Aislamiento de intact eyeball para obtener tejido superficial ocular integral para el examen histológico y la inmunohistoquímica
20 de octubre de 2019
Este protocolo describe un método para el aislamiento del globo ocular del ratón con los segmentos del párpado, la superficie ocular, la anterior y la posterior en posición relativamente intacta.
Nuestro laboratorio se centra en el desarrollo ocular y las enfermedades. Este protocolo describe un método para eliminar el cráneo y los huesos orbitales secuencialmente de la cabeza del ratón diseccionada. Dejando los párpados, la superficie ocular, la lente y la retina juntos en una sola pieza. El protocolo beneficiará a los oftalmólogos que estén interesados en la didáctica de la superficie ocular. Soy Dianlel Guo, para contar la técnica con una lucha probable al tratar de evitar el daño del globo ocular, mientras disecciona los huesos faciales. La principal ventaja de esta materia de disección es que la integridad de la lámina epitelial de la superficie ocular está bien conservada y las diferentes partes de la superficie ocular pueden ser examinadas por histología o inmunosurete en una sola sección. Asegúrese de cortar todos los huesos pequeños y desechos de los tejidos blandos. Razón, causará marcas cicatriciales en la sección del tejido de lo contrario. Después de eutanasiar el ratón, usa un par de tijeras rectas para cortar la cabeza y bisect a lo largo de la línea media sagital comenzando en el hueso intraparietal rostralmente a la nasal. Coloque cada mitad de la cabeza bisecado en un plato limpio de petri y use tijeras afiladas para cortar la mandíbula y la lengua. Libere el nervio óptico cortándolo del cerebro antes de la ubicación del quiasmo óptico. Y eliminar todos los tejidos cerebrales, incluyendo el bulbo olfativo, que está unido a la pared del cráneo. Ahora todos los tejidos restantes tendrán todo el cráneo y los huesos orbitales asociados con el globo ocular. Lave las partes restantes con PBS para limpiar cualquier sangre y restos de cabello. Pre-fijar los tejidos colocándolos en un tubo de 50 mililitros que contiene 4%paraformaldehído y girándolos a temperatura ambiente. Una vez completada la prefijo, lave rápidamente la cabeza diseccionada en PBS tres veces para eliminar aún más los pelos rotos y los fijadores. Coloque el tejido en una placa de petri de 10 centímetros y corte el cráneo en tres partes a lo largo de los planos indicados en la figura uno del protocolo de texto. El globo ocular y la cavidad están ocultos en la parte media del cráneo bajo huesos efimoides, frontales y maxilares. Utilice dos pares de fórceps rectos número cuatro para despegar el hueso etinido y exponer completamente los huesos frontales y maxilares. Luego, divida geográficamente la superficie del cráneo en cuatro áreas. Inserte la punta de los fórceps curvos horizontalmente en cada área para eliminar los huesos maxilares y frontales secuencialmente. Después de esto, los huesos lagrimales y yugales subyacentes serán expuestos. Retire los dos huesos y los músculos y grasas subcutáneas asociados que rodean el globo ocular. Recorta el globo ocular con los párpados y la piel unidos en un pequeño bloque de forma cuadrada para reducir el volumen tisular y facilitar la orientación del tejido al incrustarlo. Coloque el globo ocular y los tejidos asociados de nuevo en 4%paraformaldehído y continúe fijando durante la noche a las 4
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Resumen
Este protocolo se centra en un método para aislar el globo ocular de ratón con su párpado y superficie ocular intactos, preservando su anatomía para estudios anatómicos. La técnica es particularmente beneficiosa para oftalmólogos interesados en examinar superficies oculares sin dañar tejidos delicados.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Desarrollo ocular
- Enfermedades oculares
- Histología e inmunotinción
Antecedentes
- Importancia de preservar la integridad de la superficie ocular
- Dificultades para diseccionar ojos de ratón sin causar daño
- Aplicaciones para la educación oftalmológica
Métodos Utilizados
- Eliminación secuencial de los huesos del cráneo y orbitarios
- Modelo de ratón
- Uso de paraformaldehído para la fijación del tejido
Resultados Principales
- El protocolo conserva la lámina epitelial de la superficie ocular para su posterior examen
- Permite el análisis histológico o mediante inmunotinción
- Demuestra técnicas eficaces para la disección ocular
Conclusiones
- El estudio muestra un método confiable para aislar el globo ocular de ratón con estructuras adyacentes
- Relevante para estudios relacionados con la salud y las enfermedades oculares
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preservación de la integridad de la lámina epitelial de la superficie ocular permite la evaluación simultánea del epitelio conjuntival palpebral, conjuntival bulbar y corneal en modelos de enfermedad. Este enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la evaluación simultánea de cambios patogenéticos en tejidos interconectados. Mejora la confianza predictiva en estudios preclínicos que requieren una arquitectura tisular intacta para el análisis histológico e inmunoensayo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas al conservar las relaciones espaciales dentro de la lámina epitelial de la superficie ocular.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la preparación de tejido íntegro para el examen histológico paralelo de cambios relacionados con la enfermedad.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados con arquitectura de superficie ocular preservada para ensayos posteriores de inmunomarcado e histología.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos al minimizar la distorsión del tejido durante la disección, mejorando la reproducibilidad entre secciones.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la integridad del sistema relevante para la enfermedad, permitiendo la alineación traslacional de biomarcadores en regiones conectadas de la superficie ocular.
- Valor operativo: Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al preservar la morfología del tejido para un corte y análisis consistentes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de biología de descubrimiento al permitir la preparación de tejidos intactos para lecturas histológicas e inmunotinciones que apoyan la prueba de hipótesis y la aclaración de vías.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la preservación de la integridad de la lámina epitelial para el examen paralelo de las regiones conjuntival y corneal.
- Selección: Mejora la disponibilidad del ensayo mediante el aislamiento reproducible del tejido, lo que reduce la variabilidad en el corte histológico.
- Análisis: Permite mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante inmunomarcación e histología en secciones de tejido íntegro.
- Investigación Traductiva: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica al mantener la arquitectura de la superficie ocular para una evaluación patológica consistente.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable de preparación de la superficie ocular en múltiples modelos de enfermedad y campañas de selección.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva mediante la conservación de la arquitectura tisular, lo que permite el análisis simultáneo de múltiples compartimentos de la superficie ocular.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante un protocolo de disección consistente que minimiza el daño tisular y los artefactos de corte.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción al reducir la ambigüedad mecanicista en los modelos de enfermedades oculares mediante la evaluación de tejidos íntegros.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo facilitada por datos histológicos e inmunoensayos confiables obtenidos a partir de preparaciones íntegras de la superficie ocular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de disección microquirúrgica para evitar daños tisulares durante la eliminación del hueso.
- Depende del uso de tijeras afiladas y pinzas finas para la separación precisa de los huesos del cráneo y orbitarios de los tejidos blandos.
- Necesita protocolos estandarizados de fijación utilizando paraformaldehído para mantener la integridad del tejido destinado al corte en secciones.
- Requiere consideraciones de adaptación al aplicarse a diferentes sistemas modelo o etapas de desarrollo.
- Limitación práctica: la eficacia del procedimiento depende de la eliminación completa de los restos óseos para prevenir artefactos durante el corte.
