Disección, cultivo y análisis de células de cresta neural craneal primarias de ratón para el estudio de la delaminación y migración de células de cresta neuronal

Este protocolo describe la disección y el cultivo de células de la cresta neural craneal a partir de modelos de ratón, principalmente para el estudio de la migración celular. Describimos las técnicas de imagen en vivo utilizadas y el análisis de la velocidad y los cambios en la forma celular.

Este protocolo bien definido analiza la migración de la cresta neural primaria en mamíferos. Utilizamos la migración de cresta neural primaria para estudiar los defectos congénitos que afectan la cresta neural. Este enfoque nos permite echar un vistazo más de cerca a las células de la cresta neural a medida que emergen de la placa neural.

Las pruebas para detectar comportamientos celulares en tejidos portadores de genes mutantes atractivos o después del tratamiento farmacéutico, permiten realizar pruebas de salud para detectar los efectos del tratamiento farmacológico o cambios ambientales durante el desarrollo embrionario. Un enfoque similar se puede utilizar para estudiar las células de la cresta neural que migran al corazón o al intestino o para estudiar las células tumorales metastásicas. Adivinar la anatomía de la derecha del embrión es un reto.

Sus tejidos cambian muy rápidamente durante el desarrollo temprano. Sugerimos practicar la microdisección antes de emprender un gran experimento. Debido a que los embriones están vivos y tridimensionales, la velocidad y la precisión son cruciales.

En el día embrionario 8.5, utilice herramientas y soluciones estériles para cosechar el útero en un recipiente de PBS helado. Corte el mesometrio para separar cada embrión. Disecciona el útero cuidadosamente, separando cada hinchazón decidual.

La cosecha del embrión en la etapa de desarrollo adecuada es fundamental para reducir la variabilidad y aumentar el éxito en la adhesión del explant a la matriz, así como la migración celular. Deslice los fórceps entre la capa muscular y el tejido decidual del embrión y utilice un segundo par de fórceps para eliminar la capa muscular. Utilice los fórceps para perforar la decidua en los bordes del tirón mesometrial y utilice el segundo par de fórceps para desgarrar el tejido perpendicularmente al tirón.

Pelar hacia atrás el tejido decidual con los fórceps para visualizar la membrana ricarts antes de retirar cuidadosamente la membrana. La yema visceral se hará visible y el embrión se observará en su interior. Retire el chirrido visceral y el anión, y coloque el embrión para permitir la visualización del pliegue de la cabeza.

Corte el pliegue de la cabeza por encima del corazón y raspe el mesodermo subyacente para obtener una placa neural limpia. Los bordes de la placa neural deben diseccionarse. Usando una pipeta Pasteur de vidrio, transfiera la placa neural diseccionada a un plato recubierto de hidrogel lleno de medio de cresta neural acondicionado y gire suavemente el plato para colocar la placa neural en el centro del pozo.

A continuación, incubar la placa neural a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono durante el período de tiempo experimental adecuado. A las 24 horas después de la explantación, coloque el plato de cultivo de tejido en el soporte de la muestra de un microscopio de contraste facial, y pegue la tapa de la placa y la aguja de dióxido de carbono para evitar que se tiemble durante la adquisición de varios pozos. Luego concéntrese en las células de la cresta neural craneal a un aumento de 10 veces con un anillo de fase coincidente en el condensador seleccionado.

Para cuantificar la capacidad migratoria de la célula de la cresta neural, configure el microscopio para adquirir un fotograma cada cinco minutos a un aumento de 10 veces. Para cuantificar la morfología celular, configure el microscopio para adquirir un fotograma por minuto a un aumento de 40 veces. Para cuantificar la dinámica de lamellipodia, configure el microscopio para que adquiera un fotograma cada 10 segundos durante 10 minutos a un aumento de 40 veces.

Para la toma de imágenes de varios pozos, establezca la etapa mecánica para moverse entre las posiciones de interés X, Y seleccionadas y confirme que las células de la cresta neural craneal están enfocadas y que las posiciones de etapa son correctas. A continuación, haga clic en adquirir para iniciar la imagen de lapso de tiempo. Para el seguimiento de una sola celda, abra la imagen J e importe los datos como archivos de pila tiff.

Cambie la orientación y los niveles de brillo y contraste y haga clic en analizar y establecer la escala para calibrar los archivos de punto stk en micrómetros de píxeles de acuerdo con la configuración del microscopio. Haga clic en plug-ins, seguimiento y seguimiento manual para abrir el plugin de seguimiento manual de celdas de la imagen J y seleccione Agregar pista para comenzar el seguimiento de celdas. A continuación, realice un seguimiento de las células a través de todos los fotogramas de películas de lapso de tiempo utilizando el núcleo como punto de referencia.

Para evaluar la capacidad migratoria de la cresta neural, abra un programa de software de análisis de migración adecuado y haga clic en la pestaña Importar datos para importar los datos de seguimiento de celdas como un archivo txt de punto. En Conjuntos de datos e inicialización, seleccione el número de sectores o fotogramas que desea analizar y establezca la calibración X Y y el intervalo de tiempo entre fotogramas. Seleccione Aplicar configuración para guardar la configuración.

A continuación, seleccione el símbolo de datos de trazado para formar trazados de trayectoria y seleccione el símbolo estadístico para cuantificar las medidas de distancia y velocidad. Para cuantificar el área de la celda de la cresta neural y la circularidad, abra la imagen J y, en analizar y establecer mediciones, haga clic para seleccionar los parámetros de forma de celda, el área de celda, el perímetro y el descriptor de forma. Utilice la herramienta de selección manual para dibujar manualmente un contorno alrededor de cada celda utilizando los límites de la membrana celular como guía.

Presione las teclas Control+B en el teclado para mantener la superposición de contorno de celda en la imagen y repetir para cada celda sobre cada fotograma de lapso de tiempo. Haga clic en Superposición de imagen y para llegar al administrador de intereses y seleccione las celdas de interés. A continuación, haga clic en medir para obtener los valores de los parámetros de forma de celda seleccionados de interés.

Dentro de las 24 horas de explant y cultivo, una región de la cresta neural craneal epitelial preplaciaria se puede observar claramente que rodea el explant de la placa neural. Además, una subpoblación de células de cresta neural habrá sufrido una transición epitelial a la mesenquimal y aparecerá completamente mesenquimal. Los cultivos de explantado se basan en un hidrogel a base de matriz extracelular o fibronectina, forman estructuras explantas similares compuestas de cresta neural premigratoria de placa neural y poblaciones de células de cresta neural migratoria.

Sin embargo, los explantes chapados en fibronectina producen células con lamellipodia más prominente en el borde delantero celular aparentemente más polarizado en la dirección de la migración. La microscopía de lapso de tiempo permite el seguimiento de las coordenadas X, Y de las células individuales y el análisis de la migración de células de la cresta neural y el análisis de la dinámica morfológica de la célula de la cresta neural craneal a lo largo del tiempo. Al esbozar membranas celulares individuales, el área celular y las mediciones perimetrales se pueden calcular a partir de todos los fotogramas de las películas para permitir la posterior cuantificación del área celular y la circularidad de individuos y grupos de células.

Tenga en cuenta que a medida que las células migran lejos del explant, el área celular aumenta significativamente mientras que la circularidad de las células permanece relativamente constante, lo que sugiere que a medida que las células se apartan del borde epitelial y pierden celda a contactos celulares, muestran un mayor área de propagación celular. Preste especial atención a raspar el mesodermo subyacente para obtener una placa neural limpia, ya que esto promueve la migración de las células de la cresta neural lejos del tejido. Muchas otras técnicas como inmunostaining, RTPCR, o análisis de una sola célula se pueden realizar para analizar diferentes proteínas o genes de interés entre diferentes poblaciones de células de cultivo.

Estamos interesados en los rollos de desarrollo de algunos genes clave del neuroblastoma que podrían estar involucrados en la migración de células de la cresta neural y en el uso de este enfoque para estudiar los genes de las enfermedades humanas.