Mejorar la precisión de la evaluación citométrica de flujo del potencial de la membrana mitocondrial en células hematopoyéticas de tallo y progenitor a través de la inhibición de las bombas de eflujo
30 de julio de 2019
Las bombas de eflujo xenobiótico son muy activas en células hematopoyéticas madre y progenitoras (HSCCP) y causan extrusión de TMRM, un tinte fluorescente potencial de membrana mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para medir con precisión el potencial de la membrana mitocondrial en los HSCCP por TMRM en presencia de Verapamil, un inhibidor de la bomba de eflujo.
La función mitocondrial es fundamental para la autoexaprobación de células madre hematopoyéticas. La actividad mitocondrial es un reflector del potencial interno de la membrana mitocondrial, que puede medirse mediante TMRM, un colorante catiónico fluorescente celular y permeante. Las bombas de eflujo xenobiótico son altamente activas en HSC y causan extrusión TMRM.
La principal ventaja de este protocolo, es la corrección de este efecto, utilizando Verapamil, un inhibidor de las bombas de eflujo. Comience por aislar la médula ósea de los fémures de ratón. Usa un par de fórceps y tijeras afiladas para cortar las dos patas posteriores.
Luego haz un pequeño recorte en la piel ventral del ratón, y estírala. Extraiga el fémur y la tibia, teniendo cuidado de no desalojar las cabezas del fémur, y coloque los huesos en una placa de seis pozos, llena de 1,5 mililitros de tampón de tinción. Retire los músculos de los huesos y corte los extremos de los huesos, permitiendo que la médula ósea salga.
Coloque los huesos limpios en pozos nuevos, con 1,5 mililitros de tampón de tinción. Luego, enjuague la médula ósea con una jeringa de tres mililitros y una aguja de calibre 25, hasta que el hueso se vuelva blanco. Recoger todas las células en un tubo de 1,5 mililitros, y centrifugarlas durante cinco minutos a 180 veces G, luego deseche el sobrenadante.
Resuspender cuidadosamente el pellet en 300 microlitros de tampón de colorante ACK helado, y poner las células en hielo durante un minuto. A continuación, desactive inmediatamente la lysis añadiendo un mililitro de tampón de tinción. Centrifugar las células durante cinco minutos a 180 veces G.Resuspend el pellet celular, que debe aparecer blanco, en un mililitro de tampón de tinción.
Filtrar las células utilizando una tapa de colador celular, con una malla de nylon de 35 micrómetros, para obtener células mononucleares. Comience preparando el cóctel de linaje y anticuerpos conjugados con fluoróforos, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Mantenga los anticuerpos sobre hielo y protegidos de la luz.
Luego, centrifuga la muestra durante cinco minutos a 180 veces G, y deseche el sobrenadante. Añadir 400 microlitros del cóctel de linaje, y cuatro microlitros de anticuerpos biotinilados CD135 al pellet celular, y vórtice la mezcla. Luego incubarlo sobre hielo durante 30 minutos.
Después de la incubación, lave la muestra añadiendo tres mililitros de tampón de tinción, girando hacia abajo durante cinco minutos a 180 veces G, y descartando el sobrenadante. A continuación, agregue 400 microlitros de solución de anticuerpos y vórtice la mezcla. Incubarlo sobre hielo durante otros 30 minutos, y repetir el lavado con el tampón de tinción.
Para preparar la solución de tinción TMRM, agregue 2,2 microlitros de solución de material TMRM, y 1,1 microlitros de Verapamil, a 1,1 mililitros de medio de cultivo hematopoyético sin suero, con trombopoyetina y factor de células madre. Resuspender la médula ósea en un mililitro de la solución de tinción TMRM, vórtice rápidamente e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Filtre la muestra con una tapa de colador celular, con una malla de nylon de 35 micrómetros, para evitar obstruir el citómetro de flujo.
A continuación, agregue un microlitro de DAPI y proceda con la citometría de flujo. Ejecuta la muestra de médula ósea y adquiere al menos un millón de eventos. A continuación, muestre las células mononucleares de médula ósea viva en una gráfica para el azul pacífico, para identificar fracciones CD135 Lin-negativas y Lin-positivas.
Trazar la fracción Lin-negativa para APC/Cy7 frente a PE/Cy7 para identificar el progenitor multipotente o la fracción MPP. A continuación, trace la fracción MPP para APC frente a PerCP/Cy5.5, para identificar la célula madre hematopoyética o la fracción HSC. Visualice la fracción HSC para FITC, o CD34, para dividirla en fracciones HSC negativas CD34 y HSC positivas CD34.
Finalmente adquirir la intensidad TMRM en cada población. Para asegurarse de que la tinción TMRM funcionó correctamente, agregue un microlitro de FCCP a la muestra, para una concentración final de un milimolar, e incubarlo a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego adquiere un millón de eventos.
Después de la adición de FCCP, la intensidad TMRM debe aumentarse drásticamente. Este protocolo se ha utilizado con éxito para cuantificar el potencial de la membrana mitocondrial en varias poblaciones celulares, con tinte TMRM. Se ha demostrado que la presencia de PBS y FBS en el medio de cultivo afecta a la intensidad de la señal TMRM.
Por lo tanto, es importante realizar la tinción TMRM en un medio de expansión sin suero. Las células madre hematopoyéticas expresan altos niveles de actividad de bombas de eflujo xenobiótico que extruyen el tinte TMRM. Así que los perfiles TMRM también varían en presencia de Verapamil o Ciclosporina H, que bloquean las bombas.
Para verificar la exactitud de la tinción TMRM, FCCP puede ser despolarizar las mitocondrias, y reducir la intensidad TMRM. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar HSC con un tinte potencial de membrana mitocondrial diferente, incluyendo TMRE o JC-1. Así como otros tintes mitocondriales como MitoTracker o MitoSOX.
Los problemas críticos heredados por la diferente actividad de las bombas de eflujo entre la población de médula ósea se señalaron recientemente. Por lo tanto, este protocolo tiene como objetivo reducir la discrepancia entre los hallazgos anteriores.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio investiga el potencial de la membrana mitocondrial en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) utilizando TMRM, un colorante fluorescente, y el impacto de las bombas de eflujo de xenobióticos. Se presenta un protocolo que incorpora verapamilo para medir con precisión los niveles de TMRM mediante la inhibición de estas bombas, lo que permite una evaluación confiable de la función mitocondrial.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Dinámica mitocondrial en células madre
- Mecanismos de eflujo celular
- Medición del potencial de membrana
Antecedentes
- Importancia de la función mitocondrial en la renovación de células madre
- Dificultades planteadas por las bombas de eflujo en las mediciones con colorantes
- Uso del TMRM como indicador del potencial mitocondrial
Métodos Utilizados
- Aislamiento de médula ósea de ratones
- Citometría de flujo para el análisis de poblaciones celulares
- Inhibición de bombas de eflujo utilizando Verapamilo
Resultados principales
- Cuantificación exitosa del potencial de membrana mitocondrial en CPHS
- Efectos demostrados del verapamilo sobre la retención de TMRM
- Adaptabilidad del protocolo para colorantes mitocondriales alternativos
Conclusiones
- El estudio proporciona un método confiable para evaluar la actividad mitocondrial en células madre.
- Los hallazgos mejoran la comprensión de la biología de las células madre y los efectos de agentes farmacológicos sobre la función mitocondrial.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación precisa del potencial de membrana mitocondrial en células madre y progenitoras hematopoyéticas es esencial para comprender la autorrenovación de las células madre y la regulación metabólica. La actividad de las bombas de eflujo en estas células puede distorsionar las mediciones con colorantes fluorescentes, lo que lleva a datos sesgados que afectan la validación de dianas y la fiabilidad de los modelos preclínicos. Este protocolo aborda una limitación técnica clave en los ensayos basados en citometría de flujo, mejorando la consistencia de los datos para aplicaciones posteriores de descubrimiento y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función mitocondrial como diana terapéutica en células madre hematopoyéticas al reducir el artefacto de medición derivado de la expulsión del colorante.
- Valor operativo: Facilita la comparación consistente de poblaciones de células madre y progenitoras entre modelos experimentales mediante la corrección de la variabilidad de los transportadores xenobióticos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas hematopoyéticos validados para la selección de compuestos al garantizar que las lecturas del potencial mitocondrial reflejen el estado biológico real y no la actividad de ef lujo.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización del ensayo mediante el uso de inhibidores de las bombas de ef lujo como el verapamilo en los protocolos de tinción.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar datos confiables sobre la actividad mitocondrial relacionada con las vías de autorrenovación de células madre.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la estandarización de una lectura funcional clave en diversos sistemas modelo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento al apoyar la prueba de hipótesis en biología de células madre y permitir un perfilado funcional confiable antes de los esfuerzos de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación de dianas mitocondriales y la aclaración de vías en sistemas hematopoyéticos al minimizar señales falsamente bajas derivadas de la extrusión del colorante.
- Tamizaje: Proporciona mediciones cuantitativas y reproducibles del potencial mitocondrial cuando se inhibe el efujo, mejorando la detección de efectos de compuestos.
- Análisis: Genera lecturas basadas en citometría de flujo (intensidad de TMRM) que permiten comparar estados metabólicos entre fracciones celulares y condiciones de tratamiento.
- Investigación Traducible: Se conecta con trabajos preclínicos al proporcionar una métrica trasladable de la idoneidad de células madre que se correlaciona con resultados funcionales.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo de citometría de flujo reutilizable para evaluar la salud mitocondrial en modelos de células madre en múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los estudios de mecanismos de células madre al eliminar una fuente importante de variabilidad en los ensayos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad de los ensayos mitocondriales en entornos de investigación hematopoyética.
- Valor estratégico: Facilita decisiones más acertadas de avanzar/no avanzar en la validación de dianas al reducir los falsos negativos asociados a la expulsión de colorantes.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas en células madre basada en datos funcionales más precisos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en citometría de flujo, aislamiento de células madre y manejo de colorantes fluorescentes.
- Depende del acceso a verapamilo u otros inhibidores de bombas de expulsión, así como a tampones de tinción compatibles.
- Exige estandarización entre los equipos para garantizar un tiempo y una concentración de inhibidor consistentes.
- Debe tenerse en cuenta los posibles efectos fuera del blanco del verapamilo sobre la viabilidad celular o el metabolismo en cultivos a largo plazo.
- Se limita a aplicaciones en las que el potencial de membrana mitocondrial sea una lectura funcional relevante y se sepa que la actividad de expulsión interfiere.
