Name: Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende a inducir meningitis meningocócica en ratones mediante inoculación intracisternal con Neisseria meningitidis. Este modelo reproduce los eventos patológicos de la enfermedad humana y permite evaluar interacciones huésped-patógeno.

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Los estudios fueron apoyados en parte por PRIN 2012 [número de subvención 2012WJSX8K]: "Modelos de interacción Host-microbe en infecciones mucosas: desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas" y por PRIN 2017 [2017SFBFER]: "Un enfoque integrado para abordar la interacción entre condiciones estresantes y resistencia a los antimicrobianos de patógenos desafiantes".

Este protocolo se llevó a cabo para minimizar el sufrimiento animal y reducir el número de ratones de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE). Los experimentos in vivo reportados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Éticos (Prot. número 2, 14 de diciembre de 2012) y el Ministerio de Salud de Italia (Prot. número 0000094-A-03/01/2013). Todos los procedimientos deben realizarse dentro del Gabinete de Bioseguridad 2 (BSC2) en una sala BSL2, y los posibles residuos infectados deben eliminarse en contenedores específicos.
1. Infección de ratones con N. meningitidis Serogroup C Strain
ADVERTENCIA: N. meningitidis es potencialmente un patógeno nocivo y se deben tomar todas las precauciones necesarias al manipular este microorganismo. Toda la experimentación requiere la contención de nivel 2 de bioseguridad (BSL2). El investigador involucrado en estudios con animales debe usar equipo de protección personal desechable (EPP) durante el experimento.
<ol><li>Preparación de bacterias para estudios de infección in vivo
	<ol>
<li>Elija una sola colonia de un cultivo fresco de Neisseria meningitidis en placa de agar GC (Gonococcal) complementada con 1% (vol/vol) suplemento de polivitox e inocular en 10 mL de caldo GC.</li>
		<li>Cultivar las bacterias a 37 oC en una incubadora de agitador orbital con una velocidad de 220 rpm. Sigue revisando el O.D. de la cultura con un espectrofotómetro. Cultivar el cultivo hasta la fase exponencial temprana a una densidad óptica OD600nm de 0,7, correspondiente a 7 x 108 CFU/ml.</li>
		<li>Una vez obtenido el D.O. requerido, haga las existencias congeladas añadiendo un 10% de glicerol. Dispensar 1 ml de la cultura en los crioviales. Conservar los viales a -80oC hasta su uso. NOTA: Aunque es mejor utilizar el cultivo bacteriano fresco, las existencias congeladas se utilizaron para simplificar y estandarizar el experimento in vivo. Por lo general, las existencias congeladas se han empleado dentro de aproximadamente 6 meses desde la preparación.</li>
		<li>Antes de la infección, descongelar las bacterias congeladas a temperatura ambiente.</li>
		<li>Cosecha las células bacterianas por centrifugación durante 15 min a 1.500 x g y resuspende en 1 ml de caldo GC fresco que contenga desnrón de hierro (5 mg/kg). NOTA: El caldo GC se prepara con la adición de desmolde de hierro (5 mg/kg) con el fin de favorecer la replicación de meningococos en el tejido huésped14,18,27.</li>
		<li>Antes de usar, realizar recuentos viables de bacterias para determinar el número exacto de Ufc para la infección. Para ello, recoger 10 oL de suspensión bacteriana y proceder con diluciones en serie y extender cada dilución en placas de agar GC e incubar a 37 oC con 5% co2,durante 18-24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección intracisternal de ratones Nota:Todo el procedimiento se realiza en el armario de flujo laminar para mantener condiciones asépticas.<ol><li>Ratones de laboratorio domésticos (8 semanas de edad, hembra Balb/c) bajo condiciones específicas libres de patógenos. Proporcione pellets de alimentos y agua ad libitum.</li>
		<li>Resolver los animales en el nuevo entorno durante 1 semana antes de comenzar el experimento.</li>
		<li>Antes de comenzar el experimento, sopesar y evaluar su temperatura corporal. NOTA: Los ratones hembra endogámicos Balb/c de ocho semanas de edad pesan un promedio de unos 19 g. La temperatura media de los ratones de laboratorio fisiológicamente oscila entre 36-38 oC24.</li>
		<li>Estruja al animal del cuello, limpia la zona del abdomen con el 70% de etanol e inyecta un deextrano de hierro i.p. (disuelto en tampón de solución salina de fosfato al 1 %, 250 mg/kg) en el cuadrante inferior derecho del abdomen murino usando una aguja de 25 G 0,5 mm x 16 mm , aproximadamente 2-3 h antes de la infección. NOTA: La inyección intraperitoneal se realizó en el cuadrante inferior derecho del abdomen murino para evitar dañar los órganos abdominales como vejiga urinaria, cecum, etc. La administración de fuente de hierro exógena, en forma de desnrón de hierro, a los animales antes de la infección favorece la multiplicación bacteriana en el huésped14,18,27.</li>
		<li>Después de 2-3 h, realizar anestesia animal con ketamina (50 mg/kg) y xilazina (3 mg/kg) y lubricante oftálmico.</li>
		<li>Compruebe la profundidad de la anestesia asegurando la ausencia de respuesta al dolor al pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del día.</li>
		<li>Coloque el ratón en decúito esternal y estire cuidadosamente las extremidades y la columna cervical para mantener la columna vertebral en una posición recta.</li>
		<li>Mezcle suavemente la suspensión bacteriana para mantener una suspensión constante antes de cargar una jeringa de 30 G de aguja x 8 mm. NOTA: Preparar la suspensión bacteriana lo más cerca posible del tiempo de inyección; mientras tanto, guárdelo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Sobre la base del mareado bacteriano posterior a la descongelación (CFU/ml), proceder al cálculo del total de ufc cfu a utilizar, con respecto al número total de animales a infectar (dosis bacteriana de la CFU por número de animales). Proceder con el cálculo del volumen exacto a tomar del vial para obtener la UFC total aplicando una proporción entre el titer bacteriano posterior a la descongelación (CFU/ml) y el total de UFC útil para la infección de n ratones (post descongelación de la CFU bacteriana : ml - CFU total : x). Establecer el volumen final con respecto al número total de animales a infectar. NOTA: En estos experimentos, se utilizó una amplia gama de titer de 104 a 109 por animal.</li>
		<li>Limpie el área quirúrgica con 70% de etanol.</li>
		<li>Identificar el punto de inyección con la ayuda de una aguja e inyectar la CFU establecida de meningococos (cepa de tipo salvaje y cepa mutante isogénica), o caldo GC complementado con deextran de hierro (5 mg/kg) como control, en un volumen total de 10 ol en la cisterna magna de los ratones a través de un orificio de rebaba occipital utilizando una aguja de 30 G x 8 mm.<ol>
<li>Realice el inóculo cisternal colocando la aguja en la unión craneocervical, específicamente en el espacio subaracnoideo dorsal. Ventroflex la cabeza para hacer este espacio accesible28.</li>
			<li>Brevemente, coloque al animal en recumbencia lateral, sostenga las orejas fuera del camino y flexione el cuello moderadamente (90 a 100o). Asegúrese de que la línea media del cuello y la cabeza (desde la nariz hasta el occipucio) estén perfectamente paralelas a la mesa.</li>
			<li>Toque las alas del atlas y asegúrese de que se superponen, eliminando la rotación axial. Una sangría natural generalmente se puede tocar en la línea media donde es más probable que la aguja entre en el orificio occipital.</li>
			<li>Deseche la jeringa y la aguja de forma segura después de la inyección de ratones con Neisseria.</li>
		</ol></li>
		<li>Coloque el animal en la jaula y espere el despertar y la recuperación completa del movimiento.</li>
		<li>Mantenga las jaulas con ratones infectados bajo un gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Monitorizar ratones, 24 h después de la infección, para signos clínicos de coma según la escala de coma29. Escala de coma: 1o de coma, 2o no se para erguido después de girar la espalda, 3o se para erguido dentro de 30 s, 4o se mantiene erguido dentro de 5 s, actividades ambulatorias mínimas, 5o normal. 
		 NOTA: Cuando se registraba dolor en animales, se administró analgesia con meloxicam (5 mg/kg i.p. para la duración del estudio).</li>
		<li>Proceder para la supervivencia animal o cFU cuenta el ensayo en los animales infectados como se detalla en el paso 2.</li>
		<li>Realizar la eutanasia de ratones con una puntuación de 2 por luxación cervical y registrar como muerto para el análisis estadístico.</li>
	</ol></li>
</ol>2. La supervivencia animal y los recuentos de ufcs
<ol><li>
Supervivencia animal
	<ol>
<li>Preparar la inocula bacteriana a diferentes dosis (que van desde 104 a 109 UFC por ratón) para infectar a los animales por el i.cist. ruta (véase el paso 1.2).</li>
		<li>Ratones de control de inoculación con caldo GC, complementado con deextran de hierro (5 mg/kg), de la misma manera.</li>
		<li>Monitorizar animales para síntomas clínicos: piel con volantes, apariencia encorvada, hipotermia, pérdida de peso, letargo, o moribundo24,25,26,30, todos los días durante todo el experimento durante 168 h (7 días) al menos dos veces al día durante la duración del experimento.</li>
		<li>Mida el peso corporal y la temperatura utilizando un equilibrio digital y un termómetro rectal, respectivamente todos los días.</li>
		<li>Registrar la supervivencia de los ratones durante una semana. NOTA: Registre la muerte natural de la infección por animales después de que los animales que alcanzan un valor de coma de 2 o que sobrevivan más de 168 h de observación serán eutanasiados.</li>
		<li>Anestetizar ratones con un valor de coma de 2 o que sobrevivan durante el tiempo de observación con ketamina (50 mg/kg) y xilazina (3 mg/kg) y aplicar pomada oftálmica.</li>
		<li>Compruebe que la respuesta del dolor esté ausente por pellizco de dedo del dedo del día.</li>
		<li>Realizar la eutanasia de ratones por luxación cervical y registrar como muerto para el análisis estadístico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evaluación del recuento de unidades formadoras de colonias (CFU) en órganos periféricos
	<ol>
<li>Utilice una dosis bacteriana subletal (5 x 105UFC/ratones) sobre la base de los resultados de supervivencia animal para inocular animales por el i.cist. (ver subsección 1.2).</li>
		<li>Controlar la temperatura rectal todos los días durante la infección y realizar anestesia de animales a 48 h después de la infección como se menciona en el paso 2.</li>
		<li>Proceda con la desinfección del 70% del etanol del tórax y retire 600-700 l de sangre por punción cardíaca de la cavidad torácica utilizando una aguja de 25 G 0,5 mm x 16 mm.</li>
		<li>Recoger la sangre en un tubo que contenga un 3,8% de citrato de sodio y almacenar a -80 oC para los recuentos de células bacterianas más tarde viables.</li>
		<li>Realizar dislocación cervical para sacrificar a los animales. Confirmar la muerte registrando la ausencia de latidos del corazón, después de sacrificar el ratón de acuerdo con todas las pautas institucionales y éticas relevantes.</li>
		<li>Coloque el ratón en la posición supina y use tijeras y fórceps para proceder con el corte del pelaje a lo largo del plano sagital del cuerpo. Fijar la piel con el pelaje en los lados del cuerpo con alfileres.</li>
		<li>Cortar la membrana peritoneal usando tijeras afiladas. Use tijeras y fórceps desechables para extirpar los órganos (p. ej., bazo e hígado) y ponga cada uno de ellos en un plato estéril de Petri con 1 ml de caldo GC complementado con 10% (vol/vol) glicerol.</li>
		<li>Deseche el cuerpo del ratón de forma segura según las directrices de la IACUC.</li>
		<li>Homogeneizar los órganos mecánicamente a temperatura ambiente con el émbolo de una jeringa de 5 ml durante unos 2-3 minutos hasta que se forme una suspensión de una sola célula y transferirla en un tubo.</li>
		<li>Coloque el tubo con la muestra de tejido homogeneizado inmediatamente sobre el hielo seco. NOTA: Las muestras se pueden almacenar a -80 oC en un tubo estéril de 2 ml para realizar la evaluación de recuentos de células bacterianas viables en puntos posteriores.</li>
		<li>Haga placas de agar GC con antibióticos cuando sea necesario. Secar las placas antes de su uso preincubando a 37oC durante 2-3 h.</li>
		<li>Preparar 10 diluciones seriales de las muestras en caldo GC de cada tejido homogeneizado y placa en placas de agar GC. Incubar durante la noche a 37oC con 5% deCO2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación de los tejidos cerebrales para el recuento de UFC
<ol><li>Utilice una dosis bacteriana subletal (5 x 105 UFC/ratones) sobre la base de los resultados de supervivencia animal para inocular animales por el i.cist. (ver subsección 1.2).</li>
	<li>Realizar anestesia de animales en el tiempo de infección establecido como se menciona en el paso 2.</li>
	<li>Realizar la eutanasia de los animales por luxación cervical.</li>
	<li>Limpie el área quirúrgica con 70% de etanol.</li>
	<li>Corta la cabeza del ratón con unas tijeras grandes.</li>
	<li>Resecíe el pelaje y la piel con la ayuda de pequeñas tijeras quirúrgicas y un fórceps de acero con punta fina, procediendo hacia la parte superior del cráneo para poder ver claramente las suturas y guiar la apertura del cráneo.</li>
	<li>Inserte la punta de una sintisa tijera a través del foramen magnum para abrir el cráneo.</li>
	<li>Cortar hacia el centro del cráneo y a través de la línea media del hueso parietal hacia el lado opuesto del cráneo. Corte suavemente a lo largo del borde lateral de la sutura lambdoid.</li>
	<li>Levante el cráneo comenzando desde la esquina parietal posterior y tire de él diagonalmente hacia arriba para descubrir el cerebro, mediante el uso de fórceps con punta fina.</li>
	<li>Asegúrese de que el tejido cerebral no esté unido a ningún hueso de la cabeza, cuando se levante el cráneo.</li>
	<li>Use fórceps desechables para extraer cualquier tejido conectivo entre el cráneo y el cerebro, para asegurarse de que el tejido cerebral se extraiga junto con el cráneo.</li>
	<li>No permita que el tejido cerebral se seque demasiado. Coloque el cerebro, usando fórceps desechables, en una placa de Petri con 1 ml de caldo GC complementado con 10% (vol/vol) glicerol.</li>
	<li>Homogeneizar el cerebro mecánicamente con el émbolo de una jeringa de 5 ml (ver paso 2.2.9). Transfiera las muestras a un tubo estéril de 2 ml y almacene -80 oC para la evaluación posterior de recuentos de células bacterianas viables, como se describe en el paso 2.2.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, describimos un protocolo experimental para inducir la meningitis meningocócica en ratones adultos por i.cist. inoculación de bacterias meningocócicas. Hasta nuestro conocimiento, no se ha desarrollado ningún otro modelo de meningitis meningocócica en ratones de laboratorio infectados por i.cist. ruta; en el pasado, esta forma ha sido explorada para proporcionar modelos de meningitis meningocócica tanto en rata31 como en conejo32. Es bien sabido que la tasa ...

Neisseria meningitidis es un Gram negativo-proteobacterium restringido al huésped humano, bien conocido por ser una de las causas más comunes de meningitis y sepsis en la población humana en todo el mundo. Coloniza el tracto respiratorio superior (nariz y garganta) de portadores sanos y asintomáticos (2-30% de la población), pero la bacteria a veces evade varias defensas inmunitarias del huésped y se propaga desde el torrente sanguíneo al cerebro causando un inflamación, conocida como meningitis meningocócica. Una combinación de factores huésped y bacterianos parece contribuir a la transición de la comensal al comportamiento invasivo1.
N. meningitidis está especializada exclusivamente en la colonización humana y la infección. Tiene un rango de huésped estrecho y, por lo tanto, tiene estudios de patogénesis in vivo limitadodebidodebido a la falta de modelos animales adecuados que reproduzcan la enfermedad meningocócica humana. Como resultado, había dado lugar a lagunas fundamentales en la comprensión relativa a la patogénesis de la septicemia y la meningitis causada por el meningococo. En las últimas décadas, el desarrollo de muchos sistemas in vitro permitió la identificación de varios factores de virulencia meningocócica2,3,4. Aunque estos valiosos estudios proporcionaron información importante para entender el papel de estos factores para una infección meningocócica exitosa, estos modelos no permitieron evaluar las consecuencias de las interacciones bacterianas con el humor y celular sistema inmunológico y aún menos con todo el tejido. Los modelos animales in vivo de infección son de gran importancia también para la evaluación del grado de protección conferido por las formulaciones de vacunas. Como patógeno humano-trópico, el meningococo posee determinantes apropiados necesarios para una infección exitosa, como estructuras superficiales (es decir, proteínas pili y de opacidad tipo IV) y sistemas de admisión de hierro para receptores humanos y proteínas de transporte (es decir, transferrina y lactoferrina)5,6,7 para adherirse adecuadamente, sobrevivir e invadir el huésped humano. Por último, las capacidades de variación genética del patógeno para evadir y/o bloquear la respuesta inmune humana contribuyen aún más al alto tropismo de especies8,9. Por lo tanto, la ausencia de factores de huésped específicos, involucrados en la interacción, puede bloquear los pasos del ciclo de vida del patógeno, estableciendo dificultades significativas en el desarrollo de pequeños modelos animales que resumen el ciclo de vida meningocócico.
En las últimas décadas, se han desarrollado varios enfoques para mejorar nuestra comprensión del ciclo infeccioso meningocócico. Las infecciones de dos modelos animales, ratón y rata, ya sea intraperitonealmente (i.p.) o intranasal (es decir), se desarrollaron para reproducir la enfermedad meningocócica10,11,12,13,14 ,15,16,17. El ratón de laboratorio es probablemente uno de los animales más versátiles para inducir una infección meningocócica experimental.
Sin embargo, la vía i.p. de infección conduce al desarrollo de sepsis grave, aunque no imita la vía natural de la infección, mientras que la vía i.n. de la infección fue útil para evaluar la patogénesis meningocócica, aunque puede inducir una infección pulmonar antes de la sepsis10,11,12,13,14,15,16,17.
El modelo de ratón i.p. fue fundamental para evaluar la protección contra el desafío meningocócico10,11,12. El modelo de ratón de colonización meningocócica basada en la vía i.n. de la infección se ha desarrollado con ratones lactantes, ya que son más susceptibles a los meningococos, para reproducir una infección invasiva imitando el curso de la enfermedad meningocócica en humanos 13,14,15,16,17. Además, para promover la replicación meningocócica en el huésped murino, también se aplicó un número creciente de estrategias técnicas, incluida la administración del hierro a los animales para mejorar la infección, el uso de inóculobacteriano alto, cepa bacteriana pasada por ratón, así como el empleo de huéspedes animales lactantes o inmunocomprometidos10,13,15,18,19. La expresión de factores humanos específicos como CD4620 o transferrina21 ha aumentado la susceptibilidad de los ratones a esta bacteria del trópico humano; el empleo del modelo de infección de xenoinjerto de piel humana también ha sido útil para evaluar la capacidad de adhesión de los meningococos al endotelio humano22,23. Colectivamente, el reciente desarrollo de ratones transgénicos humanizados ha mejorado la comprensión de la patogénesis meningocócica y sus interacciones de huésped.
Anteriormente, desarrollamos un modelo murino de meningitis meningocócica donde la inoculación de bacterias se realizaba en la cisterna magna de ratones adultos con bacterias pasajeras de ratón24. Los parámetros clínicos y la tasa de supervivencia de los ratones infectados demostraron el establecimiento de meningitis con características comparables a las que se ven en el huésped humano, así como los análisis microbiológicos e histológicos del cerebro. De estos ratones infectados, las bacterias también se recuperaron de la sangre, el hígado y el bazo, y las cargas bacterianas de los órganos periféricos correlacionados con la dosis infecciosa. En particular, este modelo se empleó para evaluar la virulencia de una cepa mutante isogénica defectuosa en el transportador L-glutamato GltT24. Recientemente, utilizando nuestro modelo de ratón de meningitis meningocócica basado en i.cist. ruta con cepa serogrupo C 93/42862,24 y un mutante isogénico defectuoso en codificación de genes cssA para UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa25, hemos analizado el papel del ácido siálico expuesto en el establecimiento enfermedad en ratones.
En este protocolo, describimos un método sencillo para inducir meningitis meningocócica experimental basada en el i.cist. vía de infección en ratones adultos Balb/c. Este método es particularmente útil para la caracterización de la infección meningocócica en un huésped murino, así como para la evaluación de la virulencia entre cepas de referencia de tipo silvestre y mutantes isogénicos. La vía intracisternal de la infección asegura la entrega completa de los meningococos directamente en la cisterna magna, lo que a su vez facilita la replicación bacteriana en el líquido cefalorraquídeo (LCR) e induce meningitis con características que imitan a las presente en humanos2,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>1,8 Zócalo Criovial Con rosca externa</td><td>Starlab</td><td>E3090-6222</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Cónico de Polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>30 mm x 115 mm</td></tr><tr><td>Pinza Adson</td><td>F.S.T.</td><td>11006-12</td><td>Termo de alarma de acero inoxidable</td></tr><tr><td></td><td>TESTO</td><td>9000530</td><td></td></tr><tr><td>BactoTM Proteose Peptona</td><td>BD</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro Jeringa fina</td><td>BD</td><td>320837</td><td>U-100 Insulina</td></tr><tr><td>BD Jeringa Plastipak 1 mL 25 G 5/8 pulgadas</td><td>BD</td><td>300014</td><td>05 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>BD Plastipak jeringa 5 mL</td><td>BD</td><td>308062</td><td>07 mm x 30 mm</td></tr><tr><td>CABINA DE FLUJO LAMINAR VERTICAL BIOHAZARD AURA B</td><td>Bio Air s.c.r.l.</td><td>Aura B3</td><td></td></tr><tr><td>Biofotómetro</td><td>Eppendorf</td><td>Modelo #6131</td><td></td></tr><tr><td>Botella D</td><td>Tecniplast</td><td></td><td>D Graduado hasta: 400 mL, Volumen total 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm</td></tr><tr><td>C150 CO2 Carpeta para incubadora</td><td></td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>Cuerpo de jaula Eurostandard Tipo II</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td>267 x 207 x 140 mm3, Superficie 370 cm2</td></tr><tr><td>Placa de Petri de Cultivo Celular con Tapa</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Volumen de trabajo: 5 mL</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>Microcentrífuga 5415R</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta semi-micro L. Forma</td><td>Kartell S.p.A.</td><td>01938-00</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato di-Potásico trihidrato</td><td>Carlo erba</td><td>471767</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato di-Sódico anhidro ACS-para análisis</td><td>Carlo Erba</td><td>480141</td><td>g1000</td></tr><tr><td>Diete Certificado Estándar</td><td>Mucedola s.r.l.</td><td>4RF21</td><td>Pellet de alimento para animales</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont Hp 5 Acero inoxidable</td><td>F.S.T. by DUMONT</td><td>AGT5034</td><td>0,10 x 0,06 mm2 punta</td></tr><tr><td>Balanza electrónica</td><td>Gibertini</td><td>EU-C1200</td><td>Max 1200 g, d = 0,01 g, T = -1200 g</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubo de microcentrífuga Cerradura de seguridad Eppendorf</td><td></td><td>T3545-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-6376</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tijeras Bonn Extra Finas</td><td>F.S.T.</td><td>14084-08 Tapa de filtro de</td><td>acero inoxidable</td></tr><tr><td>(mini-aislador), H-Temp con abrazaderas de bloqueo</td><td>Tecniplast</td><td>1264C400SUC</td><td></td></tr><tr><td>GC base de agar</td><td>OXOID</td><td>CM0367</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Gillies 1 x2 dientes</td><td>F.S.T.</td><td>11028-15</td><td>Acero inoxidable</td></tr><tr><td>Glicerin RPE</td><td>Carlo Erba</td><td>453752</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>F.S.T.</td><td>11052-10</td><td>Ancho de la punta dentada: 0,8 mm</td></tr><tr><td>Tapa interior</td><td>Tecniplast</td><td>1264C116</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hierro dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8517-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Intervet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina de seguridad microbiológica BH-EN y BHG Clase II</td><td>Faster</td><td>BH-EN 2004</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 1,5 mL&nbsp;</td><td>MARCA</td><td>PP780751</td><td>tapón de rosca PP, grad</td></tr><tr><td>Pinza de manipulación del ratón</td><td>F.S.T.</td><td>11035-20</td><td>Caucho dentado; Superficie de agarre: 15 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Mucotit-F2000</td><td>MERZ</td><td>61846</td><td>2000 mL</td></tr><tr><td>Guantes de Látex</td><td>Natural Medica</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Classic C24 Incubadora Shaker</td><td>PBI international</td><td>C-24 Classic Incubadora de sobremesa Shaker</td><td></td></tr><tr><td>Petri PS Platos</td><td>VWR</td><td>391-0453</td><td>90 x 14,2 mm2</td></tr><tr><td>Pipetman Classic P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td>2-20 &mu; L</td></tr><tr><td>Pipetman Classic P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td>20-200 &mu; LL</td></tr><tr><td>Pipetman Classim P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>200-1.000 &mu; L</td></tr><tr><td>Polyvitox</td><td>OXOID</td><td>SR0090A Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de potasio</td><td>J.T. Baker Chemicals B.V.</td><td>0208</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno de potasio</td><td>J.T. Baker Chemicals B.V.</td><td>0240</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>PS Pinzas desechables</td><td>VWR</td><td>232-0191</td><td></td></tr><tr><td>Separador extraíble</td><td>Tecniplast</td><td>1264C812</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de fondo redondo</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>MOLEKULA 41272436</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retenedor de acero inoxidable y hoja filtrante de poliéster</td><td>Tecniplast</td><td>1264C</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estándar</td><td>F.S.T.</td><td>11000-12</td><td>Tijeras de</td></tr><tr><td>tenotomía Stevens</td> de acero inoxidable <td>F.S.T.</td><td>14066-11</td><td></td></tr><tr><td>Tijera quirúrgica de acero inoxidable - ToughCut</td><td>F.S.T.</td><td>14130-17</td><td>Guantes de</td></tr><tr><td>nitrilo desechables Stainless Touch N Tuff</td><td>Ansell</td><td>92-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Temperature (ULT) Haier</td><td></td><td>DW-86L288</td><td>Volumen = 288 L</td></tr><tr><td>Tijeras Wagner</td><td>F.S.T.</td><td>14070-12</td><td>Intervet</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>de<td>xilacina</td></tr> de acero inoxidable</tbody></table>

inducir meningitis meningocócica serogrupo c en ratones a través de parto intracisternal

Inducing Meningococcal Meningitis Serogroup C in Mice via Intracisternal Delivery

Neisseria meningitidis (meningococo) es un microorganismo de rango estrecho, reconocido mundialmente como la principal causa de meningitis bacteriana. El meningococo es un colonizador transitorio de la nasofaringe humana de aproximadamente el 10% del sujeto sano. En circunstancias particulares, adquiere una capacidad invasiva para penetrar la barrera mucosa e invade el torrente sanguíneo causando septicemia. En el último caso, la sepsis fulminante podría surgir incluso sin el consiguiente desarrollo de la meningitis. Por el contrario, las bacterias podrían multiplicarse mal en el torrente sanguíneo, cruzar la barrera hematoencefálica, alcanzar el sistema nervioso central, lo que conduce a la meningitis fulminante. Los modelos murinos de meningitis bacteriana representan una herramienta útil para investigar las interacciones huésped-patógeno y analizar los mecanismos patogenéticos responsables de esta enfermedad letal. Aunque se han evaluado varios sistemas modelo experimentales en las últimas décadas, ninguno de ellos fue capaz de reproducir los eventos patológicos característicos de la enfermedad meningocócica. En este protocolo experimental, describimos un procedimiento detallado para la inducción de la meningitis meningocócica en un modelo de ratón basado en la inoculación intracisternal de bacterias. Los signos peculiares de la meningitis humana se registraron en el huésped murino mediante la evaluación de parámetros clínicos (por ejemplo, temperatura, peso corporal), evaluación de la tasa de supervivencia, análisis microbiológico y examen histológico de lesiones cerebrales. Cuando se utiliza inóculo intracisternal (i.cist.), meningococci entrega completa directamente en cisterna magna, lo que conduce a una replicación meningocócica muy eficiente en el tejido cerebral. Se observa un aumento de 1.000 veces por el recuento viable de bacterias en aproximadamente 18 h. Por otra parte, los meningococos también se encuentran en el bazo, y el hígado de ratones infectados, lo que sugiere que el hígado puede representar un órgano diana para la replicación meningocócica.

Supervivencia de ratones infectados con N. meningitidis tipo salvaje y cepas mutantes isogénicas. Las cepas de Neisseria meningitidis utilizadas en estos resultados representativos son la cepa de referencia del serogrupo C 93/4286 (ET-37) y su mutante isogénico 93/4286-cssA obtenido mediante inactivación insercional del gen cssA, codificando para la UDP-N-acetilglucosamina 2-epimerasa, que se asigna en el locus de síntesis de cápsulas25. Para...

Aquí, describimos un método para inducir la meningitis meningocócica a través de una vía intracisternal de infección en ratones adultos. Presentamos un protocolo paso a paso de la infección meningocócica desde la preparación del inóculo hasta la infección intracisternal; luego registrar la supervivencia animal y evaluar las cargas bacterianas en los tejidos murinos.

Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal

Neisseria meningitidis (meningococcus) is a narrow-host-range microorganism, globally recognized as the leading cause of bacterial meningitis. ...

Neisseria meningitidis es una de las causas más comunes de sepsis y meningitidis entre la población humana de todo el mundo, y la bacteria está restringida al huésped humano. En este protocolo experimental, describiremos el procedimiento personalizado para la inducción de meningitis meningocócica en un modelo de ratón basado en la inoculación intracisternal de bacterias. Este modelo murino reprodujo los eventos patológicos característicos de la meningitis meningocócica como una enfermedad humana grave.Por lo tanto, representa una herramienta útil para evaluar la interacción huésped-patógeno y analizar el mecanismo patógeno responsable de esta enfermedad letal. El modelo de infección podría ser útil no sólo para evaluar la estrategia terapéutica innovadora para prevenir la replicación de bacterias directamente en el líquido cefarrestro, sino también para analizar la eficacia de la posible inmunoterapia pasiva contra patógenos humanos. La técnica requiere la fase de entrenamiento para garantizar el éxito no sólo del inóculo intracisterno, sino más bien en general la inducción de la enfermedad.Demostrando los procedimientos serán Roberta Colicchio y Chiara Pagliuca como investigadoras

inducing-meningococcal-meningitis-serogroup-c-mice-via-intracisternal

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Zamboni, M., et al., Inducción de la modificación de las células leptomeníngeas mediante inyección intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento de administración de un fármaco inductor en la cisterna magna de un ratón anestesiado. La inyección induce selectivamente la expresión de marcadores fluorescentes en las células de la superficie cerebral accesibles a través del líquido cefalorraquídeo, confirmado por imágenes de fluorescencia.

Administración dirigida de fármacos en un modelo de ratón mediante inyección de cisterna magna

En este video, demostramos la administración intracisternal de Neisseria meningitidis en un modelo de ratón para generar infección por meningitis.

Administración intracisternal de meningococos en modelos de ratón para inducir meningitis meningocócica

Este video muestra la inmunización intranasal con BCG en ratones, activando tanto las respuestas inmunitarias innatas como las adaptativas, lo que lleva al desarrollo de células T de memoria residentes en el pulmón y células B efectoras, mejorando así la protección contra las infecciones por Mycobacterium.

Inmunización intranasal con BCG en un modelo de ratón

Este video muestra el proceso de inyección intracerebroventricular para estudiar la distribución del citomegalovirus murino (MCMV) en el cerebro de ratón neonatal. El MCMV, diseñado para expresar una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) para mayor visibilidad, se inyecta en el ventrículo lateral del cerebro de un cachorro de ratón. El virus inyectado circula a través del líquido cefalorraquídeo, infectando las células de la región periventricular, incluida la zona marginal, el plexo...

Una inyección intracerebroventricular para analizar la distribución del citomegalovirus murino en el cerebro de un ratón neonatal

Este video muestra la generación de un modelo de ratón con una infección en el SNC. A una cría lactante se le inyecta el virus tanto por vía intracraneal como intraperitoneal. El virus se propaga, infectando el SNC causando la muerte de las células neuronales y la inflamación. El cachorro es evaluado para detectar síntomas de infección a medida que la enfermedad progresa.

Generación de un modelo murino con una infección del sistema nervioso central

Fuente: Li, D., et al. Inyección intratecal directa de virus adenoasociados recombinantes en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra el procedimiento para la inyección intratecal de virus adenoasociados (AAV) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ratón despierto, que cubre la preparación de la jeringa, la alineación de la columna vertebral y la inserción precisa de la aguja. Este método valida la administración de genes dirigidos, lo que respalda su potencial para las...

Administración intratecal de virus en un modelo de ratón para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central

Neisseria meningitidis es un patógeno específico humana que infecta a los vasos sanguíneos. En este protocolo microvasos humanos se introducen en un ratón mediante el injerto de piel humana en ratones inmunodeprimidos. Las bacterias se adhieren ampliamente a los vasos humanos, dando lugar a daño vascular y el desarrollo de la erupción purpúrica típicamente observado en casos humanos.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

En este trabajo detallamos la metodología seguida para comparar la eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar inducida por la inmunización intranasal y subcutánea con BCG en un modelo de ratón. Nuestros resultados muestran los beneficios de la vacunación pulmonar y sugieren un papel de la respuesta mediada por IL17 en la protección inducida por la vacuna.

La eficacia protectora y la respuesta inmune pulmonar tras la administración subcutánea e intranasal BCG en ratones

Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.

Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Describimos una inyección intracisternal que emplea una aguja doblada en la punta que se puede estabilizar en el cráneo, eliminando así el riesgo de daño al parénquima subyacente. El enfoque se puede utilizar para la cartografía genética del destino y manipulaciones de células leptomeningeales y para el seguimiento del movimiento del líquido cefalorraquídeo.

Inducción de células leptomeningeales Modificación a través de inyección intraciternal

Aprende a inducir meningitis meningocócica en ratones mediante inoculación intracisternal con Neisseria meningitidis. Este modelo reproduce los eventos patológicos de la enfermedad humana y permite evaluar interacciones huésped-patógeno.

Inducir meningitis meningocócica Serogrupo C en ratones a través de parto intracisternal

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