Name: Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprende a realizar electroporación in vivo para etiquetar células ependimogliales individuales en el telencéfalo de Danio rerio adulto. Este método permite el monitoreo a largo plazo y la manipulación de vías celulares específicas.

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Un agradecimiento especial a James Copti por editar el manuscrito. También agradecemos la financiación a JN de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) por el SFB 870 y SPP "Análisis Integrativo de Olfacción" y SPP 1738 "Funciones emergentes de ARN no codificantes en el desarrollo del sistema nervioso, plasticidad y enfermedad", SPP1757 " Heterogeneidad glial", y Estrategia de Excelencia en el marco del Clúster de Neurología de Sistemas de Múnich (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Todos los animales utilizados en este protocolo se mantuvieron en condiciones estándar de cría, y los experimentos se han realizado de acuerdo con las directrices y reglamentos de manipulación de la UE y el Gobierno de Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Preparación de la mezcla de plásmido para la electroporación
<ol><li>Diluir el plásmido de interés en agua estéril y añadir solución de tinción verde rápida [1 mg/ml]. Asegúrese de que la concentración final del plásmido es de 1 g/L. Añadir la mancha a una concentración no superior al 3%, ya que su único propósito es colorear la solución y visualizar la inyección ventricular.</li>
	<li>Una vez preparada, mezcle la solución de plásmido pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces o tocando con los dedos. Conservar a temperatura ambiente (RT) hasta su uso. NOTA: Para la coelectroporación de dos plásmidos en la misma célula, asegúrese de que la concentración de cada plásmido individual utilizado en la mezcla sea de al menos 0,8 ng/L con una relación molar de 1:1 para obtener una eficiencia de coelectroporación del 80%-90%.</li>
</ol>2. Preparativos para el procedimiento de inyección y electroporación
<ol><li>Preparar los capilares de vidrio (diámetro exterior 1 mm, diámetro interior 0,58 mm) necesarios para la inyección en el aparato de tracción de agujas.</li>
	<li>Para inyectar la cantidad correcta de plásmido (ver arriba), tire del capilar a una temperatura de 68,5 oC con dos pesos ligeros y dos pesados (ver Tabla de Materiales para las especificaciones del tirador). NOTA: En caso de que se utilice un tirador diferente, calibrar el capilar para entregar el volumen adecuado de mezcla de electroporación.</li>
	<li>Ajuste manualmente el dispositivo de inyección a una presión de inyección de 200 hPa (girando la perilla Pi) y presión constante de 0 hPa. Ajuste manualmente el tiempo de inyección al modo manual y controle la presión con el pedal.</li>
	<li>Ajuste el dispositivo de electroporación a "modo LV" con cinco pulsos a 54–57 V (25 ms cada uno con intervalos de 1 s). Conecte los electrodos al dispositivo.</li>
	<li>Preparar una pecera con agua de pescado limpia, donde el pescado se despertará de la anestesia después del procedimiento de electroporación. Airear el agua manteniendo la piedra de aire unida a la bomba de aire durante todo el período de recuperación hasta que el pez se despierte por completo.</li>
	<li>Tome una esponja de cocina regular y haga un corte longitudinal en la esponja para sujetar el pescado durante el procedimiento de inyección y electroporación (ver publicación anterior3). NOTA: La esponja de cocina debe lavarse o intercambiarse regularmente para eliminar posibles sustancias químicas tóxicas.</li>
	<li>Coloque una pequeña cantidad de gel de ultrasonido multiusos altamente conductivo junto a la configuración de inyección y electroporación. NOTA: Esto garantizará una conductividad eléctrica adecuada y, en consecuencia, la distribución de células electroporadas a lo largo de todo el telencéfalo.</li>
</ol>3. Anestesia de pez cebra
<ol><li>Antes de la anestesia, prepare una solución de siembra de anestesia con 0.2% MS222 en agua destilada y ajuste el pH a 7 con tampón Tris-HCl. Diluir esta población 1:10 (es decir, a 0,02% MS222) utilizando agua de pescado.</li>
	<li>Anestesiar a los peces manteniéndolos en esta solución de trabajo hasta que el movimiento del cuerpo y las branquias disminuya (normalmente durante un par de minutos).</li>
</ol>4. Inyección de solución de plásmido
<ol><li>Llene el capilar de vidrio preparado con 10 ml de solución de plásmido utilizando puntas de microcargador. Evitar la formación de burbujas de aire dentro del capilar.</li>
	<li>Pulse Menú/Cambiar capilar en el dispositivo de inyección. Inserte y fije la aguja en el soporte de la aguja.</li>
	<li>Bajo un estereomicroscopio con un aumento de 3.2x o 4x, corte sólo la punta del capilar usando fórceps finos. Cambie el dispositivo de inyección del modo Cambiar capilar al modo Inyección y, a continuación, aplique presión con un pedal para asegurarse de que la solución de plásmido se está quedando sin problemas y sin obstáculos.</li>
	<li>Transfiera el pescado del tanque de cría al recipiente (caja de plástico) con solución anestésica. Espere unos minutos hasta que disminuya el movimiento de las branquias.</li>
	<li>Coloque el pescado en la esponja premojada con el lado dorsal hacia arriba. Realice todos los siguientes pasos de inyección bajo el estereomicroscopio para garantizar la precisión del procedimiento.</li>
	<li>Usando una microcuchilla dissección de acero inoxidable con filo de 40 mm y 0,5 mm de espesor, cree un pequeño agujero en el cráneo del pez en el lado posterior del telencéfalo(Figura 1B),justo al lado de la frontera con tectum óptico. NOTA: Este paso debe realizarse cuidadosamente ya que el agujero debe ser muy pequeño y superficial, penetrando únicamente el cráneo, para evitar daños cerebrales.</li>
	<li>Incline el pez según sea necesario y oriente la punta del capilar de vidrio hacia el cráneo en el ángulo correcto para facilitar la penetración de la punta capilar a través del agujero.</li>
	<li>Inserte la punta del capilar a través del orificio en el cráneo cuidadosamente hasta que llegue al ventrículo telencéfalo (ver Figura 1B). Esto requerirá penetración a través de la capa celular epentimal dorsal. Tenga especial cuidado de no insertar el capilar demasiado profundamente para evitar el contacto con el tejido cerebral. Mantenga el capilar precisamente entre los hemisferios, permaneciendo dentro del ventrículo justo después de perforar la capa épica dorsal. NOTA: Este es un paso muy delicado. La precisión de este procedimiento se mejora utilizando líneas mutantes de pigmentación como brassy24,permitiendo una mejor visualización de la posición capilar de vidrio durante la inyección.</li>
	<li>Con la punta capilar dentro del ventrículo, inyectar la solución plásmido aplicando presión con el pedal durante unos 10 s, que corresponde a aproximadamente 1 l de solución de plásmido. NOTA: Si cambia el tirador de la aguja, los capilares o el inyector, el sistema debe calibrarse para administrar siempre 1 l de solución de plásmido. La calibración se puede realizar midiendo el diámetro de la gota de plásmido expulsada en un aceite mineral (por ejemplo, aceite de parafina) y posteriormente calculando el volumen de la gota. Después de 10 s de inyección, debe haber 1 l de líquido plásmido expulsado en el aceite mineral.</li>
	<li>Confirme el éxito del paso anterior observando la propagación del líquido por todo el ventrículo.</li>
</ol>5. Electroporación
<ol><li>Retire el pescado de la configuración de la inyección mientras lo mantiene en la esponja.</li>
	<li>Sumerja el lado interno de la punta de los electrodos en el gel de ultrasonido.</li>
	<li>Cubra el telencéfalo de pescado con una pequeña cantidad de gel de ultrasonido.</li>
	<li>Coloque la cabeza del pez entre los electrodos, colocando el electrodo positivo en el lado ventral de la cabeza del pez y el electrodo negativo en el lado dorsal(Figura 1C),mientras mantiene el cuerpo del pez en la esponja. Esto establece la dirección del flujo de la corriente necesaria para electroporato ependymoglia situado en la zona subventricular.</li>
	<li>Presione los electrodos suavemente y con precisión contra el telencéfalo(Figura 1C). Administre la corriente con el pedal. Mantenga los electrodos en su lugar hasta que los cinco pulsos estén terminados.</li>
</ol>6. Recuperación de peces
<ol><li>Deje que los peces se recuperen en el tanque previamente preparado y aireado continuamente hasta que despierte. Gel de lidocaína se puede aplicar en el cráneo con el fin de aliviar cualquier dolor posiblemente desarrollado.</li>
</ol>

<ol><li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
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<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li>
<li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li>
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<li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li>
<li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li>
<li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).</li>
<li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarbosa%2C+JS+%22In+vivo+single+cell+analysis+reveals+distinct+behavior+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+homeostasis+and+regeneration+in+the+adult+brain%22">In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain</a>. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).</li>
<li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li>
<li>Chapouton, P., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapouton%2C+P+%22Neurogenesis.+Chapter+IV+in+The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A+Developmental+Biology%22">Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de electroporación es un método in vivo fiable de etiquetado de células epentimoglial individuales. El protocolo puede necesitar una adaptación adicional para etiquetar otros tipos de células como neuronas u oligodendrocitos. Para lograr un etiquetado exitoso, se pueden utilizar plásmidos que contengan diferentes promotores. Promotor de actina de pollo-beta, eF1alpha, CMV y promotor de ubiquitina se han utilizado previamente para impulsar la expresión de diferentes transgenes en ependymoglia y su progenie<...

Zebrafish son excelentes modelos animales para examinar la regeneración cerebral después de una lesión en la herida de puñalada. En comparación con los mamíferos, en la escala evolutiva, las especies menos evolucionadas como el pez cebra generalmente muestran tasas más altas de neurogénesis constitutiva y áreas más amplias de residencia de células madre neurales adultas, lo que conduce a la generación constante de nuevas neuronas a lo largo de la mayoría de las áreas cerebrales en la vida adulta. Esta característica parece correlacionarse con una capacidad regenerativa significativamente mayor del pez cebra en comparación con los mamíferos1, ya que los peces cebra tienen un potencial notable para generar eficientemente nuevas neuronas en la mayoría de los modelos de lesiones cerebrales estudiados2, 3,4,5,6,7,8. Aquí se estudia el telencéfalo de pez cebra, ya que es un área cerebral con neurogénesis prominente en la edad adulta. Estas zonas de neurogénesis adulta son homoólogas a zonas neurogénicas en el cerebro adulto demamíferos9,10,11.
Abundantes áreas neurogénicas en el telencéfalo de pez cebra están presentes debido a la existencia de glia radial como células o células de ependymoglia. Las células ependymoglial actúan como células madre neurales adultas residentes y son responsables de la generación de nuevas neuronas en el cerebro intacto y regenerador3,5. Los experimentos de rastreo de linaje han demostrado que la ependymoglia ventricular reacciona a la lesión, luego proliferan y generan nuevos neuroblastos que migran al sitio de la lesión5. Debido a la naturaleza evertida del telencéfalo de pez cebra, las células epentimoglial eslacionan la superficie ventricular y construyen la pared ventricular ventral. La pared ventricular dorsal está formada por una capa de células ependitas dorsales(Figura 1A). Es importante destacar que la epentioglia del pez cebra encarna las características tanto de la glia radial de mamíferos como de las células epentimales. Los procesos radiales largos son una característica típica de las células glia radiales, mientras que las extensiones celulares y las uniones estrechas (así como sus posiciones ventriculares) son características típicas de las células epentimales12,13,14. Por lo tanto, estas células se conocen como células epenymoglial.
Para seguir el comportamiento in vivo de células ependymoglial individuales durante la regeneración, deben etiquetarse de forma fiable. Se han descrito previamente varios métodos de etiquetado de células in vivo para microscopía fluorescente, como reporteros endógenos o colorantes lipofílicos15. Estos métodos, a diferencia de la electroporación, pueden requerir períodos de tiempo más largos y a menudo no ofrecen la posibilidad de etiquetado de una sola célula o rastreo permanente a largo plazo. La electroporación, sin embargo (además del etiquetado de una sola célula), ofrece la posibilidad de introducir nuevo ADN en la célula huésped. Además, en comparación con otros métodos de transferencia de ADN a las células, se ha demostrado que la electroporación es uno de los métodos más eficientes16,17,18,19.
Aquí se presenta un protocolo de electroporación que se ha refinado con el fin de etiquetar células ependymoglial únicas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo permite el etiquetado de células epentimogliales individuales con el fin de seguirlas a largo plazo20 o manipular vías específicas de manera autónoma celular21,22.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo/Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>Para colorear la solución de plásmido</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>MS222 debe almacenarse en RT (hasta dos semanas) y protegerse de la luz</td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido</td><td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td><td>15-60</td><td>Electrodo Gel</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte>Bomba de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>aire</td><td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td><td></td><td>Se puede comprar en las tiendas de mascotas</td></tr><tr><td>BTX Pinzas Electrodos</td> de <td>platino Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0486</td><td>1 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Dispositivo de electroporación</td><td>BTX ECM830 Sistema de electroporación de onda cuadrada, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de inyección</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td></td></tr><tr><td>Pared estándar Borosilicato Capilar de vidrio Warner</td><td>Instruments</td><td>64-0766</td><td>Modelo: G100-4</td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td></td> 5242956003 <td></td></tr><tr><td>Micro-knife</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td> <td>de joystickNarishige Japan</td><td>MN - 151</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>El portaagujas se une con el dispositivo de inyección</td></tr><tr><td>Dispositivo de extracción de agujas</td><td>Narishige Japan</td><td>Modelo: PC-10</td><td>El PC-10 fue descontinuado por Narishige en 2017 y reemplazado por las placas de Petri PC-100</td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-One International 633161</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

método de electroporación para la entrega in vivo de adn plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

La electroporación es un método de transfección en el que se aplica un campo eléctrico a las células para crear poros temporales en una membrana celular y aumentar su permeabilidad, permitiendo así introducir diferentes moléculas en la célula. En este artículo, la electroporación se utiliza para introducir plásmidos a las células ependigliales, que recubren la zona ventricular del telencéfalo adulto del pez cebra. Una fracción de estas células muestra propiedades de células madre y genera nuevas neuronas en el cerebro del pez cebra; por lo tanto, estudiar su comportamiento es esencial para determinar sus funciones en la neurogénesis y la regeneración. La introducción de plásmidos a través de la electroporación permite el etiquetado y seguimiento a largo plazo de una sola célula ependymoglial. Además, los plásmidos como Cre recombinase o Cas9 pueden ser entregados a células ependymoglial únicas, lo que permite la recombinación genética o la edición genética y proporciona una oportunidad única para evaluar la función génica autónoma de la célula en un control natural Ambiente. Por último, este protocolo de electroporación detallado paso a paso se utiliza para obtener una introducción exitosa de plásmidos en un gran número de células ependimarinas individuales.

El método de electroporación descrito permite la entrega de ADN plásmido en células ependymoglial, que se encuentran superficialmente en el telencéfalo de pez cebra y justo debajo de la capa de células epentimales dorsales(Figura 1A).
Si el resultado de la electroporación es positivo, se pueden observar células ependymoglial (células rojas en la Figura 2A,B)entre otras células epend...

Aquí se presenta un método de electroporación para la entrega de ADN plásmido y el etiquetado de células ependimarinas en el telencéfalo adulto de pez cebra. Este protocolo es un método rápido y eficiente para visualizar y rastrear células ependymoglial individuales y abre nuevas posibilidades para aplicar la electroporación a una amplia gama de manipulaciones genéticas.

Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Este protocolo permite el etiquetado de células ependigliales individuales en el telencefallo del pez cebra para permitir su seguimiento a largo plazo, así como la manipulación de vías específicas de manera autónoma de las células. La principal ventaja de esta técnica es que permite el etiquetado de una sola célula de manera rápida y eficiente, así como la edición de genes y la manipulación de la vía de señalización de forma autónoma de las células. Este método permite la investigación de preguntas básicas de biología celular, por ejemplo, sobre la delaminación celular, el mantenimiento de la homeostasis epitelial y la simetría de la división celular.Comience por usar un aparato de tracción de agujas para preparar capilares de vidrio. Utilice puntas de microcargador para llenar un capilar de vidrio preparado con diez microlitros de solución de plásmido. A continuación, pulse el menú cambiar capilar"en el dispositivo de inyección para permitir que la aguja se cargue en el soporte de la aguja.A continuación, cambie el dispositivo de inyección de cambiar el capilar al modo de inyección. Luego, usando un estereomicroscopio con un aumento cuatro veces, y fórceps Finden, corta solo la punta del capilar. A continuación, aplique presión sobre el pedal para confirmar que las soluciones de plásmido salen fácilmente de la aguja sin obstáculos.Cuando la aguja esté lista, transfiera un pez cebra del tanque de cría a un recipiente de solución anestésica. Y espera unos minutos hasta que el movimiento de las branquias desaparezca. Presione el lado dorsal del pez sedado hacia arriba sobre una esponja pre-humedecida debajo del estereomicroscopio, y utilice una microknife diseccionante de acero inoxidable con un filo de corte de 40 milímetros y un grosor de 0,5 milímetros para crear cuidadosamente un pequeño agujero en el cráneo del pez en el lado posterior del telencéfalo, justo al lado del borde del tectum óptico.Incline el pez según sea necesario y oriente la punta del capilar de vidrio hacia el cráneo en el ángulo correcto para facilitar la penetración de la punta capilar a través del agujero. A continuación, inserte muy cuidadosamente la punta del capilar en el orificio a través de la capa celular ependimal dorsal, hasta que llegue al ventrículo telencéfalo, y aplique presión al pedal durante unos 10 segundos para entregar aproximadamente 1 microlitro de la solución de plásmido. El éxito de la entrega se puede confirmar observando la propagación del líquido verde a lo largo del ventrículo.Cubra el telencéfalo de pescado con una pequeña cantidad de gel de ultrasonido. Para la electroporación del animal inyectado plásmido, retire la esponja de la configuración de la inyección y sumerja el lado interno de las puntas electromagnida en gel de ultrasonido. Coloque la cabeza del pez entre los electrodos, con el electrodo positivo en el lado ventral de la cabeza y el electrodo negativo en el lado dorsal.Luego, mientras mantiene el cuerpo del pez en la esponja, presione los electrodos suavemente y con precisión contra el telencéfalo y administre la corriente con el pedal, sosteniendo los electrodos en su lugar hasta que los cinco pulsos estén terminados. Si la electroporación es exitosa, se puede observar un plásmido etiquetado con células ependipogliales individuales entre las células ependigliales no plásmidas etiquetadas. Dependiendo de la eficiencia del proceso de electroporación, se puede etiquetar un número mayor o menor de células ependipogliales.Sin embargo, el protocolo demostrado produce un mayor número de celdas etiquetadas que los protocolos publicados anteriormente. Tenga en cuenta que la mayor densidad de células etiquetadas tiende a emerger principalmente en el lado ventricular interno de ambos hemisferios debido a la forma en que el líquido plásmido inyectado distribuye entre los hemisferios. En este video, un hemisferio del tetófalo del pez cebra se presenta en 3D, donde las células ependimogliales con procesos radioeléctricos, se encuentran en magenta cuando se observan desde el lado.A través de la co-electroporación con otro plásmido que etiqueta los núcleos, se puede observar la división celular de las células ependimogliales. La electroporación sin éxito da como resultado un número muy bajo o ninguna célula ependiglial etiquetada. Las células ependimales dorsales, sin embargo, son las más propensas a ser etiquetadas.Su soma es más grande en cuboide y no poseen procesos radio-alargados como se evidencia desde una vista lateral de la capa celular ependimoglial. Las células etiquetadas tdTomato-mem son probablemente células ependimales, que se encuentran por encima de la capa de ependymoglia. Por el contrario, la introducción de un plásmido-mem que expresa plásmido a células ependmyoglial individuales da como resultado la expresión tdTomato-mem además del etiquetado celular inicial.Lo más importante a recordar es cortar sólo la punta del capilar y penetrar la capa ependimal durante la inyección para que el líquido se propague por todo el ventrículo. Esta técnica permite el monitoreo a largo plazo de células ependimogliales individuales a través de imágenes in vivo, y por lo tanto establecer su papel en la regeneración cerebral, así como su vasto vínculo genético in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

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Método de electroporación para la entrega in Vivo de ADN plásmido en el telencéfalo adulto de pez cebra

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