Name: Perfiles de Complexome de Alta Resolución por Cryoslicing BN-MS Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende el protocolo csBN-MS para el perfilado de complexomas de alta resolución en muestras biológicas diversas. Este método permite analizar complejos de proteínas de membrana con detalle y precisión excepcionales.

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Este estudio fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) – Project-ID 403222702 – SFB 1381 y bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania CIBSS - EXC-2189 - Project ID 390939984. Agradecemos a Katja Zappe por la asistencia técnica.

1. Preparativo BN-PAGE
<ol><li>Preparación de gel<ol>
<li>Utilice un sistema de electroforesis de gel vertical de formato medio a grande (>10 cm de distancia de separación del gel; 14 cm x 11 cm, espaciador de 1,5 mm) con un enfriamiento eficaz ajustado a 10 oC.</li>
		<li>Gel de gradiente de poro lineal o hiperbólico fundido (espaciadores de 1,5 a 3,0 mm) utilizando un mezclador de gradiente de dos cámaras de agitación accionado por una bomba (ver Tabla de Materiales y Reactivos). En el ejemplo presentado (gel de gradiente lineal 1%-13%):<ol>
<li>Preparar una solución de 13 ml para la cámara frontal (mezcla) que consta de: 13% de acrilamida (de 30% de solución en stock, 37,5:1,0 acrilamida:bisacrilamida), ácido aminocaproico de 0,75 M, 50 mM de Bis-Tris (pH a 7,0) y 10% glicerol.</li>
			<li>Preparar una solución de 10 ml para la cámara del depósito que consta de: 1% de acrilamida (de 30% de solución de stock, 37,5:1,0 acrilamida:bisacrilamida), ácido aminocaproico de 0,75 M, 50 mM de Bis-Tris (pH a 7,0) y detergente CL-47 al 0,2% .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Inicie el agitador y agregue 30 microlitros de APS (peroxodisulfato de amonio, solución de stock del 10%) y 2,5 l de TEMED (N,N,N',N',N'-tetrametileeemetilediamina) y 2,5 microlitros de TEMED a la solución en la cámara frontal. Encienda la bomba y abra la válvula delantera (el flujo debe ajustarse para completar la fundición en 10 min). Después de 1 min añadir 90 s de APS y 5 l de TEMED a la solución en la cámara del depósito y abrir la conexión de la cámara.</li>
		<li>Deje que el gel polimerice lentamente pero a fondo durante al menos 24 horas a temperatura ambiente (RT) para generar un gradiente homogéneo de tamaño de poro. Cuando se mantiene húmedo, el gel polimerizado se puede almacenar en posición vertical a 4 oC durante un máximo de 1 semana. NOTA: Intencionalmente, la parte superior del gel tendrá una consistencia suave / viscosa. Esto se eliminará más tarde, pero permite la entrada suave de proteínas en el gel, con un riesgo mínimo de precipitación de proteínas que de otro modo podría conducir a artefactos de migración (es decir, rayado o precipitación de proteínas).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación y carga de muestras<ol>
<li>Prepare las ranuras de carga insertando espaciadores apropiados (por ejemplo, tubos de silicio) entre las placas de vidrio para separar 0,5-2,0 mg de proteína. Las ranuras deben hacerse al menos 3 cm de ancho (o mejor, 5-6 cm de ancho).</li>
		<li>Solubiliza 2,5 mg de membrana (preparación enriquecida con endosoma de riñón de ratón) en 2 ml de tampón de solubilización que contiene 1% (p/v) detergente no desnaturalizante (ComplexioLyte CL-47) durante 30 minutos sobre hielo. Ultracentrífuga (corte de sedimentación a 200 S o menos; 130.000 x g/11 min se utiliza aquí).</li>
		<li>Concentrar el solubilisato en un corto 50%/20% (p/v, 0,3 ml cada uno) gradiente de paso de sacarosa por ultracentrifugación durante 1 h a 400.000 x g. El rendimiento final de la proteína debe ser de al menos 1 mg.</li>
		<li>Añadir 0.05% (p/v) Coomassie G-250 al solubilisato y cargar la muestra en el gel. Limite la carga proteica a una sección transversal de carril de gel de 10-15 g/mm2 para obtener una alta resolución y evitar artefactos resultantes de la precipitación proteica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condiciones de funcionamiento de BN-PAGE<ol>
<li>Para tampones en ejecución, prepare un búfer de cátodo estándar que consista en tricine de 50 mM, 15 mM Bis-Tris y 0,01% coomassie G-250. Preparar un amortiguador de ánodo estándar compuesto por 50 mM Bis-Tris (pH a 7,0).</li>
		<li>Ejecuta un BN-PAGE preparativo a 10oC durante la noche utilizando un protocolo de voltaje de tres pasos13 que consta de: una fase de equilibrio durante 30 min a 100 V, luego una rampa lenta (3 h) a la tensión máxima (40-50 V/cm de longitud) que finalmente se mantiene durante al menos 6 h para enfoque final de las proteínas. NOTA: Se recomienda pausar la electroforesis cuando el frente de migración ha alcanzado la mitad del gel e intercambiar el tampón de cátodo por un tampón fresco sin Coomassie G250. Esto ayuda a evitar los artefactos de precipitación en el gel resultante del colapso local de la estructura de los poros de la matriz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Muestreo y digestión de gel
<ol><li>Escisión de carriles de gel<ol>
<li>Después de la carrera, escanee los geles con fines de documentación mientras lo mantiene entre las placas de vidrio.</li>
		<li>Desmontar las placas e extirpar la(s) sección(s) de carril de interés.</li>
		<li>Tome una tira de muestra del carril para su análisis por 2D BN/SDS-PAGE y la tinción de proteínas o la hincha occidental (como se muestra en la Figura 1B)para determinar las regiones de interés, la resolución efectiva del tamaño complejo y la abundancia de proteínas.</li>
		<li>Arreglar los carriles de gel seleccionados dos veces durante al menos 30 minutos con 30% (v/v) de etanol y 15% (v/v) ácido acético.</li>
		<li>Transfiera la muestra al medio de incrustación y déjela empapar y equilibrar durante al menos 2 h a 4 oC, manteniendo la losa de gel en cámara lenta en un agitador orbital. NOTA: La separación del gel debe inspeccionarse cuidadosamente para comprobar la calidad general de la separación y los artefactos de migración. Las bandas de gel que representan proteínas dominantes deben ser de intensidad libre de distorsión y homogéneas. Los artefactos locales en el gel deben ser extirpado o dejados fuera del análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Emincrustación y corte criomicrotome NOTA: Esta es una versión mejorada del procedimiento de incrustación descrito y fotodocumentado previamente que permite la incrustación y corte de carriles de gel más amplios de hasta 8 cm11.<ol>
<li>En primer lugar, cortar los carriles de gel fijos en secciones (aquí, 3 cm) exactamente paralelas al patrón de la parte frontal/banda de migración de proteínas. Para facilitar el manejo, coloque cada sección en un soporte de película de plástico con las mismas dimensiones.</li>
		<li>Transfiera los carriles en un tubo abierto con tapónes (cerrados en la parte inferior, perforados centralmente en la parte superior, ambos alineados con los extremos superior e inferior de la sección de gel).</li>
		<li>Sumerja el cilindro brevemente en nitrógeno líquido para iniciar rápidamente la solidificación. El medio de incrustación transparente se solidifica en cuestión de segundos y se vuelve de color blanco.</li>
		<li>Llene la cavidad con medio de incrustación, sumerja brevemente en nitrógeno líquido y congele el cilindro a -20 oC durante varias horas. NOTA: Enfriar el cilindro rápidamente sumergiéndolo en nitrógeno líquido ayuda a evitar el desplazamiento de la losa de gel dentro del tubo. Debe evitarse la distorsión para garantizar una alta resolución en el siguiente análisis de la EP.</li>
		<li>Después del desmontaje, retire la película de plástico y transfiera el bloque con la sección de gel incrustada a un cilindro de metal refrigerado, de mayor diámetro, colocado en un soporte plano (es decir, plato Petri) y sellado con medio de incrustación en el exterior del cilindro. Llene el cilindro con medio de incrustación y congele bien.</li>
		<li>Repita este procedimiento con el otro lado del cilindro para obtener un bloque sólido con superficies coplanares.</li>
		<li>Retire el bloque del cilindro, péguelo con un medio de incrustación en un soporte de metal preenfriado e inserte el soporte en la máquina de crioslice (criotome). La superficie del bloque debe estar cuidadosamente alineada con respecto al plano de corte. Permita que se equilibre a la temperatura óptima para el proceso de corte (aquí, -15 oC). NOTA: Utilice un ciclo de corte manual que progresa lentamente de 0,1 mm de tamaño de paso hasta que golpee la superficie de la sección de gel incrustada para garantizar un posicionamiento correcto.</li>
		<li>Cosecha las rodajas de gel una tras otra, con un espesor final deseado de 0,25 mm de tamaño de paso, y transfiéralas individualmente a tubos de reacción con propiedades de baja unión a proteínas. NOTA: En esta configuración, las rodajas de gel uniformes se pueden obtener fácilmente tan delgadas como 0,1 mm y tan gruesas como 0,5 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestión tríptica<ol>
<li>Realizar la digestión tríptica en gel después de un lavado extensivo de las rodajas de gel (se recomiendan al menos tres rondas adicionales de lavado para eliminar los componentes poliméricos del medio de incrustación) siguiendo un procedimiento estándar11.</li>
		<li>Péptidos eluten secados al vacío y redissolve en ácido trifluoroacético del 0,5% (v/v) agitando a 37 oC (10 min) seguido de sonicación del baño (5 min) y una breve centrifugación.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Espectrometría de masas
<ol><li>configuración de nanoHPLC y MS<ol>
<li>Cargue las muestras digeridas en una precolumna C18 (tamaño de partícula de 5 m; diámetro a 300 m) con ácido trifluoroacético del 0,05% (v/v) utilizando un nano-HPLC (libre de división) acoplado a un espectrómetro de masas con alta resolución.</li>
		<li>Elute capturó péptidos con un gradiente acuoso-orgánico (eluyente A): 5 min 3% B, 120 min de 3% B a 30% B, 20 min de 30% B a 99% B, 5 min 99% B, 5 min de 99% B a 3% B, 15 min 3% B (tasa de flujo a 300 nL/min). NOTA: las rodajas de gel csBN-MS suelen dar como resultado muestras con abundancia de péptidos bajos a intermedios y un grado limitado de complejidad. Por lo tanto, el análisis nanoLC-MS/MS debe realizarse con una configuración que proporcione una sensibilidad y velocidad de secuenciación razonables, una alta resolución de masa (>100.000) y un rango dinámico máximo (efectivamente 3-4 órdenes de magnitud). Sin embargo, no requiere dimensiones de columna largas o gradientes de elución extendidos más allá de 3 h.</li>
		<li>Separar los péptidos eludados en un emisor (i.d. 75 m; punta a 8 m) embalados manualmente aproximadamente 20 cm con material C18 (tamaño de partícula a 3 m). Electrospray las muestras a 2,3 kV (modo iónico positivo) en el capilar de transferencia calentado (250 oC) del espectrómetro de masas.</li>
		<li>Realizar análisis con los siguientes ajustes del instrumento11: tiempo máximo de inyección de MS/MS a 400 ms; duración de la exclusión: 60 s; umbral de señal mínimo: 5.000 recuentos, los 10 principales precursores fragmentados; anchura de aislamiento a 1,0 m/z). NOTA: Para facilitar la calibración de la masa, el tiempo de retención y la asignación de señales de péptidos en un gran número de conjuntos de datos o mediciones, se recomienda realizar las respectivas series de medición de EM sin interrupciones ni cambios en los parámetros y el hardware ( es decir, en la misma columna/emisor C18).</li>
	</ol></li>
	<li>Identificación de proteínas (datos de MS evaluados como se describió anteriormente11)<ol>
<li>Extraiga listas de picos de espectros de iones de fragmentos utilizando la herramienta "msconvert.exe" (parte de ProteoWizard).</li>
		<li>Cambie todos los valores m/z precursores para cada conjunto de datos por el desplazamiento mediano m/z de todos los péptidos asignados a proteínas en una búsqueda preliminar de la base de datos con tolerancia de masa de péptidos de 50 ppm.</li>
		<li>Busque en las listas de picos corregidos con un motor de búsqueda adecuado (aquí, Mascot 2.6.2) contra todas las entradas del ratón de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot (versión 2018_11).</li>
		<li>Seleccione "Acetil (proteína N-término)", "Carbamidomethyl (C)", "Gln ? pyro-Glu (N-término Q), Glu piro-Glu (N-término E)", "Oxidación (M)" y "Propionamida (C)" como modificaciones variables.</li>
		<li>Ajuste la tolerancia de la masa de péptidos y fragmentos a 5 ppm y a 0,8 Da, respectivamente, y permita una escisión tríptica perdida. Establezca el límite de valor esperado para la identificación de péptidos en 0,5 o menos. Utilice una búsqueda de base de datos de señuelo para determinar la tasa de detección de falsos positivos (FDR). Establezca el FDR en 1% o aplique criterios de calidad adicionales para garantizar una identificación fiable. NOTA: El experimento presentado identificó más de 3.500 proteínas, con un péptido medio FDR de 4,4 a 0,77% (n a 101 muestras de rodajas), o 3.000 proteínas cuando el péptido FDR se estableció en 1%. Es importante destacar que se utilizaron criterios más estrictos para la selección de proteínas perfiladas (2.568). Incluía todas las proteínas que se identificaron con al menos dos péptidos, al menos uno de ellos es específico de proteínas, en al menos una de las 101 muestras de rodajas.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuantificación de proteínas<ol>
<li>Utilice intensidades de señal de péptidos (volúmenes máximos [PV]) para la cuantificación de proteínas que se obtienen de las exploraciones completas FT y corrigen el tiempo de retención y los cambios de masa utilizando el software adecuado (aquí, MaxQuant v1.6.3).</li>
		<li>Alinee los datasets de MS uno por uno para hacer referencia a los tiempos de elución de péptidos (promedio total) utilizando la regresión LOESS. Asigne PV a péptidos directamente (identificación basada en MS/MS) o indirectamente (es decir, en función de su m/z coincidente y tiempo de elución dentro de tolerancias muy estrechas). NOTA: Este protocolo utiliza software interno para la asignación de los péptidos "insertados". Los parámetros de conjunto dan como resultado tolerancias efectivas de coincidencia de tiempo de eliminación de tiempo de laución de 2 ppm y 1 min, respectivamente (véase la figura 2A,B).</li>
		<li>Correcto para variaciones sistemáticas de la carga de péptidos y la eficiencia de la ionización mediante el reescalado de intensidad de péptidos calculado a partir de las diferencias medianas de intensidades relativas de péptidos entre muestras de rodajas vecinas(Figura 2C).</li>
		<li>Filtre los datos fotovoltaicos para los valores atípicos y las asignaciones de falsos positivos restantes identificadas por el análisis interno de coherencia fotovoltaica.</li>
		<li>Normalice los PV de cada péptido a sus valores máximos en todos los conjuntos de datos de sectores que producen perfiles de abundancia de péptidos relativos.</li>
		<li>Por último, calcule los perfiles de abundancia de proteínas relativas como promedios de al menos dos (y hasta seis o 50%, cualquier valor mayor) de los perfiles de péptidos mejor correlacionados sobre una ventana de tres rebanadas consecutivas. Esto permite puentear los valores fotovoltaicos que faltan y reducir el ruido. NOTA: Esto finalmente dio lugar a 2.545 perfiles proteicos(Figura 2D).</li>
	</ol></li>
	<li>Caracterización de complejos proteicos<ol>
<li>Analice los perfiles de proteínas realizando primero la detección de picos utilizando el método de máxima local, y ajuste consecutivamente las distribuciones normales a estos picos, produciendo la posición (es decir, índice de rodajas o tamaño complejo aparente) de su máxima y FWHM (ancho completo a estos picos valores de intensidad media máxima) (recuadro de la Figura 4). NOTA: En el conjunto de datos, los perfiles se analizan automáticamente mediante scripts personalizados. Los valores FWHM más pequeños son indicativos de la resolución de tamaño efectiva del enfoque (aquí, 6 x 0,25 x 1,5 mm).</li>
		<li>Utilizar picos complejos proteicos de referencia con masa molecular definida (como se indica en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot) para el análisis de regresión lineal de los valores log10 (masa molecular predicha) para convertir índices de números de sectores en tamaños moleculares aparentes (es decir, tamaño complejo aparente en kDa). NOTA: En este estudio se seleccionaron 23 complejos de marcadores en la muestra(Figura 4) basándose en (i) formas monodispersas de picos de perfil, (ii) soporte experimental de pesos moleculares y (iii) distribuciones a lo largo de las secciones de gel BN-PAGE investigadas.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

El autor Uwe Schulte es un empleado y accionista de Logopharm GmbH que produce ComplexioLyte 47 utilizado en este estudio. La compañía proporciona reactivos ComplexioLyte a instituciones académicas sin fines de lucro.

El estudio presentado se basó en la técnica csBN-MS previamente comparada con una preparación mitocondrial11 e incorporó mejoras en la preparación de muestras, procesamiento de gel y evaluación de datos de MS. El análisis centrado de una sección del gel BN-PAGE de separación a gran escala proporcionó un conjunto completo de datos que muestran medidas de calidad comparables al estudio con membranas mitocondriales. Los errores de masa y tiempo de retención, así como las variaciones de ejecución a ejecución, se mantuvieron muy bajos y proporcionaron la base para determinar perfiles confiables de abundancia de proteínas. La resolución del tamaño parecía ser buena, con anchos máximos de media máxima tan bajos como seis sectores (correspondientes a 1,5 mm, Figura 4) y diferencias de tamaño relativas de menos del 10% resueltas(Figura 3, Figura 5A). Estos valores no cumplían plenamente con la calidad de resolución de tamaño del análisis anterior de csBN-MS de las mitocondrias (a pesar del tamaño de paso de muestreo de gel más pequeño elegido), pero son significativamente mejores que el rendimiento del BN-MS convencional o la 20 que recientemente se han popularidos.
La importancia de una resolución de tamaño complejo efectiva alta se subraya en el experimento de simulación de la Figura 3 (utilizando los complejos asociados a TPC1) que difícilmente se puede resolver mediante el análisis de la mancha occidental 2D BN/SDS-PAGE(Figura 1B). Estos resultados sugieren que el corte de 0,25 mm en este caso dio lugar a un cierto sobremuestreo, pero esto todavía resultó ser útil para la eliminación del "ruido de cuantificación" sin comprometer la resolución efectiva del tamaño. Por lo tanto, en línea con los resultados anteriores11, un tamaño de paso de muestreo de 0,3 mm es generalmente recomendable.
En particular, la discriminación de los complejos asociados a TPC1 se pierde por completo con el muestreo de gel de 1 mm, que es el tamaño de paso más pequeño proporcionado por la división manual en BN-MS5convencional,6. Esto puede explicar el hecho de que a pesar de que las potentes tecnologías de LA MS están disponibles, muy pocos complejos proteicos y subunidades han sido identificados de novo por perfiles de complexome. Además de su buena potencia de resolución, csBN-MS ofrece una alta versatilidad. Los complejos unidos a membranas y los complejos de proteínas solubles que van desde 50 kDa a varios MDa se pueden resolver eficazmente en un solo experimento con un sesgo mínimo11. Esto contrasta con técnicas de separación alternativas utilizadas para perfiles de complexome como la exclusión de tamaño o la cromatografía de intercambio iónico, que funcionan con subconjuntos de proteínas solubles con ciertos rangos de tamaño o propiedades de carga. En el lado negativo, csBN-MS es menos escalable (carga máxima de 3 mg de proteína por gel), puede ser técnicamente difícil y no se puede automatizar.
En general, los resultados demuestran que la elaboración de perfiles de complexoma basados en csBN-MS se puede aplicar con éxito a objetivos no mitocondriales, pero también indican algunos desafíos asociados. Por lo tanto, la extracción eficiente y la estabilidad bioquímica de los complejos proteicos requieren más optimización, y pasos de limpieza y todavía pueden ser limitados. Dentro de la ventana de tamaño investigada, el número de complejos de proteínas monodispersas bien enfocados fue de hecho considerablemente menor (datos no mostrados) en comparación con una muestra mitocondrial. También se recomienda reducir las cargas de muestra BN-PAGE para obtener una separación de gel aceptable. Las cargas más altas pueden requerir carriles de gel más amplios que son más difíciles de procesar correctamente para el corte (ver vídeo adjunto). Además, la complejidad proteica de las muestras era mayor (alrededor de dos veces) que los digeridos derivados de las mitocondrias, lo que llevó a que falten más valores fotovoltaicos y un rango dinámico reducido. De hecho, algunas proteínas pequeñas que se espera que formen parte de los complejos mostrados en la Figura 5 faltaban en los análisis. Estos problemas se pueden resolver en el futuro mediante el uso de instrumentos de EM más rápidos y sensibles o modos de adquisición independientes de datos.
La preparación de muestras es muy crítica para la recuperación de complejos proteicos, la estabilidad y la calidad de la separación del gel. Los parámetros y procedimientos deben optimizarse para cada tejido fuente, lisato celular, membrana (fracción) y complejo proteico de interés. Se proporcionan las siguientes recomendaciones generales que pueden ayudar a ampliar las aplicaciones de csBN-MS:
(i) Preparación de muestras frescas y evitar calentamiento/congelación, diluciones fuertes, cambios en las condiciones de amortiguación y retrasos innecesarios;
(ii) Usar tampones que estén esencialmente desprovistos de sales (reemplazar con 500-750 mM de betaína o ácido aminocaproico), alrededor de un pH neutro, y que contenga hasta un 1% (p/v) de detergente no desnaturalizante (relación proteína:detergente entre 1:4-1:10 para la solubilización de la membrana complejos proteicos, sin detergente necesario para los complejos proteicos solubles);
(iii) Pruebas cuidadosas y ajuste de las condiciones del detergente mediante BN-PAGE analítico, ya que estos pueden afectar fuertemente a la eficiencia de la solubilización compleja, la representación de complejos proteicos de membrana en la muestra, la estabilidad y la homogeneidad de micelas de proteínas y detergentes. Estos últimos son requisitos previos para que las proteínas se enfoquen como bandas distintas/poblaciones complejas en geles BN-PAGE. La literatura anterior ofrece una amplia gama de detergentes neutros. Sin embargo, DDM (n-dodecílalo-d-maltoside)1,2,4,5,6 y digitalina3,5,7,8, 9,10,13,18 han sido las opciones más populares para los análisis BN-MS hasta el momento. Debe subrayarse que cualquier condición detergente representa necesariamente un compromiso entre la eficiencia de la solubilización y la preservación de las interacciones proteicas y puede no ser igualmente adecuada para todos los tipos de proteína objetivo y material de origen;
(iv) Extracción de polímeros cargados como fibrillas, filamentos, polilisina, ADN y abundantes componentes de menor peso molecular (es decir, metabolitos, lípidos o péptidos). Esto se puede lograr mediante ultracentrifugación, filtración de gel o diálisis. Esto es particularmente importante para los lisados celulares o tisulares totales;
(v) Adición de Coomassie G-250 (concentración final 0,05%-0,1%) y sacarosa (para aumentar la densidad de carga, concentración final 10%-20% [p/v]) a la muestra justo antes de la carga, para borrar por ultracentrifugación corta, cargar la muestra sin perturbación e iniciar la carrera inmediatamente después.
Como perspectiva futura, el perfilado de complexoma basado en csBN-MS ofrece opciones de multiplexación para estudiar dinámicas complejas de proteínas o cambios relacionados con condiciones biológicas específicas. La separación combinada de muestras etiquetadas metabólicamente como propuesta para la elaboración de perfiles21 basada en la exclusión de tamaño parece sencilla, pero puede verse obstaculizada por el intercambio espontáneo de subunidades en complejos que se producen independientemente de la separación utilizada Método. Alternativamente, las muestras etiquetadas se pueden resolver en carriles de gel vecinos, que luego se pueden co-cortar o combinar después de la digestión para el análisis diferencial con alta sensibilidad y robustez.

La separación BN-PAGE se acoplaba primero directamente al análisis LC-MS (BN-MS) por los grupos de investigación Majeran1 y Wessels2 utilizando la división manual de carriles de gel BN-PAGE. Sus análisis identificaron una serie de abundantes complejos proteicos de membrana con composición de subunidades conocidas a partir de plastoides vegetales y mitocondrias de células HEK, respectivamente. Sin embargo, estos análisis distan mucho de ser exhaustivos y no permitieron la identificación imparcial de conjuntos novedosos. El rendimiento de los espectrómetros de masas y los métodos de cuantificación sin etiquetas ha mejorado considerablemente desde entonces, lo que ha permitido análisis completos de BN-MS. Esto ha acuñado el término "perfilado complexome". Por ejemplo, Heide y sus compañeros de trabajo analizaron las mitocondrias del corazón de rata identificando y agrupando 464 proteínas mitocondriales, confirmando así muchos conjuntos conocidos. Además, encontraron que TMEM126B era una subunidad novedosa y crucial de un complejo de ensamblaje específico3. Se obtuvieron resultados comparables (con 437 perfiles de proteína mitocondrial) en un estudio paralelo de las mitocondrias de células HEK4.
A pesar de estas mejoras, han seguido varias cuestiones que restringen todo el potencial del BN-MS para la elaboración de perfiles de complexome. Una limitación importante es la resolución efectiva del tamaño de los complejos que está determinada por dos factores: la (i) calidad de la separación BN-PAGE, que depende de la uniformidad del gradiente de poros de la matriz de gel, así como de la estabilidad/solubilidad de los complejos de muestra, y (ii) tamaño de paso de muestreo de gel, que es en el mejor de los 1 mm cuando se utiliza el corte manual convencional5,6. La mala resolución de tamaño no sólo echa de menos las sutiles isoformas complejas y las heterogeneidades, sino que también afecta negativamente el rango dinámico y la confianza de la asignación y cuantificación de subunidades de novo imparciales.
Otros desafíos incluyen la precisión de la cuantificación de proteínas y la cobertura del rango dinámico real de abundancias de proteínas en la muestra mediante análisis espectrométricos de masas. Por lo tanto, la aplicación de perfiles de complexoma BN-MS ha permanecido restringida en gran medida a muestras biológicas con menor complejidad, alta expresión de complejos objetivo y propiedades favorables de solubilización (es decir, plastoides, mitocondrias y microorganismos)6,7,8,9,10.
Recientemente introdujimos BN-MS asistida por corte criomicrotome (csBN-MS), que combina un muestreo submilimétrico preciso de carriles de gel BN-PAGE con un análisis exhaustivo de la EM y un procesamiento de datos de EM elaborado para la determinación de perfiles proteicos con confianza11. La aplicación a una preparación de membrana mitocondrial a partir de cerebros de rata demostró una resolución efectiva de tamaño complejo no satisfecha y una cobertura máxima de subunidades de complejo de cadena respiratoria oxidativa (OXPHOS) (es decir, 90 de 90 MS accesibles). En este ejemplo también se identificaron varios conjuntos de proteínas novedosos.
Aquí se describen procedimientos optimizados para la separación BN-PAGE a escala preparatoria de los complejos proteicos (no restringido a una fuente biológica en particular), la fundición de grandes geles BN-PAGE preparativos, el corte de criomicrotome de carriles de gel amplios y los datos de EM Tratamiento. El rendimiento de la generación de perfiles de alta resolución está demostrado para una preparación compleja de proteínas a partir de membranas enriquecidas con endosomas renales de ratón. Por último, se analizan los beneficios del aumento de la resolución y la precisión de la cuantificación espectrométrica de masas.

<table><tbody><tr><td>Solución de acrilamida/Bis al 30%, 37.5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>Recomendado para soluciones de gel de gradiente de acrilamida de hasta 13%</td></tr><tr><td>30% Solución de Acrilamida/Bis, 19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>Recomendado para soluciones de gel de gradiente de acrilamida >13%</td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Blot Stain</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>Tinción de proteínas totales en membranas de blot; sensible y compatible con la inmunodetección</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Serva</td><td>n.º 35050</td><td>Soluciones madre centrífugas antes de su uso</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>Tampón detergente listo para usar (1%) para la solubilización suave de proteínas de membrana</td></tr><tr><td>Medio de inclusión / Medio de congelación de tejidos</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>14020108926 Medio de inclusión para secciones de gel que se van a cortar con un criomicrótomo</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-P, PVDF, 0,45 y micro; m</td><td>Merck</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Reactivo de detección</td> GE <td>Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de plástico con tapón de goma, 20-30 ml</td><td>n.a.n.a.cualquier</td><td></td> <td>proveedor, importante para la fabricación de sección de gel herramienta</td></tr><tr><td>de inclusión hoja de afeitar ancha n.a.n.a.cualquier</td><td></td><td></td> <td>proveedor, para BN-PAGE recorte de gel / escisión de carriles</td></tr><tr><td>tubo / cilindro metálico, aprox. 4 cm </td> Molde largo <td>n.a.n.a.Mof</td><td></td> <td>para la inclusión y congelación de muestras de gel</td></tr><tr><td>Tubos LoBind de proteínas, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>muy recomendable para minimizar la pérdida de proteínas/péptidos debido a la absorción</td></tr><tr><td>de tripsina modificada de grado secuencial</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 Precolumna PepMap100, tamaño de partícula 5 y micro; m</td><td>Emisor Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454</td><td></td></tr><tr><td>PicoTip (i.d. 75 y micro; m; punta 8 y micro; m)</td><td>Nuevo objetivo</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 y micro; m)</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93.</td><td>Columnas empaquetadas manualmente</td></tr><tr><td>anticuerpo anti-TPC1 de conejo</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>producción personalizada</td><td>descrita en Castonguay, et al., 2017 (Referencia 12)</td></tr><tr><td>Cy3-biotinilado cabra anti-conejo</td><td>IgG Vector Laboratories</td><td>CY-1300</td><td>descrito en Castonguay, et al., 2017 (Referencia 12)</td></tr><tr><td>lectina de Lotus tetragonolobus biotinilada, Laboratorios de vectores conjugados con FITC</td><td></td><td>#B1325</td><td>descrita en Castonguay, et al., 2017 ( Referencia 12)</td></tr><tr><td>criomicrótomo Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II Cell con unidad wetblot</td><td>Bio</td><td>Rad n.a.para</td> <td>SDS-PAGE y Westernblot (no se vende más)</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis en gel Penguin Midi</td><td>PeqLab</td><td>n.a.para</td> <td>BN-PAGE (ya no se vende)</td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Axiovert 200 M + Cámara digital Photometrics Coolsnap 2</td><td>Zeiss / Fotometría</td><td>n.a.bomba</td><td></td></tr> <tr><td>peristáltica (IP multicanal de alta precisión)</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td>para la fundición de geles de poliacrilamida en</td></tr><tr><td>gradiente mezclador de gradiente con agitación (dos cámaras)</td><td>hecho por él mismo, alternativamente Bio Rad</td><td>1652000 o 1652001</td><td>para la fundición de geles de poliacrilamida en gradiente, el manual proporciona instrucciones para fundir geles de gradiente lineales o hiperbólicos (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td></tr><tr><td>ultracentrífuga Sorvall M120 con rotor S80 AT3</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.a.para</td> <td>la preparación de muestras (ya no se vende)</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Espectrómetro de masas Elite</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

perfiles de complexome de alta resolución por cryoslicing bn-ms analysis

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Las proteínas generalmente ejercen funciones biológicas a través de interacciones con otras proteínas, ya sea en conjuntos dinámicos de proteínas o como parte de complejos establemente formados. Este último se puede resolver elegantemente según el tamaño molecular utilizando electroforesis de gel de poliacrilamida nativa (BN-PAGE). El acoplamiento de estas separaciones a la espectrometría de masas sensible (BN-MS) ha sido bien establecido y teóricamente permite una evaluación exhaustiva del complexomo extraíble en muestras biológicas. Sin embargo, este enfoque es bastante laborioso y proporciona una resolución y sensibilidad de tamaño complejo limitado. Además, su aplicación se ha restringido a abundantes proteínas mitocondriales y plastoides. Por lo tanto, para la mayoría de las proteínas, todavía falta información sobre la integración en complejos proteicos estables. Aquí se presenta un enfoque optimizado para el perfilado de complexome que comprende la separación BN-PAGE a escala preparatoria, el muestreo submilimétrico de carriles de gel anchos por corte criomicrotoya, y el análisis espectrométrico de masas con cuantificación de proteínas sin etiquetas. Los procedimientos y herramientas para los pasos críticos se describen en detalle. Como aplicación, el informe describe el análisis de complexoma de una fracción de membrana enriquecida con endosoma solubilizada de los riñones del ratón, con 2.545 proteínas perfiladas en total. Los resultados demuestran la identificación de proteínas de membrana uniformes y de baja abundancia, como los canales iónicos intracelulares, así como patrones complejos de ensamblaje de proteínas de alta resolución, incluidas las isoformas de glicosilación. Los resultados están de acuerdo con análisis bioquímicos independientes. En resumen, esta metodología permite la identificación integral e imparcial de los complejos proteicos (super)complejos y su composición de subunidades, proporcionando una base para investigar la estequiometría, el montaje y la dinámica de interacción de los complejos proteicos en cualquier sistema biológico.

Se presenta un protocolo BN-MS crioscrioso versátil que utiliza un microtome para perfiles de complexomo de alta resolución.

Perfiles de Complexome de Alta Resolución por Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

El objetivo central para el desarrollo de la técnica csBN-MS era obtener acceso integral a la organización y montaje de complejos proteicos que subyacen a la transducción de señales en y a través de la membrana plasmática de varios tipos de tejido y órganos. csBN-MS actualmente proporciona la mayor versatilidad de resolución para el análisis del complejo proteico nativo y su composición de subunidades, en particular con respecto a las proteínas de membrana. Aunque la técnica csBN-MS fue desarrollada para analizar mezclas complejas de conjuntos de proteínas de membrana en el cerebro de roedores, se puede adaptar fácilmente al análisis de cualquier tipo de muestra biológica.Uno de los pasos clave de nuestro método es la incrustación de la pieza de gel y su correcta alineación con el plano de corte antes de cortar. Tenga cuidado de no rasgar o comprimir el gel y asegúrese de que no está inclinado al plano de corte ya que esto reduciría la resolución del análisis. Nuestra técnica csBN-MS tiene varios pasos prácticos que son cruciales para obtener buenos resultados.Es más fácil mostrar cómo realizar esos pasos en detalle que simplemente describiéndolos. Para comenzar este procedimiento utilice un mezclador de gradiente de dos cámaras de agitación accionado por una bomba para lanzar un gel de gradiente de poro lineal o hiperbólico. Prepare soluciones para la cámara de mezcla frontal y la cámara del depósito como se describe en el protocolo de texto.Encienda el agitador y agregue 30 microlitros de APS y 2.5 microlitros de TEMED a la solución en la cámara frontal. A continuación, encienda la bomba y abra la válvula frontal. Después de aproximadamente un minuto, agregue 90 microlitros de APS y cinco microlitros de TEMED a la cámara del depósito y abra la conexión de la cámara.Deje que el gel se polimerice lentamente y a fondo durante al menos 24 horas a temperatura ambiente para generar un gradiente de tamaño de poro homogéneo. Si se mantiene húmedo, el gel polimerizado se puede almacenar en posición vertical a cuatro grados centígrados durante un máximo de una semana. A continuación, prepare las ranuras de carga insertando los espacios adecuados entre las placas de vidrio para separar entre 0,5 y 2,0 miligramos de proteína.Las ranuras deben tener al menos tres centímetros de ancho. Para los búferes de carrera, prepare un tampón de cátodo de pie que consista en tricines milimolar, 50 Bis-Tris mililares y 0.01%Coomassie G-250. Prepare un búfer de ánodo estándar que consista en 50 Bis-Tris mililosos.Solubilizar aproximadamente 2,5 miligramos de membrana y dos mililitros de tampón de solubilización que contiene un 1% de detergente no desnaturalizante sobre hielo durante 30 minutos. A continuación, ultracentrífuga a 130,000 veces G durante 11 minutos. Concentrar el solubilato en un gradiente corto de 50%20% de sacarosa por ultracentrifugación a 400.000 veces G durante una hora.Después de esto, cosecha el gradiente de sacarosa de la parte inferior del tubo, añadir 0.05%Coomassie G-250 al solubilato, y cargar la muestra en el gel. Ejecute un BN-PAGE preparativo a 10 grados Centígrados durante la noche utilizando un protocolo de voltaje de tres pasos, como se describe en el protocolo de texto. Después de que el gel ha ejecutado escanear los geles para fines de documentación mientras se mantiene entre las placas de vidrio.Inspeccione la calidad de la separación del gel. A continuación, desmontar las placas e extirpar los tramos de carril de interés. Fije los carriles dos veces con 30% de etanol y 15%ácido acético durante al menos 30 minutos.Transfiera la muestra del medio de incrustación y permita que se empape y equilibre durante al menos dos horas mientras mantiene la losa de gel en cámara lenta en un agitador orbital. A continuación, corte los carriles de gel fijos en secciones exactamente paralelas al frente de migración de proteínas, o patrón de banda. Coloque cada sección sobre un soporte de película de plástico con las mismas dimensiones para facilitar su manipulación.Transfiera los carriles a un tubo abierto con tapones que están cerrados en la parte inferior y perforados centralmente en la parte superior, ambos alineados con precisión con los extremos superior e inferior de la sección de gel. Sumerja el cilindro en el nitrógeno líquido brevemente para iniciar rápidamente la solidificación. El medio de incrustación transparente se solidifica en cuestión de segundos y se convierte en blanco en color.Llene la cavidad con medio de incrustación, sumerja brevemente el cilindro en nitrógeno líquido y luego deje que se congele a fondo a menos 20 grados centígrados durante varias horas. Después del desmontaje, retire la película de plástico y transfiera el bloque con la sección de gel incrustado a un cilindro de metal enfriado. El cilindro es más grande en diámetro y sellado en el exterior con medio de incrustación.Se coloca sobre un soporte plano. Llene el cilindro con el medio de incrustación y congele bien como se mencionó anteriormente. Repita este procedimiento con el otro lado del cilindro para obtener un bloque sólido con una superficie inferior coplanar.A continuación, retire el bloque del cilindro y utilice el medio de incrustación para pegarlo en un soporte de metal preenfriado. Inserte el soporte metálico en la máquina criosalte. El soporte debe estar cuidadosamente alineado con respecto al plano de corte.Permita que el bloque se equilibre a la temperatura óptima para el proceso de corte. Después de esta cosecha el gel se corta una tras otra con un espesor final deseado de 0,25 milímetros de tamaño de paso y transferirlos individualmente a tubos de reacción con propiedades de unión a proteínas bajas. A continuación, las rebanadas se someten a un resumen tríptico y a un análisis espectrométrico de masas.Este protocolo amplía la aplicación del perfil de complexoma de alta resolución a membranas no mitocondriales que expresan proteínas de baja abundancia. La separación compleja muestra bandas de proteínas fuertemente manchadas con muy pocos artefactos migratorios. Las desviaciones de las señales de péptido en masa y tiempo de retención indican una tasa muy baja para la asignación de volumen máximo falso positivo.Las variaciones de ejecución a ejecución se eliminan fácilmente mediante el reescalado de los conjuntos de datos de volumen máximo. La información resultante sobre la intensidad del péptido se utiliza para reconstruir 2545 perfiles proteicos de abundancia relativa. La relevancia del tamaño de la etapa de muestreo de gel para la resolución de complejos proteicos se evaluó uniendo conjuntos de datos de rodajas adyacentes.Con 0,25 milímetros, la separación de tamaño de las poblaciones complejas asociadas al TPC1 está muy de acuerdo con los resultados del análisis de manchas occidentales. La unión de más de dos sectores abolió la discriminación de subpoblaciones complejas de TPC1. Por último, el análisis proporciona información sobre complejos bien caracterizados y demuestra la existencia de nuevas subunidades y ensamblajes complejos.Para la ferritina, los perfiles de subunidades ajustados por su abundancia relativa sugieren la existencia de al menos tres isoformas complejas con estequiometrías distintas de cadena pesada/ligera. Por el contrario, los complejos nicalin-nomo1, el complejo central gamma-secretasa y la maquinaria GPI-transamidase muestran proporciones de abundancia fija de sus subunidades principales en todo el rango de tamaño e independientes de la asociación con proteínas adicionales. El parámetro clave del análisis csBN-MS es la resolución efectiva de los complejos, que se determina mediante bioquímica de muestras, calidad de gel BN, alineación adecuada durante la incrustación y corte, y la calidad de los datos de MS adquiridos.La combinación de csBN-MS con el etiquetado de isótopos de proteínas y muestras permitirá la comparación directa de complejos en diferentes estados fisiopatológicos, biológicos o de desarrollo. csBN-MS realizado en membranas del cerebro de roedores reveló la enorme diversidad de receptores, canales iónicos y transportadores con respecto a su subunidad y su función, y será instrumental para analizar la estructura 3D en preparaciones nativas.

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Investigación

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