Name: Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a construir un modelo de artritis reumatoide en ratones con tasa de éxito superior al 93% usando células iNKT. Este método permite estudiar la patogénesis inmunológica y evaluar terapias celulares adoptivas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nuestro estudio fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (NSFC) (81771755), Colleges and university's key research project of Hebei province (ZD2017009) y el Animal Lab of Medical Experiment Center, Hebei University. Estamos agradecidos por su apoyo.

Todos los ratones experimentales (150 en total) eran ratones machosanos, de 6 a 8 semanas de edad (20,0 x 1,5 g), criados en un entorno específico libre de patógenos (SPF). No hay ningún tratamiento especial antes del modelado. El experimento se dividió en un grupo de control saludable (15 ratones), un grupo de control de modelos (15 ratones) y un grupo de terapia celular (55 ratones). Este estudio fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal y Etica de la Universidad de Hebei.
1. Construir el modelo de enfermedad
<ol><li>Duplicación del modelo animal RA<ol>
<li>Pesar 1,75 mg de fragmentos de hG6PI 325-339 y hG6PI 469-483 y disolverlos en 5,25 ml de agua destilada triple de 4oC.</li>
		<li>Disolver el adyuvante completo de Freund (CFA) en un baño de agua de 50 oC, dibujar 5,25 ml en otro tubo centrífugo de 10 ml y enfriarlo para su uso.</li>
		<li>Coloque la mezcla de solución hG6PI y solución cfA en una unidad de emulsión artificial con dos jeringas de vidrio conectadas.</li>
		<li>Empuje la jeringa a una velocidad y frecuencia constantes de 10–20 x por minuto para emulsionar completamente la solución de péptido mixto y la solución cfA. Realizar la operación en un baño de hielo, y mantener las gotas de emulsión en el agua durante 10 minutos después de la finalización de la emulsión sin dispersión.</li>
		<li>Inyectar 150 l de hG6PI emulsionados en la raíz de la cola del ratón por vía subcutánea.</li>
		<li>Inyectar 200 mg de toxina de la tos ferina en el ratón por vía intraperitoneal a 0 h y 48 h después de la inyección de hG6PI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verificación experimental del modelo RA<ol>
<li>Mida el grosor de la pata del ratón con una pinza Vernier (2 veces al día).</li>
		<li>Observar y marcar el grado de enrojecimiento e hinchazón del pie. Utilice los siguientes criterios de puntuación: 1) dedos de los dedos con hinchazón leve; 2) pedis de dorsum y almohadilla para el pie con hinchazón roja clara; 3) tobillo con hinchazón roja.</li>
		<li>Eutanasia a los ratones bajo anestesia profunda mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg de peso corporal) 14 días después del modelado y retire las patas para la tinción HE.</li>
		<li>Determinar los niveles de secreción de suero IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-o, e IFN-o utilizando un ensayo de matriz de cuentas citométricas comerciales (CBA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Obtención de células iNKT con terapia celular adoptiva
<ol><li>Inducción direccional de células iNKT<ol>
<li>Inyectar ratones normales por vía intraperitoneal con el valor de "GalCer" (0,1 mg/kg de peso corporal).</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de células iNKT<ol>
<li>Tres días después del modelado, inyectar ratones por vía intraperitoneal con un 1% de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal) para la anestesia. Los ratones anestesiados adecuadamente no muestran una respuesta de abstinencia de pata trasera a un pellizco del dedo del pies.</li>
		<li>Aísle el bazo de un ratón DBA/1 después de inyectarlo por vía intraperitoneal con el galCer. Preparar una suspensión de una sola célula cortando y moliendo el bazo en un tamiz de malla 200.</li>
		<li>Lave la suspensión celular con PBS, centrífuga a 200 x g durante 5 min y deseche el sobrenadante. Repetir.</li>
		<li>Resuspender las células con 1 ml de solución de dilución de sangre y tejido entero. Añadir 3 ml de medio de separación de linfocitos de ratón, y luego centrifugar las células durante 20 min a 300 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Recoger la capa de linfocitos blancos lechosos (es decir, la segunda capa de la parte superior), lavarla 2 veces con PBS, y contar con un contador de células automatizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Clasificación de células activadamagnéticas magnéticas (MACS)Estrategia de selección positiva para la purificación de células iNKT NOTA: Para el pretratamiento de los tetrámeros CD1d, se diluyó 1 mg/ml de la galcer a 200 g/ml con un 0,5% de Tween-20 y un 0,9% de NaCl, y 5 ml de la solución resultante a 100 ml de la solución de tetrámero CD1d. La mezcla se incuba durante 12 h a temperatura ambiente y se colocó a 4oC para su uso. El TCR se diluyó 80veces con agua desionizada. Todos los demás anticuerpos se utilizaron como solución de stock.<ol>
<li>Resuspenda 107 células con 100 oC de PBS de 4 oC, agregue 10 sL de Tetramer-PE CD1d cargado con GalCer e incubarlas a 4 oC durante 15 minutos en la oscuridad.</li>
		<li>Lavar las células 2veces con PBS y resuspenderlas en 80 sL de PBS.</li>
		<li>Añadir 20 s de anti-PE-MicroBeads e incubarlos a 4 oC durante 20 minutos en la oscuridad.</li>
		<li>Lávelos 2 veces con PBS y resuspenda las células con 500 ml de PBS.</li>
		<li>Coloque la columna de clasificación en el campo magnético de la clasificadodora MACS y enjuague con 500 ml de PBS.</li>
		<li>Agregue la suspensión de celda del paso 2.3.4 a la columna de ordenación, recopile el flujo a través y enjuague 3x con búfer PBS.</li>
		<li>Retire el campo magnético y recoja las celdas de la columna de clasificación. En este punto, agregue 1 ml de búfer PBS a la columna de clasificación y empuje rápidamente el émbolo a una presión constante para conducir las celdas etiquetadas al tubo de recolección y obtener células iNKT purificadas. Cuente con un contador de celdas automatizado.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificación del fenotipo celular iNKT<ol>
<li>Tome 1 x 106 células de los pasos 2.2.5 y 2.3.7, respectivamente, y resuspenda en 50 l de PBS.</li>
		<li>Incubación de anticuerpos: No añada el anticuerpo al tubo de control negativo, añada 0,5 ml de Tetramer de GalCer-PE-CD1d o 10 ml de FITC-TCR en el tubo de control positivo único. Añadir 0,5 ml de tetrámero de la galcer-PE-CD1d y 10 ml de FITC-TCR en el tubo de muestra. Incubarlos a 4oC durante 30 min en la oscuridad.</li>
		<li>Lavar las células en PBS y luego centrifugar a 200 x g durante 5 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml de Foxp3 Foxation/Permeabilization solución de trabajo, e incubar las células durante 45 minutos a 4 oC en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir 1 ml de 1x solución de trabajo Tampón de permeabilización y centrifugar las células a temperatura ambiente durante 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
		<li>Descarta el sobrenadante. Añadir 1 l de ratón Anti-PLZF de Alexa Fluor 647 y 1 l de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-T-bet (o 1 l de PerCP-Cy 5.5 mouse anti-ROR-t) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
		<li>Añadir a 2 mL de solución de trabajo de tampón de permeabilización para la limpieza.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante, resuspenda las células en 500 s de PBS y mida por citometría de flujo.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificación funcional de células iNKT<ol>
<li>Tome 3 x 106 células iNKT del paso 2.3.7 y resuspenda en 12 placas de pozo con 1,5 ml de medio incompleto RPMI-1640 (es decir, sin suero).</li>
		<li>Añadir éster de phorbol (PMA, 50 ng/mL) y calcio de ionomicina (IO, 1 g/ml) y colocar en una incubadora deCO2 durante 24 h.</li>
		<li>Recoger el sobrenadante celular y detectar los niveles de secreción de IL-2, IL-17A, TNF-, IL-6, IL-4, IFN-o, e IL-10 utilizando un ensayo comercial CBA de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Estudio experimental sobre la vía migratoria de células iNKT en ratones RA<ol>
<li>Disolver el tinte DiR (2,5 mg/ml) en DMSO.</li>
		<li>Resuspenda las células iNKT en 6 placas de pozo con medio incompleto RPMI-1640. La densidad es de 1 x 106 celdas/ml.</li>
		<li>Añadir la solución diR (5 g/mL) e incubar en una incubadora de CO2 durante 25 min.</li>
		<li>Lavar con PBS y resuspender las células (3 x 106/300 l) para obtener células iNKT etiquetadas con DiR (DiR-iNKT).</li>
		<li>Inyectar un 1% de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal para anestesiar a los ratones. Los ratones anestesiados adecuadamente no muestran una retirada de la pata trasera hasta pellizcar el dedo del dedo del pies. Aplique pomada veterinaria en los ojos del ratón para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia para la toma de imágenes.</li>
		<li>Inyectar células DiR-iNKT 3 x 106 por ratón en la vena de la cola con el modelo RA durante 8 días. Supervise las células iNKT en ratones después de la inyección durante 0 min, 10 min, 30 min, 60 min y día 0 (después de 3 h), 1, 3, 6, 12, 26, 34, 38 y 42 días utilizando un pequeño sistema de imágenes in vivo animal (IVIS). La longitud de onda de excitación utilizada era de 748 nm, la longitud de onda de emisión era de 780 nm y el tiempo de exposición era automático.</li>
		<li>Coloque cada ratón en una jaula separada después de cada observación y mantenga la recumbencia esternal. Observar hasta la recuperación de la anestesia.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Evaluación de la Inmunoterapia Adoptiva de Ratones RA con Células iNKT
<ol><li>inmunoterapia adoptiva de células iNKT para ratones RA<ol>
<li>Inyectar 3 x 106 células iNKT células por ratón a través de la vena de la cola. Seleccione aleatoriamente 15 ratones que fueron modelados 8 días antes y obtenga células iNKT sin etiquetado DiR del paso 2.3.7 por la infusión de la vena de la cola.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluar la eficacia de la inmunoterapia adoptiva para células iNKT.<ol>
<li>Mida el grosor de la pata del ratón, cuantifique la hinchazón de la articulación del tobillo y puntúe sistemáticamente después de la perfusión de células iNKT como se describe en los pasos 1.2.1–1.2.2.</li>
		<li>Observe la infiltración de células inflamatorias y los cambios articulares de las articulaciones del ratón como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Determinar los niveles de secreción de IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-o, e IFN-o como se describe en el paso 1.2.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine la frecuencia de las celdas y subconjuntos iNKT.<ol>
<li>Aísle el timo del ratón y prepare una suspensión de una sola célula.</li>
		<li>Separe los linfocitos con líquido de separación de linfocitos.</li>
		<li>Determine la frecuencia de celda iNKT y la frecuencia de los subgrupos como se describe en el paso 2.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis estadístico NOTA: Todos los datos se presentan como medias : Valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.<ol>
<li>Utilice el análisis de un factor de varianza (ANOVA). Si se cumple la varianza, utilice la prueba LSD para una comparación adicional.</li>
		<li>Si la varianza no es uniforme, utilice la prueba no paramétrica. Utilice la prueba Kruskal-Wallis H para una comparación adicional31.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+environment%2C+geo-epidemiology%2C+and+autoimmune+disease%3A+Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis.</a> Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0-14 (2010).</li>
<li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+rheumatoid+arthritis%3A+estimates+from+the+Global+Burden+of+Disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).</li>
<li>Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+neuroimunomodulation+to+bioelectronic+treatment+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectronics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis.</a> Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Bianca, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Natural+Killer+T-Cells+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Unraveling Natural Killer T-Cells Development.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1950(2018).</li>
<li>Mitsuo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+CD161%2BCD8%2B+T+cells+in+the+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases.</a> Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).</li>
<li>Miellot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+invariant+NK+T+cells+protects+against+experimental+rheumatoid+arthritis+by+an+IL-10-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway.</a> European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).</li>
<li>Miellot-Gafsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+activation+of+invariant+natural+killer+T+cells+in+a+rheumatoid+arthritis+model+and+application+to+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment.</a> Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).</li>
<li>Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+invariant+natural+killer+t-cell+deficiency+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).</li>
<li>Ming, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+immunoregulation+of+iNKT+cells+in+RA+by+novel+synthetic+immunostimulator+CH1b%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b.</a> Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).</li>
<li>Ming, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+correlation+between+the+percentage+of+iNKT+cells+and+the+ratio+of+IFN-%CE%B3%2FIL-4+in+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Microbiology+Immunology%22%5BJournal%5D)">Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis.</a> Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).</li>
<li>Sharif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+natural+killer+T+cells+by+%CE%B1-galactosylceramide+treatment+prevents+the+onset+and+recurrence+of+autoimmune+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes.</a> Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).</li>
<li>Gapin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+invariant+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Development of invariant natural killer T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).</li>
<li>Kwon, D. I., Lee, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+Differentiation+Program+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Network%22%5BJournal%5D)">Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells.</a> Immune Network. 17 (6), (2017).</li>
<li>Thapa, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differentiation+of+ROR-%CE%B3t+expressing+iNKT17+cells+is+orchestrated+by+Runx1%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7018(2017).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focuson+interferon-%CE%B3%5BTitle%5D)+AND+%22Interferon+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ.</a> Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).</li>
<li>Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cost-effectiveness+A+systematic+review+and+stepwise+approach+for+selecting+a+transferable+health+economic+evaluation+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacoeconomics%22%5BJournal%5D)">How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis.</a> Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).</li>
<li>Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+T+cell-dependent+peripheral+polyarthritis+in+genetically+unaltered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice.</a> Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).</li>
<li>Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+B-cell-dependent+chronic+arthritis+with+glucose-6-phosphate+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%2C+Therapy%22%5BJournal%5D)">Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase.</a> Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).</li>
<li>Kamradt, T., Schubert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+clinical+implications+of+G6PI+in+experimental+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%2C+Therapy%22%5BJournal%5D)">The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).</li>
<li>Horikoshi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Invariant+NKT+Cells+with+Glycolipid+Ligand+%CE%B1-Galactosylceramide+Ameliorates+Glucose-6-Phosphate+Isomerase+Peptide-Induced+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PlosOne%22%5BJournal%5D)">Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis.</a> PlosOne. 7 (12), 51215(2012).</li>
<li>Zhang, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+mixed+peptides+derived+from+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+rheumatoid+arthritis+in+DBA+%2F1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice.</a> Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).</li>
<li>Motohashi, S., Nakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cell-based+immunotherapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer.</a> Immunotherapy. 1 (1), 73(2017).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+of+natural+killer+T-cells+in+tolerogenic+APCs-mediated+suppression+of+collagen-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis.</a> Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).</li>
<li>Luc, V. K., Lan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Potential+of+Invariant+Natural+Killer+T+Cells+in+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+collagen-induced+arthritis+by+natural+killer+T+cell+activation+with+OCH%2C+a+sphingosine-truncated+analog+of+%CE%B1-galactosylceramide%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis%2C+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide.</a> Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).</li>
<li>Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+invariant+natural+killer+t-cell+deficiency+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).</li>
<li>Bruns, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+an+immunodominant+self-peptide+derived+from+glucose-6-phosphate+isomerase+induces+arthritis+in+DBA%2F1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research%2C+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice.</a> Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).</li>
<li>Parietti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+treatment+overcomes+reduction+of+regulatory+iNKT+cells+in+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis.</a> Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).</li>
<li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mechanism%28s%29+of+the+inhibition+of+disease+progression+by+combination+treatment+with+fingolimod+plus+pathogenic+antigen+in+a+glucose-6-phosphate+isomerase+peptide-induced+arthritis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biological%2C+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model.</a> Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+adoptive+immunotherapy+on+rheumatoid+arthritis+with+Thymus-derived+invariant+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells.</a> International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).</li>
</ol>

Los autores no declaran financiación ni conflictos de intereses.

Las células iNKT son células T especiales que unen inmunidad innata y adaptativa y se desarrollan principalmente a partir de CD4++/ CD8+ timocitos. Las células iNKT tienen diversas funciones inmunorreguladoras e interactúan con otras células inmunitarias por contacto directo y secreción de diferentes citoquinas23,afectando a las células dendríticas (CC), macrófagos, neutrófilos, células B, células T y diferenciación y desarrollo de células NK<sup class...

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por una invasividad crónica progresiva con incidencia de 0,5-1%1,2. La patogénesis subyacente se atribuye a la proliferación anormal de células autoreactivas CD4+ y CD8+ T, manifestadas por un aumento en la proporción de células CD4+IFN-+ y CD4+IL-17A+ T, y el número reducido de células CD4+IL-4+ y CD4+CD25+FoxP3+ T. Por lo tanto, la secreción de citoquinas inflamatorias se incrementa, y una reacción inflamatoria excesiva destruye el equilibrio nativo y la función de tolerancia del sistema inmunológico del cuerpo. Además, las células auxiliares del linfocito T (Th) 1 que penetran en la articulación agravan la respuesta inflamatoria y el daño articular. Por lo tanto, la inhibición de la respuesta inflamatoria excesiva y la restauración de la tolerancia inmune y el equilibrio inmune son clave para el tratamiento de RA3,4.
Las celdas iNKT tienen funciones y características de células NK y células T. Las células iNKT albergan una cadena distinta e invariable de receptor de células T (TCR) con repertorios limitados de cadena TCR5 y reconocen el antígeno glucólido presentado por la molécula CD1d del complejo de histocompatibilidad principal (MHC) CD1d en la superficie de las células que presentan antígenos. 6 detectó un gran número de células iNKT y defectos funcionales en muchas enfermedades autoinmunes, incluida la AR. 7demostraron que las células iNKT tienen un efecto positivo en el mantenimiento de la tolerancia autoinmune y que cuando se restaura el número y la función de las células iNKT, la enfermedad se alivia. Además, Miellot-Gafsou et al.8 encontraron que las células iNKT no sólo abrogaron la enfermedad, sino que también aumentaron la progresión de la enfermedad. Estos resultados contradictorios sugieren que las células iNKT son células T heterogéneas, y la función de diferentes subconjuntos puede revertirse. En un estudio clínico de AR, la frecuencia de las células iNKT se correlacionó con la puntuación de la actividad de la enfermedad9. Los resultados también confirmaron que la frecuencia de iNKT se redujo en pacientes con AR, el número de subconjuntos de células CD4+IFN +T aumentó, y los niveles secretores de citoquinas inflamatorias IFN-o y TNF-o aumentaron10,11. Además,12 investigaron la diabetes tipo 1 (T1D) y encontraron que la infusión selectiva de células iNKT reguló la expresión de la citoquina inflamatoria IL-4, mantuvo la tolerancia inmune y presionó el desarrollo de la diabetes tipo 1. Por lo tanto, la infusión adoptiva de células iNKT específicas o la activación dirigida de células iNKT aumenta el nivel de células iNKT en pacientes con AR, lo que puede ser un avance en el tratamiento con AR.
La inmunoterapia celular es actualmente de gran interés y ha sido ampliamente utilizada en la terapia contra el cáncer. Sin embargo, las células iNKT son células inmunorreguladoras heterogéneas raras (sólo 0,3% del número total de PBMC)13,lo que limita las posibles aplicaciones clínicas. Estas células se dividen principalmente en tres subpoblaciones: 1) células iNKT1, que tienen una alta expresión de la leucemia promielocítica proteína zinc-dedo (PLZF) y factor de transcripción T-caja (T-bet); 2) células iNKT2 con expresión intermedia de PLZF y proteína de unión GATA 3 (GATA3); 3) células iNKT17 con baja expresión de PLZF y receptor nuclear huérfano (ROR) relacionado con retinoides- que secretan IFN-, IL-4 e IL-1714. Las células iNKT activadas secretan citoquinas similares a Th1, Th2 y Th17, que determinan los diferentes efectos inmunomoduladores de las células iNKT15. Los efectos inmunomoduladores e inmunoterapéuticos de la activación específica de varias subpoblaciones de células iNKT son diferentes. Por lo tanto, la selección de fenotipos específicos de células iNKT (principalmente iNKT2) con funciones antiinflamatorias para regular la respuesta inmune del cuerpo puede corregir el desequilibrio inmune y los trastornos inmunológicos en la AR.
El establecimiento de un modelo animal ideal es de gran importancia para el tratamiento y estudio de la patogénesis de la AR. Actualmente, los modelos animales más comúnmente utilizados y maduros incluyen artritis inducida por colágeno, artritis adyuvante, artritis inducida por cimosa, y artritis inducida por polisacáridos16–17. Sin embargo, no hay ningún modelo que pueda simular completamente todas las características de la RA humana. La artritis inducida por colágeno tipo II (CIA) es un modelo clásico de artritis. La CIA es inducida por la inmunización de ratones con anticuerpos monoclonales específicos para colágeno tipo II, lo que refleja la dependencia de anticuerpos de este modelo de enfermedad. Describió un modelo con una respuesta inmune sistémica a la isomerasa de glucosa-6-fosfato (G6PI), que induce la poliartritis simétrica periférica en cepas de ratón susceptibles18,19. En este modelo, el desarrollo de la artritis depende de las células T, células B, e inmunidad innata18,19,20. Horikoshi21 encontró que los modelos de RA resultantes de la inmunización de ratones DBA/1 con fragmentos de polipéptidos G6PI son más similares a la RA humana en términos de células CD4+ T y citoquinas (es decir, IL-6 y TNF)) que los modelos de la CIA. Con el fin de aumentar el efecto estimulante en el sitio de reconocimiento TCR, los fragmentos de polipéptidos mixtos de G6PI (hGPI325-339 y hGPI469-483) se utilizaron para inmunizar ratones DBA/1 para construir el modelo de ratón RA. La tasa de éxito de este enfoque puede ser alta porque hGPI325-339 y hGPI469-483 son inmunodominantes para las respuestas de células T restringidas a Q-A. Por lo tanto, este modelo puede simular la sobreproliferación de células CD4+ T y defectos celulares iNKT en pacientes con AR22. La investigación básica de la inmunopatología de la AR sentó las bases para nuestra investigación más profunda.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Ratón Anti-PLZF</td><td>BD</td><td>563490</td><td>América</td></tr><tr><td>Anti-PE MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>Alemania</td></tr><tr><td>Columnas</td><td>Miltenyi</td><td>MS</td><td>Alemania</td></tr><tr><td>Centrífuga criogénica</td><td>Beckman</td><td>Allegra&reg; X-15R</td><td>America</td></tr><tr><td>DiR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D12731</td><td>America</td></tr><tr><td>Embedding Center</td><td>Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd.</td><td>BMJ-1</td><td>China</td></tr><tr><td>FITC Hamster Anti-Ratón TCR y beta; Cadena</td><td>BD</td><td>553170</td><td>America</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td>America</td></tr><tr><td>Adyuvante completo de Freund</td><td>Sigma</td><td>F5881</td><td>America</td></tr><tr><td>hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML)</td><td>Karebay Biochem</td><td>18062202</td><td>China</td></tr><tr><td>hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT)</td><td>Karebay Biochem</td><td>18062203</td><td>China</td></tr><tr><td>Sistema de imágenes in vivo</td><td>PerkinPinza Elmer</td><td>IVIS lumina II</td><td>América</td></tr><tr><td>Ionomicina Calcio</td><td>Caimán 10004974</td><td></td><td>América</td></tr><tr><td></td><td>KRN7000 AdipoGen</td><td>AG-CN2-0013</td><td>América</td></tr><tr><td>Ratón CD1d Tetrámero-PE</td><td>MBL</td><td>TS-MCD-1</td><td>Japón</td></tr><tr><td>Ratón Percoll</td><td>Solarbio</td><td>P8620</td><td>China</td></tr><tr><td>Microscopio óptico</td><td>Olympus</td><td>Olympus-II</td><td>Japón</td></tr><tr><td>PerCP-CyTM5.5 Ratón anti-ROR-&upsih; t</td><td>BD</td><td>562683</td><td>America</td></tr><tr><td>PerCP-CyTM5.5 Ratón anti-T-bet</td><td>BD</td><td>561316</td><td>América</td></tr><tr><td>Toxina de la tos ferina</td><td>Sigma</td><td>P7208</td><td>América</td></tr><tr><td>Ésteres de forbol</td><td>Caimán</td><td>10008014</td><td>América</td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>BD</td><td>555899</td><td>América</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Industrias Biológicas</td><td>01-100-1ACS</td><td>Israel</td></tr><tr><td>Kit de citoquinas Th1/Th2/Th17</td><td>BD 560485</td><td></td><td>America</td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>Leica Leica</td><td>EM UC6</td><td>Alemania</td></tr></tbody></table>

inmunoterapia adoptiva de células inkt en ratones ra inducidos por glucosa-6-fosfato (g6pi)

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune inflamatoria crónica compleja. La patogénesis de la enfermedad está relacionada con células T (iNKT) asesinas naturales invariables. Los pacientes con AR activa presentan menos células iNKT, función celular defectuosa y polarización excesiva de Th1. En este estudio, se estableció un modelo animal de RA utilizando una mezcla de péptidos hGPI325-339 y hGPI469-483. Las células iNKT se obtuvieron por inducción in vivo y purificación in vitro, seguida de perfusión en ratones RA para inmunoterapia adoptiva. El seguimiento del sistema de imágenes in vivo (IVIS) reveló que las células iNKT se distribuyeron principalmente en el bazo y el hígado. El día 12 después de la terapia celular, la progresión de la enfermedad se desaceleró significativamente, los síntomas clínicos se aliviaron, la abundancia de células iNKT en el timo aumentó, la proporción de iNKT1 en el timo disminuyó, y los niveles de TNF-, IFN-o, y IL-6 en el suero disminuyó. La inmunoterapia adoptiva de las células iNKT restauró el equilibrio de las células inmunitarias y corrigió la inflamación excesiva del cuerpo.

La puntuación del índice de artritis y el grosor de la pata aumentaron después del modelado. En comparación con el grupo de control, los dedos del grupo modelo RA comenzaron a mostrar hinchazón roja a los 6 días después del modelado, con agravamiento gradual. A los 14 días, la hinchazón roja en la articulación del tobillo alcanzó su punto máximo, seguido de un alivio gradual. El grosor de la pata cambió de forma similar (P &lt; 0.05) (Figura 1).
La infilt...

Este protocolo utiliza péptidos mixtos G6PI para construir modelos de artritis reumatoide que están más cerca de la artritis reumatoide humana en células CD4+ T y citoquinas. Células T asesinas naturales invariables de alta pureza (principalmente iNKT2) con fenotipos y funciones específicas se obtuvieron mediante inducción in vivo y purificación in vitro para inmunoterapia adoptiva.

Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

Nuestro protocolo describe un método para crear un modelo de RA. Su tasa de éxito es superior al 93 por ciento y su patogénesis depende de las células T, las células B y la inmunidad innata, lo que permite a los investigadores estudiar mejor la patogénesis de la AR desde una perspectiva inmune global. Luego utilizamos células INKT con efectos inmunomoduladores para su tratamiento.Las células INKT tienen un buen efecto en el tratamiento mediante la introducción in vivo que proporcionan soporte de datos básicos para la aplicación clínica de células INKT y realmente explotan el valor de aplicación clínica de las células INKT. La mayor ventaja de esta tecnología es que es fácil de operar y fácil de copiar. Demostrando el procedimiento serán Chen Shengde, Gao Xiang y Zhang Jingnan, estudiante graduado de mi laboratorio.Para empezar, pesa 1,75 miligramos de fragmentos HGPI325 a 339 y HGPI469 a 483 y disuelve en 5,25 mililitros de 4 grados centígrados de agua triple destilada. Disolver el adyuvante completo de Freund en un baño de agua Celsius de 50 grados. Dibuje 5,25 mililitros en otro tubo centrífugo de 10 mililitros y enfríelo para su uso.Coloque la mezcla de la solución HG6PI y la so

adoptive-immunotherapy-inkt-cells-glucose-6-phosphate-isomerase-g6pi

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Retardada de hipersensibilidad (DTH) es una reacción inflamatoria mediada por CCR7-T de memoria efectora (TEM) de linfocitos. Aquí se demuestra cómo activar antígenos específicos de células TEM, inducir DTH adoptivos en ratas Lewis y controlar la respuesta inflamatoria.

Inducción y Seguimiento de Adopción de hipersensibilidad retardada en ratas

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de...

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Este video ilustra un método para aislar células T asesinas naturales invariantes, también conocidas como células iNKT. El procedimiento comienza con la inyección de un glicolípido sintético en un ratón para estimular la activación y proliferación de las células iNKT en el bazo. Posteriormente, se preparan suspensiones unicelulares a partir del bazo y se incuban con complejos de reconocimiento de células iNKT marcados con fluoróforos, seguidos de una separación basada en perlas magnéticas, para...

Aislamiento de linfocitos T asesinos naturales invariantes de un modelo de ratón

Este video muestra un método basado en imágenes para visualizar células beta trasplantadas que expresan luciferasa en un ratón diabético inmunodeficiente no obeso. La introducción de esplenocitos de un ratón diabético conduce a la destrucción progresiva de las células beta, confirmada visualmente por la disminución de la luminiscencia después de la introducción del sustrato.

Obtención de imágenes de células beta transgénicas en un ratón inmunodeficiente desafiado con esplenocitos diabéticos

Proporcionamos un método reproducible para inducir la diabetes tipo 1 (DM1) en ratones dentro de dos semanas por la transferencia adoptiva de células del islote T específicas de antígeno, células CD4 + primarias.

Tipo 1 Diabetes inducción acelerada en ratones por transferencia adoptiva de células CD4 + células T diabetogénico

Presentamos aquí un método para desarrollar células T reguladoras (Tregs) específicas de antígeno funcional (Ag) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) para la inmunoterapia de la artritis autoinmune en un modelo murino.

Desarrollo de derivados de células madre Las células T reguladoras específicas de antígeno contra la autoinmunidad

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.

Estereotáctica transferencia adoptiva de células inmunes citotóxicas en modelos murinos de xenoinjertos de Glioblastoma Multiforme de Orthotopic humanos

El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.

Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior

El primate no humano (NHP) es un modelo ideal para estudiar la terapéutica celular de la retina humana debido a las similitudes anatómicas y genéticas. Este manuscrito describe un método para el trasplante submacular de células epiteliales pigmentarias de la retina en el ojo NHP y estrategias para prevenir las complicaciones intraoperatorias asociadas con la manipulación macular.

Trasplante de epitelio pigmentario retiniano en un modelo de primate no humano para enfermedades degenerativas de la retina

Este protocolo describe un método sencillo y mínimamente invasivo para trasplantar e imágenes de células NIT-1 en ratones inmunodeficientes combinados diabéticos no obesos (NOD) graves desafiados con esplenocitos purificados de ratones NOD espontáneamente diabéticos.

Monitorización bioluminiscente de la supervivencia del injerto en un modelo de transferencia adoptiva de diabetes autoinmune en ratones

Aquí, presentamos un protocolo que establece un modelo de ratón con artritis reumatoide (AR) a través de la transferencia adoptiva de células T CD4+ de ratones SKG, proporcionando una herramienta experimental rápida y confiable para investigar los mecanismos inmunológicos, la progresión patológica y el desarrollo de nuevos tratamientos para la AR.

Un modelo adoptivo de transferencia de artritis reumatoide en ratones

Aprende a construir un modelo de artritis reumatoide en ratones con tasa de éxito superior al 93% usando células iNKT. Este método permite estudiar la patogénesis inmunológica y evaluar terapias celulares adoptivas.

Inmunoterapia adoptiva de células iNKT en ratones RA inducidos por glucosa-6-fosfato (G6PI)

Explorar más videos