Name: Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Aprende a caracterizar agregados proteicos individuales mediante nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica de alta resolución. Estas técnicas permiten visualizar el autoensamblaje de proteínas relacionado con enfermedades neurodegenerativas.

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Los autores agradecen a Swiss National Foundation for Science (SNF) el apoyo financiero (número de subvención P2ELP2_162116 y P300P2_171219), el Darwin College, el programa Erasmus+ para el apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de apoyo financiero (número de subvención 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) y el programa de subvención la investigación que ha dado lugar a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación en el marco del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (7PM/2007-2013) a través de la beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Beca PhysProt (acuerdo número 337969), la Fundación Newman (T.P.J.K.) y La Centro de Cambridge para Enfermedades deSdoblamiento (C.G., M.V. y T.P.J.K.).

1. Ensayos de agregación en lectores de placas de fluorescencia
NOTA: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo estudiar la agregación de cualquier proteína o péptido por cinética química. En particular, describe un protocolo optimizado para estudiar la agregación del péptido A-42, que participa en la aparición y progresión de la enfermedad de Alzheimer58,59. Un protocolo similar puede ser ajustado y adoptado para estudiar la agregación de cualquier proteína o péptido.
<ol><li>Obtener una solución monomérica altamente pura de A-42 a través de técnicas de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión de tamaño para distinguir las fracciones proteicas que contienen A-42, y para aislar la fracción monomérica de otras formas agregadas de A-42 obtenidas58 , 59.</li>
	<li>Diluir el péptido A-42 en tampón de fosfato sódico de 20 mM, 200 m de EDTA a pH 8,058 a una concentración final deseada que oscila entre 1 x 5 m, en tubos de baja unión de 1,5 ml. Las muestras recogidas para las mediciones de AFM no deben contener el tinte fluorescente utilizado en el ensayo de agregación (thioflavin T, ThT), ya que podría introducir artefactos durante la deposición de la muestra para el análisis de AFM. Por lo tanto, preparar los triplicados de dos soluciones idénticas: i) la primera que contiene A-42 monomérico para seguir el proceso de agregación por AFM; ii) el segundo que contiene el A-42 monomérico con adición de 20 M ThT como trazador para monitorear la cinética de la agregación. NOTA: Es importante realizar los pasos 1.1 y 1.2 sobre hielo. Este procedimiento es para asegurarse de que la solución monomérica A-42 no se agrega hasta que se inicie en el lector de placas. Al manipular muestras, el pipeteo cuidadoso es esencial para evitar la introducción de burbujas de aire que puedan afectar a la muestra de proteínas.</li>
	<li>Pipetear 80 l de cada muestra en cada pocal de una placa de 96 pocillos y media superficie de poliestireno negro con superficies de fondo transparente y no vinculantes.</li>
	<li>Sellar la placa con una lámina para minimizar la evaporación de la muestra en el transcurso de la agregación.</li>
	<li>Equilibrar la temperatura del lector de placas a 37oC.</li>
	<li>Configurar el protocolo de agregación para leer mediciones de fluorescencia a intervalos de tiempo fijos, a una longitud de onda de excitación de 440 nm y una longitud de onda de emisión de 480 nm. La agregación debe iniciarse en condiciones de reposo.</li>
	<li>Inserte la placa en el lector de placas. NOTA: Es importante tener cuidado al manipular la placa, para asegurarse de que la agregación no se activa antes de iniciar el lector de placas. Utilice los ajustes de ajuste de ganancia para garantizar la lectura óptima de la fluorescencia de cada muestra.</li>
	<li>Inicie la medición. NOTA: El experimento de agregación concluye cuando la curva sigmoidal de fluorescencia ThT alcanza una meseta58.</li>
</ol>2. Preparación de muestras para mediciones de AFM y nano-IR
<ol><li>Pegue el disco de mica V1 de grado de alta calidad al disco magnético de acero inoxidable de alta calidad utilizando pestañas adhesivas o cinta adhesiva de doble cara.</li>
	<li>Etch mica colocando un trozo de cinta adhesiva en la superficie de la mica y tirando de la capa superior de la mica. Este procedimiento producirá una superficie limpia, atómicamente plana, adecuada para la deposición de la muestra. NOTA: La superficie grabada debe ser uniforme y lisa. ADVERTENCIA: No toque ni respire directamente sobre la mica recién grabada, ya que esto introducirá artefactos.</li>
	<li>Pausar/detener la medición del lector de placas para recoger el punto de tiempo de interés durante el proceso de agregación de la proteína.</li>
	<li>Retire la lámina de sellado y recoja la alícuota de 10 ml de las muestras sin ThT del pozo en tubos de baja unión de 1,5 ml.</li>
	<li>Deposite los 10 s de la muestra en la mica recién grabada. Para las mediciones AFM-IR, las muestras deben depositarse en sustratos de oro recién despojados.</li>
	<li>Incubar la solución en la mica durante 1 min para permitir la fisisorbción. NOTA: Un tiempo de incubación más largo permitiría una mejor absorción en la superficie, pero puede inducir la autoorganización artificial y el autoensamblaje25. Para evitar estos efectos, la deposición por pulverización puede ser explotada25.</li>
	<li>Enjuagar tres veces con 1 ml de agua ultrapura.</li>
	<li>Secar bajo un suave flujo de nitrógeno para medir la muestra en el ambiente del aire.</li>
</ol>3. Imágenes AFM de la morfología de los agregados proteicos
NOTA: Las mediciones de morfología se pueden realizar tanto en modo de contacto como dinámico, en los pasos siguientes se describe este último ya que reduce las fuerzas laterales para medir la morfología 3D de la muestra con alta resolución. Las mediciones AFM-IR se realizarán en modo de contacto para mejorar la relación señal-ruido AFM-IR.
<ol><li>Encienda el sistema AFM al menos 30 minutos antes de las mediciones para permitir que el sistema alcance la estabilidad térmica. Haga clic en Configuracióny, a continuación, en Sondeo. En la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente para preparar Z, Etapa de enfoque.</li>
	<li>Apague el interruptor de haz AFM (si está encendido). Desbloquee los bloqueos de cola de milano, desconecte la cabeza del sistema y en la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente.</li>
	<li>Monte el voladizo AFM en el soporte de la sonda. Conecte la cabeza al sistema y bloquee los bloqueos de cola de milano. NOTA: Los voladizos óptimos para estudiar muestras biológicas en modo dinámico AFM tienen constante de resorte que oscila entre 2 x 40 N m-1 y radios de ápice que oscilan entre 2 x 8 nm14.</li>
	<li>Encienda el interruptor de haz láser AFM y en la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente.</li>
	<li>En la ventana emergente haga clic en No si el tipo de voladizo no ha cambiado. Ajuste las perillas de alineación óptica para encontrar el voladizo. Ajuste el enfoque en el voladizo y haga clic en Siguiente.</li>
	<li>En la ventana emergente haga clic en Sí si el foco está en el voladizo.</li>
	<li>Coloque el rayo láser al final del voladizo utilizando las perillas que controlan la posición del láser de detección. Maximice la señal total medida por el fotodiodo de cuatro cuadrantes a por lo menos >1 V utilizando las perillas que controlan la posición del rayo láser desviado en el fotodiodo sensible a la posición (PSPD). En la ventana Cambio de sonda haga clic en Siguiente y luego en Cerrar.</li>
	<li>Espere 15 minutos hasta que el voladizo alcance la estabilidad térmica. Reajuste la posición del rayo láser desviado en el PSPD si es necesario.</li>
	<li>Haga clic en NCM SWEEP,elija la amplitud deseada de la oscilación, haga clic en Usar fase,haga clic en auto y ajuste el voladizo cerca del máximo de su primera resonancia libre de oscilación, que es de aproximadamente 300 kHz para un voladizo con una constante de resorte de 40 N m-1. NOTA: Ajustar el voladizo fuera del máximo de su resonancia libre asegura una mayor estabilidad de las mediciones14.</li>
	<li>Coloque la muestra en el soporte de la muestra. Elija los parámetros de imagen adecuados. La velocidad de escaneo típica es de 0,3 a 1,0 Hz para un área de escaneado de 1 x 1 m2 a 5 x 5 m2. La resolución típica necesaria es entre 256 x 256 y 1024 x 1024 píxeles. Haga clic en Scan Area (Zona de escaneado) para elegir el tamaño del escaneado y el número de píxel.</li>
	<li>Enfoque la vista óptica en la muestra. Haga clic en Acercarse para acercarse a la superficie de muestra. Una vez que se haya completado el enfoque, haga clic en Levantar 100 m para elevar la punta de AFM 100 m por encima de la superficie de la muestra. Haga clic en Expandir en la imagen óptica de la muestra. Haga clic en la barra Desenfoque del escenario para centrar la vista en la superficie de la muestra.</li>
	<li>Utilice las flechas para desplazarse por la región de la muestra de interés. Encienda la superficie pulsando el botón Enfoque. Haga clic en el botón Escaneo de línea y compruebe si la punta está siguiendo bien la superficie, si es necesario, ajuste el Punto de Ajuste.</li>
	<li>Comience a tomar imágenes de la superficie de la muestra pulsando el botón Escanear. Durante la toma de imágenes, para evitar una gran fuerza de imagen y mantener la consistencia de las muestras independientes, mantenga un régimen constante de cambio de fase que no supere los 20o42.</li>
	<li>Escriba el nombre del archivo y elija el directorio base donde se guardará la imagen adquirida.</li>
</ol>4. Mediciones de nanoespectroscopia infrarroja de agregados proteicos
<ol><li>Encienda el sistema AFM-IR y el láser infrarrojo (IR)60 30-60 min antes de las mediciones para la estabilización térmica. Los láseres típicos para los instrumentos AFM-IR son osciladores de parámetros ópticos (OPO) y láseres de cascada cuántica (QCL).</li>
	<li>Abra el software incorporado para controlar el instrumento. Haga clic en el archivo y luego en nuevo para abrir un nuevo archivo nanoIR. Pulse el botón inicializar para iniciar el sistema AFM-IR.</li>
	<li>Abra la cubierta del instrumento y monte en el sistema AFM-IR una sonda recubierta de oro de silicio con un radio nominal de 30 nm y una constante de resorte de 0,2 N/m para medir la muestra en modo de contacto.</li>
	<li>Haga clic en Cargar en la sección Sonda AFM y luego en siguiente. En foco en la sección de la sonda haga clic en las flechas para enfocar la cámara en el voladizo. En la sección Movimiento XYde la muestra , utilice las flechas para colocar el aire cruzado al final del voladizo.</li>
	<li>Gire las perillas que controlan la posición del láser de detección para colocar el láser al final del voladizo. Gire las perillas láser para detectar y maximizar la suma medida por el fotodiodo de cuatro cuadrantes a un valor > 3 V. Gire la perilla de desviación para ajustar la desviación del voladizo a -1 V y luego haga clic en siguiente. Cierre la cubierta del instrumento.</li>
	<li>En la sección, el foco en la muestra, utilice las flechas para enfocar la cámara en la muestra. A continuación, en la sección de muestra Movimiento XY utilice las flechas para moverse en la región de interés de la muestra y haga clic en acercarse y participar.</li>
	<li>En la ventana del microscopio seleccione como entradas los canales de interés para asignar las propiedades biofísicas de la muestra. En particular, elija la altura para la morfología, la amplitud 2 para la absorción iral y la frecuencia PLL para mapear la resonancia de contacto de la muestra de punta.</li>
	<li>En la sección de escaneo AFM de la ventana de controles, utilice parámetros similares a los de la sección 3 (es decir, velocidad de escaneo 0,1 a 1,0 Hz, entre 256 x 256 y 1024 x 1024 píxeles). Elija como valor de las ganancias de acuerdo con la rugosidad de la muestra: Integral I - 1-10 y P proporcional a 10-30. A continuación, haga clic en escanear para adquirir un mapa de morfología. NOTA: La morfología se puede medir de forma similar en el modo de roscado dinámico, pero las mediciones AFM-IR se realizan aquí en el modo de contacto para tener relaciones señal/ruido más altas.</li>
	<li>Una vez finalizada la cartografía de la morfología, en la ventana del microscopio, haga clic en el mapa de altura para colocar la sonda en la parte superior de un agregado. A continuación, en la sección nanoIR de la ventana de controles, haga clic en iniciar IR para iluminar la muestra con el láser IR.</li>
	<li>Para enfocar el láser infrarrojo en el voladizo, haga clic en la optimización. En esta ventana, escriba un número de onda donde la muestra va a tener alta absorbancia y haga clic en agregar. Para la proteína, un valor típico es 1655 cm-1. Haga clic en escanear para encontrar la posición del láser IR y haga clic en actualizar para alinear su posición con el voladizo. Cierre la ventana.</li>
	<li>En la sección general de la configuración de nanoIR, escriba un número de onda donde se espera una alta absorbancia en el campo relativo. A continuación, desactive la opción Filtro de paso de banda y mire la lectura del medidor y la transformación rápida de Fourier (FFT) de la respuesta en voladizo. En la ventana FFT mueva el cursor verde para leer la frecuencia de resonancia del voladizo. Un valor típico de la FFT de la resonancia de los voladizos es de alrededor de 300 kHz. Escriba este valor de frecuencia de resonancia en la sección general del campo central freq. y utilice una ventana de frecuencia de 50 kHz. NOTA: Seleccione una potencia láser lo suficientemente baja como para no saturar la lectura del medidor y para tener distorsión en la respuesta en voladizo y no sobrecalentar la muestra.</li>
	<li>Haga clic en la ventana de sintonización de pulsos láser para utilizar el modo de resonancia mejorada. Elija un centro de frecuencia de 300 kHz, un rango de sintonía de 50 kHz y un ciclo de trabajo del láser del 5%. Haga clic en adquirir para barrer la frecuencia de pulso del láser. Mediante el uso del cursor en el gráfico, ajuste el pulso láser a la frecuencia de la respuesta mecánica de la expansión térmica de la muestra absorbiendo la luz IR. A continuación, seleccione la opción PLL para supervisar la resonancia de contacto entre la muestra y la punta. Pulse el botón cero en la ventana PLL y marque enable para realizar un seguimiento de la resonancia de contacto de la punta de muestra. Elija una ganancia integral I a 0,5 y una ganancia proporcional P a 10. Cierre la ventana.</li>
	<li>Abra de nuevo la ventana de optimización y encuentre la posición del láser IR para al menos 3 números de onda correspondientes a las principales bandas de absorción de la muestra (banda de amida I-II-III) y para al menos un número de onda para cada chip del láser.</li>
	<li>Haga clic en Herramientas ( Tools) Calibración de fondo IR (IR Background Calibration) Nuevo. En la ventana seleccione la región espectroscópica de interés (1800-1200 cm-1 para estudiar muestras de proteínas); elegir la misma frecuencia de pulso según lo determinado en el paso 4.12 y un ciclo de trabajo del 5%; haga clic en la adquisición rápida y seleccione la velocidad del láser, rango típico para un láser de cascada cuántica está entre 20 x 500 cm-1. Haga clic en adquirir para medir el fondo del láser IR. Este espectro de fondo se utilizará para la normalización de espectros localizados medidos a nanoescala. Cierre la ventana. NOTA: Si un modo de láser rápido y resonancia mejorada no está disponible, omita el paso 4.12 y seleccione espectros escalonados en lugar de rápido en las ventanas de adquisición de espectros de fondo e IR. Sin embargo, no se alcanzará la sensibilidad agregada única.</li>
	<li>En los ajustes de espectros IR, elija una resolución de espectro IR entre 1 x 4 cm-1 y un número de copromedioes de al menos 64x. Haga clic en adquirir para medir un espectro IR localizado a nanoescala en el rango de proteínas (1800-1200 cm-1).</li>
	<li>Para adquirir un mapa químico resuelto a nanoescala, seleccione la opción de imágenes IR, elija un número de onda de interés (por ejemplo, 1655 cm-1 para la banda de amida I) y haga clic en escanear en la ventana de exploración AFM.</li>
	<li>Una vez completada la asignación, vaya al archivo y guarde las medidas. Para analizar los mapas adquiridos de morfología, resonancia de contacto y química, así como los espectros localizados a nanoescala, utilice el software de procesamiento de imágenes AFM incorporado. Spectra e Images se pueden guardar como archivos .csv o .axz para un análisis más detallado con software comercial.</li>
</ol>5. Procesamiento y análisis de imágenes de dimensiones transversales
<ol><li>Aplanar imágenes en bruto14,17,19,41,42,59 utilizando software de procesamiento de imágenes AFM incorporado o software comercial. NOTA: Los agregados deben enmascararse del cálculo para evitar artefactos de análisis y subestimación de su altura medida.</li>
	<li>Aplanar la imagen por 0 orden plano ajuste de resta.</li>
	<li>Aplanar la imagen por plano y, a continuación, línea por línea en un orden de regresión de1o, el segundo paso se repite hasta que se alcanza la línea base plana en el perfil de línea de la imagen.</li>
	<li>Si la muestra está muy concurrida, contiene agregados excepcionalmente altos o el artefacto de arco del escáner está presente, aplanar la imagen usando2nd regression order fit.</li>
	<li>Mida la altura y la anchura agregadas a partir de un perfil de línea perpendicular al eje fibril14,17,19,41,42,59.</li>
	<li>Mida la longitud de fibrilación paralela al eje fibril14,17,19,41,42,59.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El primer paso crítico en este protocolo es la preparación de proteínas monoméricas, como en el caso de la solución A-42 descrita en los pasos 1.1 y 1.2. Es esencial iniciar el proceso de agregación a partir de una solución monomérica altamente pura, ya que la presencia de especies oligoméricas o agregadas puede dar lugar a una mala reproducibilidad de la cinética de agregación58,e inducir artefactos en el AFM medidas (por ejemplo, especies fibrilares serán evidentes en las etapas iniciales de la ...

Más de 40 millones de personas en todo el mundo se ven afectadas actualmente por trastornos neurodegenerativos, como el Alzheimer (AD)1 y las enfermedades de Parkinson (PD)2. En términos más generales, más de cincuenta patologías se asocian a nivel molecular con el desdoblamiento y la agregación de proteínas, un proceso que conduce a la proliferación de agregados de proteínas fibrilares insolubles, conocidos como depósitos amiloide3, 4. Los orígenes moleculares de la neurodegeneración y sus vínculos con los cambios conformacionales proteicos de las proteínas que conducen a la formación de amiloide, sin embargo, siguen sin estar claros, en gran parte debido al alto nivel de heterogeneidad, naturaleza transitoria y nanoescala dimensiones de los agregados patológicos4,5.
Investigaciones de gran éxito de las estructuras proteicas en las últimas décadas se han basado ampliamente en el uso de métodos a granel, incluyendo cristalografía de rayos X, microscopía crioelectrónica y espectroscopia de resonancia magnética nuclear5, 6 , 7 , 8 , 9. Dentro de esta clase de técnicas, la espectroscopia infrarroja (IR) ha surgido como una herramienta analítica sensible para desentrañar las propiedades químicas de sistemas biológicos como las proteínas8. Los métodos IR permiten cuantificar los cambios estructurales secundarios y cuaternarios de proteínas durante su desdoblamiento y agregación. Además, con el fin de descifrar aún más a nivel microscópico los detalles mecanicistas involucrados en los complejos paisajes de energía libre de proteínas durante su agregación, un avance importante ha sido el desarrollo de herramientas químicas cinéticas para extender a caminos de autoensamblaje incluyendo la formación de fibrillas amiloideas5,6,7,10,11,12. Sin embargo, los métodos espectroscópicos a granel proporcionan sólo información media sobre el conjunto heterogéneo de especies presentes en la solución o involucradas en pasos microscópicos específicos, lo que hace que la investigación de las propiedades biofísicas de especies agregadas desafiantes en el nivel de nanoescala13,14.
Varias técnicas de microscopía con la capacidad de operar en escalas más pequeñas que el límite de difracción de luz han surgido en las últimas décadas. Esta clase de métodos incluye microscopía electrónica (EM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Mientras que la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionan imágenes bidimensionales (2D) de una muestra, AFM ha surgido en las últimas décadas como una técnica poderosa y versátil para estudiar morfologías tridimensionales (3D), como morfologías tridimensionales (3D), como así como las propiedades nanomecánicas de una muestra con resolución subnanómetro13,14,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. La razón de ser del estudio de la agregación de proteínas a través de AFM es que este enfoque permite la investigación de la morfología de las especies individuales presentes en la solución13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. En particular, mediante el seguimiento de la muestra en función del tiempo, AFM permite la investigación de la evolución de la morfología de la especie dentro de la muestra, lo que permite seguir y visualizar las vías de formación de amiloide23, 25,38,39,40,41,42. Además, AFM permite la cuantificación de parámetros estructurales como las alturas transversales y longitudes de las especies individuales presentes en la solución13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 , 45 , 46 , 47 , 48. Sin embargo, el estudio de una sola propiedad biofísica, como la morfología, a menudo no es suficiente cuando se estudian sistemas biológicos heterogéneos y complejos. Los métodos de imágenes AFM, SEM o TEM por sí solos no revelan fácilmente las propiedades químicas de las especies heterogéneas de agregados amiloide a nanoescala.
Recientemente se ha realizado un importante avance para el análisis de muestras biológicas heterogéneas a esta escala con el desarrollo y la aplicación en el campo de la agregación proteica de la nanoespectroscopia infrarroja (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Este innovador método aprovecha la combinación de la resolución espacial de AFM (1 x 10 nm) con el poder de análisis químico de IR. La técnica AFM-IR se basa en la medición del efecto de resonancia inducida fototérmica impulsada por un láser IR, y en la medición de la expansión térmica de la muestra bajo investigación por la punta del AFM. La muestra puede ser iluminada por el láser IR directamente desde la parte superior o desde la parte inferior en la reflexión interna total, de forma similar a la de la espectroscopia infrarroja convencional24,42,52,53 . El láser IR se puede pulsada con frecuencias típicas en el orden de cientos de kilohercios (1-1000 kHz) y sintonizado en un amplio rango espectral, típicamente entre 1000-3300 cm-1. Aunque la fuente láser cubre un área de 30 m de diámetro, la resolución espacial de la técnica AFM-IR está determinada nominalmente por el diámetro de la punta AFM, que detecta la expansión térmica local del sistema. AFM-IR es muy adecuado para estudiar muestras biológicas porque la señal IR es proporcional a su espesor de hasta 1 x 1,5 m, y los espectros IR resultantes son generalmente de acuerdo con los espectros de transmisión FTIR correspondientes13,54 ,55. Por esta razón, los métodos establecidos de análisis en espectroscopia se pueden aplicar fácilmente, como el estudio de los cambios químicos, el cambio de forma de la banda y la desconvolución mediante el análisis de derivados segundo52. En general, combinando la resolución espacial de AFM con el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, AFM-IR permite la adquisición simultánea de una amplia gama de propiedades morfológicas, mecánicas y químicas de una muestra a nanoescala.
Aquí, ilustramos un protocolo para la caracterización del proceso de agregación de proteínas que explota la combinación de ensayos de fluorescencia in vitro, imágenes AFM de alta resolución y AFM-IR a nanoescala. Este enfoque combinado ya ha sobresalido en proporcionar resultados detallados en el estudio de las propiedades químicas y estructurales de las microgotas individuales formadas por agregados proteicos, en el estudio de la separación de fase sin proteínas líquidas y líquidas, y en investigando la heterogeneidad y las propiedades biofísicas de las especies agregadas individuales a la nanoescala23,26,38,45,50,53, 56,57.

<table><tbody><tr><td>Sistema AFM-IR</td><td>Anasys Instruments</td><td>nanoIR 2 o 3</td><td>Sistemas para medir la expansión térmica en modo de contacto y resonancia</td></tr><tr><td>Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyreno NBS Microplate</td><td>Corning</td><td>3881</td><td></td></tr><tr><td>Corning Microplate Cinta de sellado de aluminio Corning</td><td></td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Discos adhesivos de doble cara</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG3347N</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-101</td><td>Lector de placas</td></tr><tr><td>Disco de mica 10mm V1</td><td>AGAR Scientific</td><td></td> AGF7013 <td></td></tr><tr><td>Park NX10 Sistema AFM</td><td>Sistemas de parque</td><td>N/A</td><td>Microscopio de fuerza atómica</td></tr><tr><td>Ornitorrinco Ultraplano Chips de oro</td><td>Tecnologías de ornitorrinco</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td></td></tr><tr><td>PPP-NCHR-10 voladizos Sistemas de</td><td>parque</td><td>PPP-NCHR-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Protein LowBind, 2.0mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108132</td><td></td></tr><tr><td>voladizos recubiertos de oro y silicio</td><td>Anasys Instruments</td><td>PR-EX-nIR2</td><td></td></tr><tr><td>SPM Discos de muestra 12mm</td><td>AGAR Scientific AGF7001</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

El fenómeno del desdoblamiento de proteínas y la agregación da como resultado la formación de agregados proteicos altamente heterogéneos, que se asocian con condiciones neurodegenerativas como el Alzheimer y las enfermedades de Parkinson. En particular, los agregados de bajo peso molecular, oligómeros amiloide, han demostrado poseer propiedades citotóxicas genéricas y están implicados como neurotoxinas en muchas formas de demencia. Ilustramos el uso de métodos basados en la microscopía de fuerza atómica (AFM) para abordar la difícil tarea de caracterizar las propiedades morfológicas, estructurales y químicas de estos agregados, que son difíciles de estudiar utilizando la estructura convencional métodos biofísicos a granel debido a su heterogeneidad y naturaleza transitoria. Los enfoques de microscopía de sonda de escaneo ahora son capaces de investigar la morfología de los agregados amiloide con resolución subnanómetro. Aquí mostramos que la nanoespectroscopia infrarroja (IR) (AFM-IR), que explota simultáneamente la alta resolución de AFM y el poder de reconocimiento químico de la espectroscopia IR, puede ir más allá y permitir la caracterización de las propiedades estructurales de proteínas y, por lo tanto, ofrecen información sobre los mecanismos de agregación. Dado que el enfoque que describimos se puede aplicar también a las investigaciones de las interacciones de los conjuntos de proteínas con moléculas pequeñas y anticuerpos, puede proporcionar información fundamental para desarrollar nuevos compuestos terapéuticos para diagnosticar o tratar trastornos neurodegenerativos.

En la Figura 1se muestra un curso de tiempo representativo de la agregación A-42, medido por el ensayo de fluorescencia ThT. El proceso de agregación se caracteriza comúnmente por una curva sigmoidal, donde se observa inicialmente una fase de retraso, y es seguida por una fase de crecimiento pronunciada, antes de que la curva alcance una meseta cuando se alcanza un estado estacionario de equilibrio6,7 , 5...

Describimos la aplicación de nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica de alta resolución para visualizar el proceso de autoensamblaje de proteínas en agregados oligoméricos y fibrillas amiloideas, que está estrechamente asociada con el inicio y desarrollo de una amplia gama de trastornos neurodegenerativos humanos.

Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Los métodos basados en la microscopía de fuerza atómica permiten caracterizar los procesos biomoleculares a escala nanométrica con resolución química morfológica o estructural, abriendo finalmente una nueva ventana frontal de observación sobre la biología. Los métodos de molécula única permiten sondear sistemas altamente heterogéneos, una característica que es particularmente relevante para entender la agregación de proteínas. Mediante la combinación de moléculas individuales con enfoques posteriores, podemos obtener información fundamental sobre el comportamiento de las proteínas, sus vínculos con enfermedades humanas y diseñar intervenciones farmacológicas que pueden tener éxito.Además, este método se puede aplicar con éxito para estudiar las propiedades químicas y estructurales de los biomateriales para la administración de medicamentos, aplicaciones y otros fines biotecnológicos. Puede ser difícil inicialmente establecer los parámetros AFM correctos para alta resolución y es fácil configurar su AFM mientras mide sus agregados fibrilares. 30 minutos antes de la imagen AFM, encienda el sistema AFM y haga clic en configurar y sondear.En la ventana de cambio de sondeo, haga clic en siguiente para preparar la etapa de enfoque Z. Apague el interruptor de haz AFM si está encendido y desbloquee las cerraduras de cola de milano. Desconecte el cabezal del sistema y, en la ventana de cambio de la sonda, haga clic en Siguiente.Monte el voladizo AFM en el soporte de la sonda. Conecte el cabezal al sistema y bloquee las cerraduras de cola de milano. Encienda el interruptor de rayo láser AFM y, en la ventana de cambio de sonda, haga clic en Siguiente.En la ventana emergente, haga clic en no si el tipo de voladizo no ha cambiado y ajuste las perillas de alineación óptica para encontrar el voladizo. Ajuste el enfoque en el voladizo y haga clic en Siguiente. En la ventana emergente, haga clic en sí si el foco está en el voladizo.Utilice las perillas de rayo láser de detección para colocar el rayo láser al final del voladizo. Utilice las perillas de haz láser desviadas para maximizar la señal total medida por el diodo fotográfico de cuatro cuadrantes a por lo menos más de un voltio. En la ventana de cambio de sondeo, haga clic en Siguiente y cierre.Después de esperar 15 minutos para que el voladizo alcance la estabilidad térmica, reajuste la posición del rayo láser desviado en la posición de un diodo fotográfico sensible si es necesario. Haga clic en Barrido NCM, seleccione la amplitud deseada de oscilación, haga clic en la fase de uso y haga clic en auto. Sintonice el voladizo cerca del máximo de su primera resonancia libre de oscilación a aproximadamente 300 kilohercios para un voladizo con una constante de resorte de 40 newtons por metro.Coloque la muestra en el portacuchillas. Haga clic en el área de exploración y establezca la resolución en entre 256 por 256 y 1024 por 1024 píxeles y, a continuación, establezca el tamaño de escaneado y el número de píxel. Establezca la velocidad de escaneo en 0,3 en un hercio para un área de escaneo de uno por uno a cinco por cinco micrómetros al cuadrado.Enfoque la vista óptica en la muestra y haga clic en el enfoque para acercarse a la superficie de la muestra. A continuación, haga clic en levantar 100 micrómetros para elevar la punta AFM 100 micrómetros por encima de la superficie de la muestra y haga clic en expandir en la imagen óptica de la muestra. Haga clic en la barra de etapa de enfoque para centrar la vista en la superficie de la muestra y utilizar las flechas para moverse en la región de la muestra de interés.Haga clic en enfoque para enganchar la superficie y haga clic en Escaneo de línea para comprobar si la punta está siguiendo bien la superficie. Ajuste el punto de ajuste según sea necesario. A continuación, haga clic en scan para comenzar a tomar imágenes de la superficie de la muestra, manteniendo un régimen constante de cambio de fase que no exceda del delta 20 durante la toma de imágenes para evitar una gran fuerza de imagen y mantener la coherencia entre las muestras independientes.Para imágenes de nanoespectroscopia por infrarrojos, 30 a 60 minutos antes del análisis, encienda el sistema IR AFM y el láser IR. Abra el software integrado para controlar el instrumento y haga clic en el archivo y nuevo para abrir un nuevo archivo nano IR. Haga clic en inicializar para iniciar el sistema AFM IR y abrir la cubierta del instrumento.Monte una sonda recubierta de oro de silicona con un radio nominal de 30 nanómetros y una constante de resorte de 0,2 newtons por metro en el sistema AFM IR para medir la muestra en modo de contacto. Haga clic en cargar en la sección de la sonda AFM y en la siguiente. Utilice el foco en las flechas de la sonda para enfocar la cámara en el voladizo y utilice la punta para cruzar el punto de mira para colocar el punto de mira al final del voladizo.Gire las perillas que controlan la posición del láser de detección para colocar el láser al final del voladizo. Gire las perillas láser para detectar y maximizar la suma medida por el diodo fotográfico de cuatro cuadrantes a un valor superior a tres voltios. Gire la perilla de desviación para ajustar la desviación en voladizo a menos un voltio y haga clic en siguiente.A continuación, cierre la cubierta del instrumento. Utilice el enfoque en las flechas de la sonda para enfocar la cámara en la muestra y la punta a las flechas en cruz para moverse en la región de interés de la muestra. Haga clic en Siguiente y enganche.En la ventana del microscopio, seleccione la altura para la morfología, la amplitud dos para la absorción IR y la frecuencia PLL para mapear la punta a la resonancia de contacto de la muestra. En la sección de exploración de AFM, establezca los parámetros como se muestra para la imagen AFM y haga clic en scan para adquirir un mapa morfológico. Cuando finalice el mapeo morfológico, en la ventana del microscopio, haga clic en el mapa de altura para colocar la sonda en la parte superior de un agregado.En la sección nano IR, haga clic en iniciar IR para iluminar la muestra con el láser IR. Para enfocar el láser infrarrojo en el voladizo, haga clic en optimizar e introduzca 1655 centímetros para el número de onda. Haga clic en Agregar y escanear para determinar la posición del láser IR y haga clic en actualizar y bien para alinear su posición con el voladizo.En la sección general, introduzca un número de onda para el que se espera una alta absorbancia en el campo relativo y desactive la opción de filtro de paso de banda. Haga clic en start IR y luego compruebe la lectura del medidor y el FFT de la respuesta en voladizo. En la ventana FFT, mueva el cursor verde para leer la frecuencia de resonancia del voladizo.Un valor típico de la FFT de la resonancia de los voladizos es de alrededor de 200 kilohercios. Introduzca el valor de frecuencia de resonancia generado en la sección general en el campo del centro de frecuencia y utilice una ventana de frecuencia de 50 kilohercios. Haga clic en la ventana de sintonización de pulso láser para seleccionar el modo mejorado de resonancia y establecer una frecuencia de pulso de 222 kilohercios, un rango de sintonización de 50 kilohercios y un ciclo de trabajo láser de 5% Click adquirir para barrer la frecuencia de pulso del láser.Utilice el cursor para ajustar el pulso láser a la frecuencia de la respuesta mecánica de la expansión térmica de la muestra que absorbe la luz IR. A continuación, seleccione el bucle de fase bloqueada para supervisar la resonancia de contacto entre la muestra y la punta y haga clic en cero. Para otras propiedades químicas a escala nanométrica, realice un seguimiento de la resonancia de contacto durante la adquisición de espectros para asegurarse de que el espectro de la muestra no se vea afectado por el sobrecalentamiento y el ablandamiento.Seleccione enable para realizar un seguimiento de la muestra para inclinar la resonancia de contacto y seleccionar una ganancia integral de 0,5 y una ganancia proporcional de 10 y, a continuación, haga clic en Aceptar. En la ventana de optimización, haga clic en la longitud de onda y escanee para localizar el láser IR para al menos tres números de onda correspondientes a las bandas principales de absorbancia de la muestra y para al menos un número de onda para cada chip del láser. Haga clic en herramientas, calibración de fondo IR y nuevo, y establezca los números de onda entre 1200 y 1800 centímetros. Establezca los fondos en promedio en uno, el ciclo de trabajo del 5% y la velocidad de barrido a 100 centímetros al cuadrado.Haga clic en adquirir para medir el fondo del láser IR para la normalización de los espectros localizados a nanoescala medida, guarde el archivo y cierre la ventana. En la configuración de espectros IR, seleccione una resolución de espectro IR entre uno y cuatro centímetros y un número de co-promedios de al menos 64 veces. A continuación, haga clic en adquirir para medir un espectro IR localizado a nanoescala en el rango de proteínas.Para adquirir un mapa químico resuelto a nanoescala, seleccione 1655 centímetros e imágenes IR y haga clic en escanear en la ventana de exploración de AFM. Cuando se complete la asignación, guarde las medidas. A continuación, utilice el software de procesamiento de imágenes AFM incorporado para analizar los mapas adquiridos de morfología, resonancia de contacto y química y espectros localizados a nanoescala.Es un paso crítico para obtener una solución monomérica altamente pura, ya que la presencia de especies agregadas puede resultar en una mala reproducibilidad de la cinética e introducir artefactos en sus mediciones. Un factor fundamental para estudiar con éxito muestras biológicas que tienen alta heterogeneidad es la posición correcta de los sustratos sólidos. La deposición de pulverización microfluídica se puede explotar en lugar de una manual para preservar la arquitectura de la muestra y la heterogeneidad.Estos métodos allanan el camino para desentrañar la estructura química y las propiedades de las biomoléculas individuales y sus interacciones en el entorno fisiológico y líquido nativo.

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