Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)
17 de septiembre de 2019
El desarrollo de un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF) es novedoso para la eliminación de anticuerpos dañinos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la síntesis de la molécula DCAF1, que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos durante la infección por el virus del dengue.
Esto podría servir para ayudar a responder preguntas clave sobre cómo sintetizar moléculas DCAF con la neutralización de anticuerpos dirigida. Esta técnica proporciona la forma más sencilla de sintetizar las moléculas DCAF con alta productividad. El mundo decide que las moléculas DCAF tienen las posibles intervenciones al anticuerpo en los problemas de enfermedades como la fiebre del dengue y la miastenia grave.
Este método se puede aplicar a otras moléculas DCAF con diferentes epítopos para atacar los anticuerpos cognados. Demostrando el procedimiento estará Xue Bai, un técnico superior de mi laboratorio. Para convertir resina de 2 cloros en resina de 2 cloro derivada de hidrazina, desde la parte superior del recipiente de síntesis de péptidos, agregue cinco mililitros de DMF a los 0,25 milimoles de resina de 2 cloro.
Vuelva a colocar la tapa, agite suavemente el recipiente durante 15 segundos y, a continuación, escóndalo en un soporte de hierro. Repita el lavado DMF dos veces más. A continuación, agregue cinco mililitros de DCM al recipiente, vuelva a colocar la tapa, agite suavemente el recipiente durante 15 segundos y, a continuación, escurralo en un soporte de hierro.
Repita el lavado DCM dos veces más y, a continuación, repita el lavado DMF tres veces más. A continuación, agregue seis mililitros de concentración de volumen del 50% de DMF sobre DCM para hinchar la resina durante 30 minutos y luego drenarla. Ahora transfiera seis mililitros de concentración de volumen del 5% de hidrazina y DMF al recipiente de reacción.
Colóquelo en la coctelera a 120 RPM y 30 grados centígrados durante 30 minutos, y luego drene la solución con bomba de vacío. Para purificar el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III, utilice el sistema HPLC para purificar el péptido mediante una elución de alusión de gradiente de 30 minutos a un caudal de un mililitro por minuto. Después de la purificación de proteínas según el manuscrito, añadir en un nuevo tubo dos mililitros de un miligramo por mililitro SUMO etiquetada proteína, un mililitro de PROteasa SUMO, un mililitro de 10X SUMO tampón proteasa, y seis mililitros de agua destilada doble para preparar la solución de reacción.
Incubar la mezcla durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados. A continuación, aliquot la mezcla en ocho tubos de 1,5 mililitros Eppendorf, y centrifugar la mezcla a 15.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Utilice una pipeta para desechar los agregados en la parte inferior, luego en los sobrenadantes despejados de 10 mililitros, agregue 0,5 mililitros de la lodo de cordón NTA de 50%níquel en 50 PBS mililolares.
Coloque el tubo en una coctelera giratoria a 200 RPM y cuatro grados centígrados para mezclar suavemente durante 60 minutos. A continuación, cargue la lisada y la mezcla de NTA de níquel en una columna con la tapa de salida inferior. Retire la tapa inferior y guarde el flujo a través de un tubo centrífugo de 15 mililitros.
La proteína HIS TAG SUMO es unión en la columna. La parte del antígeno del vinculador, que comienza con el CIS para la reacción de ligadura química nativa, está en el flujo a través. Ahora pondera 1,8 miligramos de derivado de hidrazina de un péptido Fc-III en un tubo de Eppendorf de dos mililitros y añade 0,8 mililitros de seis cloruro de guanidinio molar en 0,2 solución de fosfato monosódico molar a pH 3.
Vórtice para disolver el polvo. Después de centrifugar el tubo a 7, 200 veces G durante un minuto a temperatura ambiente, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue una barra de agitación en el tubo y coloque el tubo en un baño de sal helada en un agitador magnético para agitar suavemente la solución durante 15 minutos.
A continuación, agregue 40 microlitros de 0,5 molar de nitrito sódico a la solución para oxidar el grupo de hidrazina. Agitar suavemente la solución durante otros 15 minutos en el baño de sal helada. Pesar a 11 miligramos de la parte del antígeno del eslador seco purificado y liofilado, y 13,6 miligramos de MPAA en el tubo de reacción en el baño de sal de hielo.
Revuelva durante cinco minutos y luego ajuste el valor de pH a 6.8 a 7.0 en la habitación templado con seis molares de hidróxido de sodio. El paso más crítico para la ligadura química nativa es ajustar el valor de pH cuidadosamente para iniciar la reacción de ligadura. Después de 12 horas en el baño de sal helada, agregue 0,4 mililitros de 0,1 solución neutra molar TCEP al sistema de reacción, y revuelva durante 20 minutos para terminar la reacción.
Después de la centrifugación y la purificación de HPLC, obtener el pico conjugado III para la desulfuración. Disolver en 50 microlitros de seis cloruros de guanidinio molar en solución de fosfato monosódico molar 0,2. A continuación, agregue 50 microlitros de un TCEP molar, 10 microlitros de tert-Butylthiol y cinco microlitros de 0,1 molar VAO para cuatro soluciones.
Ajuste el pH final de la solución a 6.9 y mantenga la solución a 37 grados centígrados en una coctelera durante unas cinco horas. Centrifugar y purificar de nuevo. Disolver el péptido preparado en 200 microlitros de 32 acetatos de plata milimétrica, y luego agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante cuatro horas.
Para convertir los tiolados de plata en péptidos en tioles libres, agregue tres microlitros de una TDT molar en seis cloruro de guanidinio molar, y 0,2 fosfato monosódico molar a pH 7. Utilice el espectrómetro de masas en el modo de escaneo completo y ajuste el rango m/z en 300 a 2.000 y la resolución a 60.000. Abra los datos de espectros de masa y encuentre los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química se ha realizado con éxito.
Para realizar el ensayo ELISA de la interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2, cubra cada pozo de una placa de microtíter de 96 pozos con un picomole de anticuerpo anti-GST en 100 microlitros de tampón de recubrimiento. Selle la placa con cintas de sellado y cíntela a 4 grados centígrados durante la noche en una coctelera. Por la mañana bloquee cada pozo con 200 microlitros de 1%BSA y PBS.
Selle la placa e incuba la habitación templada durante una hora en una coctelera. A continuación, utilice PBS con 0.05%Tween 20 para lavar cada pozo cuatro veces. En este protocolo se utilizó el método de ligadura química nativa para la semisíntesis de la molécula DCAF1.
El espectro de masas muestra que la molécula DCAF1 final tiene un peso molecular desconvolucional de 11,053. Durante el ensayo ELISA, el péptido antígeno Fc-III y DCAF1 inhiben competitivamente la unión de anticuerpos 4G2. Tanto el péptido antígeno como el DCAF1 bloquearon significativamente la unión 4G2, mientras que la peptita Fc-III no afectó a la interacción de anticuerpos antígenos.
Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para una intervención de enfermedades asociadas a anticuerpos dañinos. Lote de las regiones utilizadas para la síntesis de péptidos y ligadura química nativa son altamente tóxicos. Asegúrese de llevar estos experimentos en su capucha química.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo detallado para la síntesis de un conjugado con doble función de un péptido antigénico y miméticos de Fc-III (DCAF1) destinado a eliminar anticuerpos dañinos. El método se centra en bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para mitigar el efecto de potenciación dependiente de anticuerpos durante la infección por el virus del dengue.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunología
- Bioquímica
Antecedentes
- Las moléculas DCAF están diseñadas para neutralizar anticuerpos específicos.
- Tienen aplicaciones potenciales en el tratamiento de enfermedades como la fiebre del dengue y la miastenia gravis.
- El método de síntesis busca una alta productividad y simplicidad.
- Es posible dirigirse a anticuerpos cognados con diferentes epítopos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la síntesis de moléculas DCAF.
- Mostrar la eficacia del DCAF en la neutralización de anticuerpos dañinos.
- Proporcionar una base para investigaciones futuras sobre intervenciones con anticuerpos.
Métodos Utilizados
- Conversión de resina 2-cloro a resina 2-cloro derivada de hidracina.
- Uso de DMF en el proceso de síntesis.
- demostración del protocolo de síntesis paso a paso.
- Aplicación del método a diversas moléculas DCAF.
Resultados principales
- El método de síntesis es sencillo y produce una alta productividad.
- DCAF1 bloquea eficazmente el anticuerpo 4G2.
- La técnica puede adaptarse para otros anticuerpos.
- Potencial para aplicaciones más amplias en inmunoterapia.
Conclusiones
- Las moléculas DCAF representan un enfoque novedoso para la neutralización de anticuerpos.
- El método puede utilizarse para diversas intervenciones terapéuticas.
- Estudios futuros podrían ampliar las aplicaciones de la tecnología DCAF.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La neutralización específica mediante anticuerpos aborda un desafío crítico en el tratamiento de enfermedades asociadas a anticuerpos, donde las respuestas policlonales limitan la especificidad terapéutica. El enfoque DCAF permite el agotamiento preciso de anticuerpos patógenos como el 4G2, reduciendo la potenciación dependiente de anticuerpos en modelos del virus del dengue y restaurando la función del receptor en contextos autoinmunes. Esto respalda la validación temprana de dianas al proporcionar una herramienta mecanicista para reducir los riesgos de hipótesis terapéuticas relacionadas con patologías mediadas por anticuerpos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos dependientes de anticuerpos en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona una herramienta molecular definida para aislar la contribución de autoanticuerpos específicos.
- Valor estratégico: Apoya las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al validar dianas de anticuerpos antes de la optimización costosa de los candidatos líderes.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera datos cuantificables de unión mediante ELISA para evaluar la potencia inhibitoria.
- Valor operativo: Ofrece un formato reproducible para medir el bloqueo de anticuerpos en entornos de alto rendimiento.
- Valor estratégico: Facilita la estandarización de ensayos para comparar candidatos principales dirigidos contra inmunoglobulinas patógenas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la recuperación funcional en modelos relevantes para la enfermedad (reducción de la ADE por DENV, restauración de la actividad del AChR).
- Valor operativo: Utiliza la ligación química nativa para producir conjugados estables adecuados para el perfilado farmacocinético.
- Valor estratégico: Permite la evaluación del compromiso del blanco y los efectos fenotípicos downstream in vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método de síntesis DCAF se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano en los que la validación del blanco del anticuerpo precede a la identificación del candidato principal, ofreciendo una vía para reducir mecanísticamente los riesgos de los candidatos mediante el aislamiento de los efectos específicos del anticuerpo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la eliminación selectiva de poblaciones definidas de anticuerpos para aclarar los mecanismos patógenos.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en ELISA para evaluar la inhibición de anticuerpos, favoreciendo la reproducibilidad del ensayo entre diferentes equipos.
- Analítica: Genera resultados medibles (inhibición de unión, confirmación del peso molecular mediante espectrometría de masas) que permiten comparar diseños de conjugados.
- Investigación Traducional: Relaciona los datos de unión in vitro con resultados funcionales en modelos preclínicos, apoyando el avance ajustado al riesgo.
- Reutilización Empresarial: La plataforma de conjugación basada en NCL es adaptable a múltiples secuencias antigénicas, lo que permite su reutilización en diversos programas de dianas de anticuerpos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar el papel de anticuerpos individuales en respuestas policlonales complejas.
- Valor operativo: Emplea química NCL estandarizada con validación mediante HPLC y espectrometría de masas para una producción consistente de conjugados.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en la selección de dianas, reduciendo el fracaso en fases avanzadas debido a efectos mediados por anticuerpos no anticipados.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de terapéuticos basada en dianas de anticuerpos validadas, mejorando la eficiencia del capital en carteras de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en síntesis de péptidos, ligación química nativa y purificación por HPLC.
- Los instrumentos incluyen agitadores, centrífugas, espectrómetros de masas y lectores de ELISA con capacidad de control de temperatura.
- La estandarización de las condiciones de tampón, ajustes de pH y tiempos de reacción es fundamental para la eficiencia y reproducibilidad de la ligación.
- La adaptación a otras moléculas DCAF requiere una nueva validación de la solubilidad del péptido antigénico y la eficiencia de acoplamiento.
- El manejo de reactivos tóxicos (cloruro de guanidinio, acetato de plata) requiere el uso de campanas extractoras y protocolos de mitigación de residuos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Chemical Synthesis of the Hydrazine Derivative of a Fc-III Peptide
2:31
Cleavage of the SUMO Tag
4:09
Assembling of DCAF1 by Native Chemical Ligation
7:06
Mass Spectrometry and ELISA Assay
8:19
Results: Native Chemical Ligation and ELISA Assay
9:03
Conclusion
