7) sobre las células estromales OP9-DL1-DL4 en presencia de mFlt-3L y mIL-7 durante 8 días como se describe en la sección 1.3.</li>
		<li>En el día 22, recoger las células iPSC-CD8+ T de la placa de 10 cm con trippsina, luego lavar y resuspender cada placa de 10 cm en 10 ml de medios frescos. Agregue las células a una placa fresca de 10 cm y vuelva a la incubadora durante 30 minutos como se hace en la sección 1.3. Después de 30 min, recoja las celdas flotantes.</li>
		<li>Utilice un colador de nylon de 70 m para pasar celdas para eliminar los cúmulos de células y contar el número de celda. Adapte las células a una concentración de 1,5 x 107 células/ml en solución de PBS fría y utilice un colador de nylon de 70 m para pasar las células para eliminar los racimos celulares de nuevo si es necesario. Mantenga las células en hielo hasta el ACT.</li>
		<li>Inyectar la suspensión celular de 200 l (3 x 106 células) en ratones hEH de 4 a 6 semanas de edad a través de la vena de la cola.</li>
	</ol></li>
	<li>Inducción de la replicación del VHB<ol>
<li>El día 14 después de la transferencia celular, realice la entrega hidrodinámica de plásmido del VHB a través de la vena de la cola como se describe en la sección 2.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de proteínas de virus del hígado infectado<ol>
<li>Sacrificar ratones en los días 3, 5, 7, 14 y 21 después de la infección. Para la eutanasia, en cada jaula, utilice 1-2 L de dióxido de carbono (CO2)en la primera etapa. Cuando el animal desarrolla la pérdida de conciencia, obtener el caudal de CO2 alrededor de 4–5 L/min. Realizar la eutanasia de ratón utilizando la inhalación de CO2.</li>
		<li>Separe el hígado cortando la piel superficial del peritoneo utilizando tijeras y fórceps y arrastrando ligeramente el hígado hacia atrás para descubrir la piel interna que recubre la cavidad peritoneal. Recoger y cortar muestras de hígado (largo x ancho x alto á 0,5 cm x 0,5 cm X 0,3 cm) de los ratones infectados para caber fácilmente en el casete de incrustación y bloquear en 10% de formalina tampón neutro durante 4-24 h.</li>
		<li>Descalcificar las muestras de hígadoutilizando 2.5 M de ácido fórmico; Enjuagar en xileno durante 3 min, enjuagar 2veces en 100% etanol, enjuagar 2veces en etanol 95%, enjuagar 2veces en agua desionizada (DI) durante 2 min, luego descalcificar las muestras de hígado en 1 mM de ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) correspondientemente. Manipular a una temperatura de sub-ebullición (90 oC) durante 20 min.</li>
		<li>Enfriar los tejidos hepáticos fijos durante 30 min. Enjuagar los tejidos con 1x PBS durante 4 min e incrustar los tejidos en parafina. Deshidratar los tejidos en una serie de concentraciones crecientes de etanol para reemplazar el agua, y luego sumergiren en la inmersión de xileno. Incruste los tejidos infiltrados en bloques de cera. Hacer secciones uniformemente verticales y horizontales para la tinción. Preparar secciones de 4 m con un microtome deslizante.</li>
		<li>Pasar las secciones a través de la desparafinación y rehidratación utilizando xileno y etanol, luego realizar la tinción inmunofluorescente de las secciones.</li>
		<li>Manchar las secciones con 200 l de anticuerpo específico de Ag de superficie de VHB (dilución 1:100 en la solución de bloqueo). Incubar las secciones con el anticuerpo durante 2 h a RT en una cámara humidificada 75%-100%, y lavar 5 veces en 1x PBS durante 5 min.</li>
		<li>Utilice un reactivo anti-fade que contenga 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para la tinción nuclear para contrarrestar las diapositivas. Agregue el cubreobjetos con aproximadamente 300 ml de la solución de tinción DAPI diluida (300 nM en 1x PBS) y valide toda la cubierta cubierta cubierta. Mantenga las diapositivas en la oscuridad a 4 oC hasta que las inspeccionebajo de un microscopio fluorescente.</li>
	</ol></li>
	<li>Infiltración inflamatoria celular en ratones infectados<ol>
<li>Sacrificar ratones como se describe en el paso 3.3.1. Recoja el hígado y haga secciones como se describe en el paso 3.3.4.</li>
		<li>Manchar la sección con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar la infiltración de células inflamatorias en el hígado.</li>
		<li>Almacene las diapositivas en la oscuridad a 4 oC hasta que se puedan realizar más análisis bajo un microscopio fluorescente.</li>
		<li>Visualizar diapositivas bajo un microscopio de fluorescencia para detectar la infiltración de células inflamatorias en el hígado(Figura 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de ADN del VHB del hígado infectado<ol>
<li>Aislamiento del ADN viral.</li>
		<li>Euthanizar ratones y recoger las muestras de hígado de acuerdo con la sección 3.3.</li>
		<li>Lise los tejidos hepáticos en Tampón de lisis No Indet P-40 (NP-40) (50 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa.</li>
		<li>Centrifugar brevemente a 16.000 x g para eliminar los núcleos y los restos celulares.</li>
		<li>Incubar el lisado citoplasmático con nucleasa microcócica (nucleasa S7; 150 unidades/ml) y CaCl2 (5 mM) a 37 oC durante 90 minutos para degradar el ácido nucleico fuera de los nuclerópsidos (NC).</li>
		<li>Inactivar la nucleasa S7 mediante la adición de 10 mM EDTA.</li>
		<li>Precipitar los nucleocápsidos con polietilenglicol (PEG), interrumpir en un 0,5% de sulfato de dodecilo sódico (SDS) y digerir con 0,6 mg/ml de proteína K (PK) a 37 oC durante 1 h.</li>
		<li>Recuperar los ácidos nucleicos virales mediante la extracción de cloroformo de fenol y la precipitación de etanol.</li>
		<li>Resuelva el ADN viral extraído en un gel de agarosa del 1,2% y detecte mediante un análisis estándar de la mancha sureña utilizando una sonda de ADN HBV con etiqueta P32.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Scaglione, S. J., Lok, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+hepatitis+B+treatment+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice.</a> Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).</li>
<li>Osiowy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+infancy+and+beyond...+ensuring+a+lifetime+of+hepatitis+B+virus+%28HBV%29+vaccine-induced+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).</li>
<li>Gish, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+HBsAg+antigen+during+treatment+with+entecavir+or+lamivudine+in+nucleoside-naive+HBeAg-positive+patients+with+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Viral+Hepatitis%22%5BJournal%5D)">Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B.</a> Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).</li>
<li>Kurktschiev, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+CD8%2B+T+cells+in+hepatitis+B+and+C+are+characterized+by+a+lack+of+antigen-specific+T-bet+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).</li>
<li>Fisicaro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+intrahepatic+T-cell+responses+can+be+restored+by+blocking+programmed+death-1+pathway+in+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).</li>
<li>Schurich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+signal+cytokine+IL-12+rescues+the+anti-viral+function+of+exhausted+HBV-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208(2013).</li>
<li>Gehring, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+virus-specific+T+cells+that+target+HBV+infected+hepatocytes+and+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+Tumor+Necrosis+Factor-alpha+Produced+by+T+Cells+Reduce+the+HBV+Persistence+Form%2C+cccDNA%2C+Without+Cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis.</a> Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).</li>
<li>Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunocompetent+mouse+model+for+the+tolerance+of+human+chronic+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).</li>
<li>Wong, P., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cell+responses+to+infectious+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cell responses to infectious pathogens.</a> Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).</li>
<li>Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hepatitis+B+virus+clearance+in+chimpanzees%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117 (3), 808-814 (2011).</li>
<li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+murine+CD8%2B+and+CD4%2B+T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).</li>
<li>Kuball, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+matched+pairing+and+expression+of+TCR+chains+introduced+into+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells.</a> Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).</li>
<li>Cameron, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Titin-derived+HLA-A1-presented+peptide+as+a+cross-reactive+target+for+engineered+MAGE+A3-directed+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells.</a> Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).</li>
<li>Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1-+and+CTLA-4-based+inhibitory+chimeric+antigen+receptors+%28iCARs%29+divert+off-target+immunotherapy+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses.</a> Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).</li>
<li>Maus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+chimeric+antigen+receptors+can+cause+anaphylaxis+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunolology+Research%22%5BJournal%5D)">T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans.</a> Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).</li>
<li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4-induced+pluripotency+in+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells.</a> Cell. 136 (3), 411-419 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+naive+single-type+tumor+antigen-specific+CD8%2B+T+lymphocytes+from+murine+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22OncoImmunology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells.</a> OncoImmunology. 6, (2017).</li>
<li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+Immunotherapy+in+Mice+Using+Genetically+Engineered+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).</li>
<li>Tan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Expression+Profiles+of+HBV+DNA+Integrated+Into+Genomes+of+Hepatocellular+Carcinoma+Cells+to+Select+T+Cells+for+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy.</a> Gastroenterology. , (2019).</li>
<li>Wu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6C%28%2B%29+Monocytes+and+Kupffer+Cells+Orchestrate+Liver+Immune+Responses+Against+Hepatitis+B+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice.</a> Hepatology. , (2019).</li>
<li>Haque, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+tissue-associated+regulatory+T+cells+suppress+the+activity+of+pathogenic+cells+in+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insights%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes.</a> Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).</li>
<li>Chisari, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+pathological+effects+of+synthesis+of+hepatitis+B+virus+large+envelope+polypeptide+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).</li>
<li>Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+leads+to+autoantibody+production+but+not+autoimmune+liver+disease+in+hepatitis+B+virus+envelope+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice.</a> Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo presenta un método para generar los iPSC-CTL virales específicos de Ag para su uso como ACT para suprimir la replicación del VHB en un modelo murino. En la infección crónica por el VHB, el genoma viral forma un minicromo estable, el ADN circular covalentemente cerrado (CCCDNA) que puede persistir a lo largo de la vida útil del hepatocito. Dirigirse al aclaramiento del mini cromosoma viral puede dar lugar a una cura de la infección crónica por el VHB. La terapia antiviral actual se dirige al virus a la tran...

Después de una infección aguda, el sistema inmunitario adaptativo (es decir, inmunidad humoral y celular) controla la mayor parte de la hepatitis aguda relacionada con el VHB. Sin embargo, varias personas en las regiones endémicas del VHB no pueden eliminar los virus y posteriormente convertirse como individuos crónicos. Más del 25% de los pacientes crónicos (>250 millones de personas) en todo el mundo desarrollan enfermedad hepática progresiva, lo que resulta en cirrosis hepática y/o carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, la erradicación de las células infectadas insistentemente sigue siendo un problema general de salud, a pesar de que hay una vacuna disponible2 y numerosos medicamentos antivirales están en desarrollo. El tratamiento estándar para la infección por VHB incluye análogos de IFN, nucleósidos y nucleótidos. Estos agentes tienen actividad antiviral directa y capacidades moduladoras inmunes. Sin embargo, la seroconversión del antígeno HBe (Ag)+ portadores con anticuerpo anti-HBe (Ab) y pérdida de ácido desoxirribonucleico sérico del VHB (ADN) aparecen individualmente en aproximadamente el 20% de los pacientes tratados, y el control inmunológico completo del virus verificada por la privación del HBsAg no es más del 5%3. Además, la respuesta al tratamiento a menudo no es duradera. La vacunación profiláctica con HBs Ag recombinante es altamente eficaz en la prevención de infecciones, pero la vacunación terapéutica de HBs Ag no es eficaz. Claramente, las respuestas inmunitarias mediadas por células T desempeñan un papel crítico en el control de la infección por el VHB y la insuficiencia hepática; sin embargo, en pacientes crónicos con hepatitis, los thbv reactivos a menudo se eliminan, disfuncionales o conviertenagotado4,5,6. En consecuencia, en individuos con infección persistente por VHB, no se ha logrado el éxito de ningún intento de restablecer la inmunidad específica del VHB (es decir, la inmunidad basada en células T) mediante remedio antiviral, citoquinas inmunomoduladoras o inmunización curativa.
La transferencia celular adoptiva (ACT) de células T específicas del VHB Ag es un tratamiento eficiente dirigido a erradicar eventualmente los hepatocitos restantes con el VHB7,8. Se ha demostrado que el ACT de CTL específicos del VHB en ratones infectados por el VHB causa hepatitis leve transitoria y, y una disminución dramática de las transcripciones del ácido ribonucleico del VHB (ARN) en los hepatocitos. En estos estudios, los CTL no inhibiron la transcripción de genes del VHB, sino que mejoraron la degradación de las transcripciones del VHB9. Los CTL específicos del VHB son importantes para prevenir la infección viral y mediar en el aclaramiento del VHB10,11. Para los remedios basados en ACT, se ha sugerido que la expansión in vitro de células T específicas del VHB con una alta reactividad para el reasentamiento in vivo es un método ideal12,13,14; sin embargo, los enfoques actuales están restringidos con respecto a sus capacidades para generar, separar y crecer cantidades y cualidades apropiadas de células T específicas del VHB de los pacientes para las terapias potenciales.
Aunque los ensayos clínicos presentan seguridad, practicabilidad y actividad terapéutica prospectiva de tratamientos basados en células mediante células T de ingeniería que son específicos de los hepatocitos infectados por el virus del VHB, hay preocupaciones sobre los efectos desfavorables debido a las respuestas autoinmunes debido a la reactividad cruzada del receptor de células T de búsqueda incorrecta (TCR)15,16, reconocimiento Ag fuera del objetivo por TCR no específico17 y fuera de toxicidad en el objetivo por un receptor Ag quimérico (CAR) 18 , 19 con tejidos sanos. Actualmente, las células T modificadas genéticamente, que sólo tienen persistencia a corto plazo in vivo, son generalmente células T intermedias o posteriores. Hasta la fecha, las células madre pluripotentes (PSC) son la única fuente disponible para generar un gran número de células T nave de tipo único Ag20,21,22,23. Los PsC inducidos (iPSC) simplemente se convierten a partir de las células somáticas de un paciente mediante el uso de la transducción génica de varios factores de transcripción. Como resultado, los iPSC tienen características similares a las de las células madre embrionarias (ESC)24. Debido a la flexibilidad y la posibilidad de la capacidad infinita de auto-renovarse, además de la sustitución de tejidos, los tratamientos basados en iPSC pueden aplicarse ampliamente en la medicina regenerativa. Además, los regimientos subyacentes a las iPSC pueden mejorar sustancialmente las terapias actuales basadas en células.
El objetivo general de este método es generar una gran cantidad de CTL específicos del VHB a partir de iPSC (es decir, iPSC-CTLs) para la inmunoterapia basada en ACT. Las ventajas sobre las técnicas alternativas son que los iPSC-CTL específicos del VHB tienen un tCR de un solo tipo y un fenotipo ingenuo, lo que da como resultado un mayor desarrollo de células T de memoria después del ACT. Se ha demostrado que el ACT de iPSC-CTL específicos del VHB aumenta la migración de células CD8+ T funcionales en el hígado y reduce la replicación del VHB tanto en el hígado como en la sangre de los ratones administrados. Este método revela un uso potencial de iPSC-CTL virales específicos de Ag para la inmunoterapia con VHB y puede adaptarse para generar otras células iPSC-T virales específicas de Ag para inmunoterapia viral.

<table><tbody><tr><td>Ratones HHD</td><td>Institut Pasteur, París, Francia</td><td></td><td>H-2 clase I knockout, ratones HLA-A2.1-transgénicos (HHD)</td></tr><tr><td>iPS-MEF-Ng-20D-17 Banco de</td><td>células RIKEN</td><td>APS0001</td><td></td></tr><tr><td>SNL76/7</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1049</td><td></td></tr><tr><td>OP9 ATCC</td><td></td><td>CRL-2749</td><td></td></tr><tr><td>pAAV/HBV1.2 plásmido</td><td>Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hospital Universitario Nacional de Taiwán, Taiwán)</td><td></td><td>Construcción de ADN</td></tr><tr><td>del VHB Genes TCR específicos de HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)</td><td>Dr. Adam J Gehring (Instituto de Investigación del Hospital General de Toronto, Toronto, Canadá)</td><td></td><td>Genes TCR híbridos humano-murinos restringidos A2 específicos de FLLTRILTI (V&alpha; 34 y V&beta; 28)</td></tr> <tr><td>OVA257 y ndash; 264 genes TCR específicos Dr</td><td>. Dario A. Vignali (Universidad de Pittsburgh, PA)</td><td></td><td>Genes TCR restringidos por H-2Kb específicos de SIINFEKL</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD44 (IM7)</td><td>BD Pharmingen</td><td>103012</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD4 (GK1.5)</td><td>Biolegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD8 (53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100732</tr><tr><td>Anti-IFN-y gamma; (XMG1.2) anticuerpo</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-TNF-a (MP6-XT22)</td><td>Biolegend</td><td>506306</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-HBs</td><td>Thermo Fisher</td><td>MA5-13059</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampón de lisis</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion clasificador de células</td><td>BD</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>MilliporeSigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>GeneJammer</td><td>Agilent</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A201-HBs183-91-PE pentámero</td><td>Proimmune</td><td>F027-4A - 27</td><td></td></tr><tr><td>HRP Anticuerpo Secundario Anti-Ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A27025</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>Peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa S7</td><td>Roche</td><td>10107921001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>MilliporeSigma</td><td>P6148-500G</td><td>Precaución: Alergénico, cancerígeno, tóxico</td></tr><tr><td>Tampón de permeabilización</td><td>Biolegend</td><td>421002</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>ProLong&trade; Montaje antidecoloración de oro con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp MinElute Virus Spin Kit</td><td>Qiagen</td><td>57704</td><td></td></tr></tbody></table>

linfocitos t virales derivados de células madre suprimen la replicación del vhb en ratones

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es un problema de salud mundial. Con más de 350 millones de personas afectadas en todo el mundo, la infección por el VHB sigue siendo la principal causa de cáncer de hígado. Esta es una preocupación importante, especialmente en los países en desarrollo. La falta de montaje del sistema inmunitario contra el VHB conduce a una infección crónica. Aunque la vacuna contra el VHB está presente y se están creando nuevos medicamentos antivirales, la erradicación de las células de los reservorios de virus sigue siendo un tema de salud importante. Aquí se describe un método para la generación de antígeno viral (Ag) -cd8 específico+ linfocitos T citotóxicos (CTL) derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (es decir, iPSC-CTL), que tienen la capacidad de suprimir la replicación del VHB. La replicación del VHB se induce eficientemente en ratones a través de la inyección hidrodinámica de un plásmido de expresión de VHB, pAAV/HBV1.2, en el hígado. A continuación, los iPSC-CTL de ratón específicos de La superficie del VHB se transfieren de forma adoptiva, lo que suprime en gran medida la replicación del VHB en el hígado y la sangre, así como previene la expresión Ag de la superficie del VHB en los hepatocitos. Este método demuestra la replicación del VHB en ratones después de la inyección hidrodinámica y que los CTL virales específicos de Ag derivados de células madre pueden suprimir la replicación del VHB. Este protocolo proporciona un método útil para la inmunoterapia con VHB.

Como se muestra aquí, las células virales de HBV Ag-específicas iPSC-CD8+ T son generadas por un sistema de cultivo in vitro. Después de ACT de estas células virales iPSC-CD8+ T específicas de Ag suprimen sustancialmente la replicación del VHB en un modelo murino (Archivo Suplementario 1). Los iPSC de ratón se transdulan con la construcción retroviral MIDR que codifica un gen TCR híbrido de VHH humano-ratón (HBs183-191-específico, s183), luego los iPSC transducidos por ge...

Aquí se presenta un protocolo para la supresión efectiva de la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones mediante la utilización de la transferencia de células adoptivas (ACT) de linfocitos T específicos de antígeno viral derivado de células madre (Ag). Este procedimiento puede adaptarse para una posible inmunoterapia basada en ACT de infección por VHB.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la transferencia celular adoptiva de células T específicas del antígeno viral derivadas de iPSC para la supresión efectiva de la replicación del VHB en ratones. La principal ventaja de esta técnica es que las células T específicas del antígeno viral derivadas de iPSC tienen un único receptor de células T de tipo y un fenotipo ingenuo. Para la diferenciación de células T positivas iPSC específicas del VHB, la placa s183 T receptor de células T transdujo iPSC en una monocapa OP9-DL1/DL4 en medio alfa-mínimo complementado con 20%suero bovino fetal y ligando murino Flt3 para su cocultivo en una incubadora de cultivo celular.Supervise el co-cultivo regularmente para evaluar la morfología celular. En el día 28, retire las células sobrenadantes y flotantes, y separe las células adherentes con 0.25%trypsin. Cuando las células se hayan levantado del fondo del recipiente de cultivo, detenga la reacción enzimática con ocho mililitros de medio iPSC y recoja las células por centrifugación.Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio fresco. Diluir las células a una célula T positiva CD8 derivada de iPSC a cuatro splenocitos con péptido s183 para una incubación de 40 horas en la incubadora de cultivo celular. Durante las últimas siete horas, añadir cuatro microlitros de brefeldina diluida A al cultivo, para bloquear los procesos de transporte durante la activación celular.Manchar las células para el análisis citométrico de flujo de las citoquinas intracelulares de interés de acuerdo con los protocolos estándar. Para el suministro hidrodinámico de plásmido del VHB a través de la vena de la cola, diluir 10 microgramos de plásmido del VHB en un 8% equivalente a la masa corporal de PBS. Cargue el plásmido en una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 26 y 1/2 pulgada por ratón.Caliente los ratones HHD bajo una lámpara de calor durante cinco minutos para dilatar las venas de la cola, y tire cuidadosamente de un ratón en un limitador de plástico. Localice una vena de cola lateral dilatada en el tercio medio de la cola e inserte la aguja paralela a la vena para entregar todo el volumen de plásmido a través de la vena de la cola durante un período de tres a cinco segundos. Para la transferencia de células T positivas de CD8 de antígeno viral, recoja las células T CD8 positivas de iPSC el día 22 del cultivo como se ha demostrado, y sembrar las células en un nuevo plato de cultivo celular de 10 centímetros.Después de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular, filtrar las células flotantes a través de un colador de nylon de 70 micrómetros, y contar las células viables. Diluir las células a un 1,5 veces 10 a las siete células por mililitro de concentración de PBS. Inyecte 200 microlitros de células en ratones individuales de HHD de cuatro a seis semanas de edad, en la vena de la cola como se acaba de demostrar.El día 14 después de la transferencia celular, realice una entrega hidrodinámica de plásmido del VHB como se ha demostrado. En los puntos finales experimentales apropiados después de la infección, cosechar el hígado de cada animal infectado, y cortar los hígados en muestras de tejido de 0,5 por 0,5 por 0,3 centímetros. Coloque las muestras en formalina tampón 10% neutro durante cuatro a 24 horas, seguida de descalcificación en ácido fórmico de 2,5 molar durante seis a 24 horas.A continuación, enjuague las muestras en xileno durante tres minutos, seguido de dos enjuagues de dos minutos en 100%etanol, 95% etanol y agua desionizada. Después del último lavado con agua, descalcificar los tejidos en EDTA de un milimolar a 90 grados centígrados, seguido de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando el tejido se haya enfriado, enjuague las muestras en PBS durante cuatro minutos, y use xileno y etanol para desparafinar y rehidratar las muestras.Para el etiquetado inmunofluorescente, manche las secciones con 200 microlitros de anticuerpos específicos del antígeno de superficie del VHB durante dos horas a temperatura ambiente en una cámara 75 a 100% humidificada. Al final de la incubación, lave las muestras con cinco lavados de cinco minutos en PBS fresco para cada lavado. Etiquete las células con DAPI de acuerdo con los protocolos estándar antes de montar las diapositivas con cubreobjetos para la toma de imágenes por microscopía de fluorescencia.Para el análisis inmunohistoquímico, manar las secciones con hematoxilina y eosina de acuerdo con los protocolos estándar, y evaluar la infiltración de células inflamatorias en el hígado por microscopía de luz. El análisis citométrico de flujo de la población CD8 positiva CD8 positiva de iPSC revela que la transducción del receptor de células T del VHB aumenta drásticamente la generación de células T positivas de CD88 específicas de s183. Después de la estimulación con esplenocitos extenuados en T pulsadas con péptido s183, las células T derivadas de iPSC CD8 monopositiva CD8 cd4 producen grandes cantidades de interferón gamma, según lo detectado por el análisis citométrico de flujo intracelular y ELISA.Después de la infección por VHB por inyección hidrodinámica, la replicación del ADN alcanza su punto máximo en el día seis y se reduce gradualmente, como se observa mediante el análisis de PCR en tiempo real. Además, la replicación viral se reduce significativamente en todos los puntos de tiempo en ratones que reciben células T específicas de antigénicos virales del VHB en comparación con los ratones que reciben células de control. La proteína superficial del VHB también se reduce sustancialmente en ratones que reciben linfocitos citotóxicos pre-iPSC específicos del vhB específicos en comparación con los ratones tratados con células de control, lo que demuestra claramente que las células T positivas iPSC específicas del antígeno viral tienen la capacidad de reducir la replicación del VHB en un modelo murino.Ahora debe tener una buena comprensión de cómo generar células T específicas del antígeno viral a partir de iPSC para la inmunoterapia adoptiva.

stem-cell-derived-viral-ag-specific-t-lymphocytes-suppress-hbv

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo de forma rápida, sencilla y rentable para la generación de donantes de origen multivirus CTL específicos (RCTL) para la perfusión del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas de trasplante (HSCT) con riesgo de desarrollar infecciones por CMV, EBV o Adv. Este proceso de fabricación es conforme a las GMP y debe garantizar la aplicación más amplia de células T inmunoterapia más allá de los centros especializados.

Generación de células T Multivirus específicos para prevenir / tratar las infecciones virales después de trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas

γ-herpesvirus (γ-VS) establecer la persistencia de toda la vida en su huésped. La infección de ratones con γ-HV68 ofrece un manejable de forma...

La medición de γHV68 infección en los ratones

Aquí se describe la primera práctica de fabricación (GMP)-cumple método de producción de virus específicos de los linfocitos T citotóxicos (CTL) de la sangre del cordón umbilical, una fuente de células T predominantemente ingenuo.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

El video muestra un ensayo que utiliza células T CD8+ derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) para inhibir la replicación del virus de la hepatitis B (VHB) en ratones. Estas células T, modificadas con receptores específicos del VHB, se transfieren a ratones transgénicos. A continuación, los plásmidos del genoma del VHB competentes para la replicación se inyectan directamente en el hígado, lo que permite la absorción del ADN viral. Una vez que los antígenos virales son...

Supresión de la replicación del virus de la hepatitis B mediante linfocitos T específicos de antígenos virales

Aquí, describimos un protocolo para analizar el fenotipo de células T reguladoras (Treg) aisladas de ratones infectados por el virus de la coriomeningitis linfocítica crónica e ingenua. Además, proporcionamos un proceso para evaluar la actividad supresora de las células Treg.

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Aquí se describe un virus de la hepatitis B de nuevo desarrollo sistema indicador (HBV) para supervisar las primeras etapas del ciclo de vida de HBV. Esta simplificado sistema in vitro ayudará en la selección de agentes anti-HBV utilizando una estrategia de alto rendimiento.

Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

Este protocolo describe el uso de la única cadena MHC de clase I complejos para investigar las interacciones moleculares en la activación de células T CD8 + humana: generación de ingeniería antígeno que presenta las células que expresan la cadena sola construye, cultura del clon humano de células T CD8 + y experimentos de activación de la célula de T.

Uso de la única cadena MHC tecnología investigar Co-agonismo humano CD8 + activación de células T

Este manuscrito describe un protocolo detallado para la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) en células 293T de ingeniería novedosa (293T-NE-3NR, expresando NTCP humano, HNF4, RXR y PPAR) y células hepáticas tradicionales (HepG2-NE, expresando NTCP humano).

Modelado de la infección por el virus de la hepatitis B en células no hepáticas 293T-NE-3R

Sobre la base de una matriz peptídica derivada del virus de la hepatitis B (VHB), las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB podrían evaluarse en paralelo con la identificación de epítopos de células T CD4 específicas del VHB.

Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica

Presentamos un protocolo para detectar compuestos contra el virus de la hepatitis B (VHB) dirigidos a las etapas del ciclo de vida de entrada pre y post-viral, utilizando calorimetría de titulación isotérmica para medir la afinidad de unión (KD) con el polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio del huésped. La eficacia antiviral se determinó a través de la supresión de los marcadores del ciclo de vida viral (formación de ADNcc, transcripción y ensamblaje viral).

Un modelo competente de hepatocitos que examina la entrada del virus de la hepatitis B a través del polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio como objetivo terapéutico

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Aprende a generar linfocitos T CD8+ específicos de VHB a partir de células iPSC para suprimir la replicación viral en ratones mediante transferencia adoptiva de células.

Linfocitos T virales derivados de células madre suprimen la replicación del VHB en ratones

Explorar más videos