Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

Los métodos basados en la microscopía de fuerza atómica permiten caracterizar los procesos biomoleculares a escala nanométrica con resolución química morfológica o estructural, abriendo finalmente una nueva ventana frontal de observación sobre la biología. Los métodos de molécula única permiten sondear sistemas altamente heterogéneos, una característica que es particularmente relevante para entender la agregación de proteínas. Mediante la combinación de moléculas individuales con enfoques posteriores, podemos obtener información fundamental sobre el comportamiento de las proteínas, sus vínculos con enfermedades humanas y diseñar intervenciones farmacológicas que pueden tener éxito.

Además, este método se puede aplicar con éxito para estudiar las propiedades químicas y estructurales de los biomateriales para la administración de medicamentos, aplicaciones y otros fines biotecnológicos. Puede ser difícil inicialmente establecer los parámetros AFM correctos para alta resolución y es fácil configurar su AFM mientras mide sus agregados fibrilares. 30 minutos antes de la imagen AFM, encienda el sistema AFM y haga clic en configurar y sondear.

En la ventana de cambio de sondeo, haga clic en siguiente para preparar la etapa de enfoque Z. Apague el interruptor de haz AFM si está encendido y desbloquee las cerraduras de cola de milano. Desconecte el cabezal del sistema y, en la ventana de cambio de la sonda, haga clic en Siguiente.

Monte el voladizo AFM en el soporte de la sonda. Conecte el cabezal al sistema y bloquee las cerraduras de cola de milano. Encienda el interruptor de rayo láser AFM y, en la ventana de cambio de sonda, haga clic en Siguiente.

En la ventana emergente, haga clic en no si el tipo de voladizo no ha cambiado y ajuste las perillas de alineación óptica para encontrar el voladizo. Ajuste el enfoque en el voladizo y haga clic en Siguiente. En la ventana emergente, haga clic en sí si el foco está en el voladizo.

Utilice las perillas de rayo láser de detección para colocar el rayo láser al final del voladizo. Utilice las perillas de haz láser desviadas para maximizar la señal total medida por el diodo fotográfico de cuatro cuadrantes a por lo menos más de un voltio. En la ventana de cambio de sondeo, haga clic en Siguiente y cierre.

Después de esperar 15 minutos para que el voladizo alcance la estabilidad térmica, reajuste la posición del rayo láser desviado en la posición de un diodo fotográfico sensible si es necesario. Haga clic en Barrido NCM, seleccione la amplitud deseada de oscilación, haga clic en la fase de uso y haga clic en auto. Sintonice el voladizo cerca del máximo de su primera resonancia libre de oscilación a aproximadamente 300 kilohercios para un voladizo con una constante de resorte de 40 newtons por metro.

Coloque la muestra en el portacuchillas. Haga clic en el área de exploración y establezca la resolución en entre 256 por 256 y 1024 por 1024 píxeles y, a continuación, establezca el tamaño de escaneado y el número de píxel. Establezca la velocidad de escaneo en 0,3 en un hercio para un área de escaneo de uno por uno a cinco por cinco micrómetros al cuadrado.

Enfoque la vista óptica en la muestra y haga clic en el enfoque para acercarse a la superficie de la muestra. A continuación, haga clic en levantar 100 micrómetros para elevar la punta AFM 100 micrómetros por encima de la superficie de la muestra y haga clic en expandir en la imagen óptica de la muestra. Haga clic en la barra de etapa de enfoque para centrar la vista en la superficie de la muestra y utilizar las flechas para moverse en la región de la muestra de interés.

Haga clic en enfoque para enganchar la superficie y haga clic en Escaneo de línea para comprobar si la punta está siguiendo bien la superficie. Ajuste el punto de ajuste según sea necesario. A continuación, haga clic en scan para comenzar a tomar imágenes de la superficie de la muestra, manteniendo un régimen constante de cambio de fase que no exceda del delta 20 durante la toma de imágenes para evitar una gran fuerza de imagen y mantener la coherencia entre las muestras independientes.

Para imágenes de nanoespectroscopia por infrarrojos, 30 a 60 minutos antes del análisis, encienda el sistema IR AFM y el láser IR. Abra el software integrado para controlar el instrumento y haga clic en el archivo y nuevo para abrir un nuevo archivo nano IR. Haga clic en inicializar para iniciar el sistema AFM IR y abrir la cubierta del instrumento.

Monte una sonda recubierta de oro de silicona con un radio nominal de 30 nanómetros y una constante de resorte de 0,2 newtons por metro en el sistema AFM IR para medir la muestra en modo de contacto. Haga clic en cargar en la sección de la sonda AFM y en la siguiente. Utilice el foco en las flechas de la sonda para enfocar la cámara en el voladizo y utilice la punta para cruzar el punto de mira para colocar el punto de mira al final del voladizo.

Gire las perillas que controlan la posición del láser de detección para colocar el láser al final del voladizo. Gire las perillas láser para detectar y maximizar la suma medida por el diodo fotográfico de cuatro cuadrantes a un valor superior a tres voltios. Gire la perilla de desviación para ajustar la desviación en voladizo a menos un voltio y haga clic en siguiente.

A continuación, cierre la cubierta del instrumento. Utilice el enfoque en las flechas de la sonda para enfocar la cámara en la muestra y la punta a las flechas en cruz para moverse en la región de interés de la muestra. Haga clic en Siguiente y enganche.

En la ventana del microscopio, seleccione la altura para la morfología, la amplitud dos para la absorción IR y la frecuencia PLL para mapear la punta a la resonancia de contacto de la muestra. En la sección de exploración de AFM, establezca los parámetros como se muestra para la imagen AFM y haga clic en scan para adquirir un mapa morfológico. Cuando finalice el mapeo morfológico, en la ventana del microscopio, haga clic en el mapa de altura para colocar la sonda en la parte superior de un agregado.

En la sección nano IR, haga clic en iniciar IR para iluminar la muestra con el láser IR. Para enfocar el láser infrarrojo en el voladizo, haga clic en optimizar e introduzca 1655 centímetros para el número de onda. Haga clic en Agregar y escanear para determinar la posición del láser IR y haga clic en actualizar y bien para alinear su posición con el voladizo.

En la sección general, introduzca un número de onda para el que se espera una alta absorbancia en el campo relativo y desactive la opción de filtro de paso de banda. Haga clic en start IR y luego compruebe la lectura del medidor y el FFT de la respuesta en voladizo. En la ventana FFT, mueva el cursor verde para leer la frecuencia de resonancia del voladizo.

Un valor típico de la FFT de la resonancia de los voladizos es de alrededor de 200 kilohercios. Introduzca el valor de frecuencia de resonancia generado en la sección general en el campo del centro de frecuencia y utilice una ventana de frecuencia de 50 kilohercios. Haga clic en la ventana de sintonización de pulso láser para seleccionar el modo mejorado de resonancia y establecer una frecuencia de pulso de 222 kilohercios, un rango de sintonización de 50 kilohercios y un ciclo de trabajo láser de 5% Click adquirir para barrer la frecuencia de pulso del láser.

Utilice el cursor para ajustar el pulso láser a la frecuencia de la respuesta mecánica de la expansión térmica de la muestra que absorbe la luz IR. A continuación, seleccione el bucle de fase bloqueada para supervisar la resonancia de contacto entre la muestra y la punta y haga clic en cero. Para otras propiedades químicas a escala nanométrica, realice un seguimiento de la resonancia de contacto durante la adquisición de espectros para asegurarse de que el espectro de la muestra no se vea afectado por el sobrecalentamiento y el ablandamiento.

Seleccione enable para realizar un seguimiento de la muestra para inclinar la resonancia de contacto y seleccionar una ganancia integral de 0,5 y una ganancia proporcional de 10 y, a continuación, haga clic en Aceptar. En la ventana de optimización, haga clic en la longitud de onda y escanee para localizar el láser IR para al menos tres números de onda correspondientes a las bandas principales de absorbancia de la muestra y para al menos un número de onda para cada chip del láser. Haga clic en herramientas, calibración de fondo IR y nuevo, y establezca los números de onda entre 1200 y 1800 centímetros. Establezca los fondos en promedio en uno, el ciclo de trabajo del 5% y la velocidad de barrido a 100 centímetros al cuadrado.

Haga clic en adquirir para medir el fondo del láser IR para la normalización de los espectros localizados a nanoescala medida, guarde el archivo y cierre la ventana. En la configuración de espectros IR, seleccione una resolución de espectro IR entre uno y cuatro centímetros y un número de co-promedios de al menos 64 veces. A continuación, haga clic en adquirir para medir un espectro IR localizado a nanoescala en el rango de proteínas.

Para adquirir un mapa químico resuelto a nanoescala, seleccione 1655 centímetros e imágenes IR y haga clic en escanear en la ventana de exploración de AFM. Cuando se complete la asignación, guarde las medidas. A continuación, utilice el software de procesamiento de imágenes AFM incorporado para analizar los mapas adquiridos de morfología, resonancia de contacto y química y espectros localizados a nanoescala.

Es un paso crítico para obtener una solución monomérica altamente pura, ya que la presencia de especies agregadas puede resultar en una mala reproducibilidad de la cinética e introducir artefactos en sus mediciones. Un factor fundamental para estudiar con éxito muestras biológicas que tienen alta heterogeneidad es la posición correcta de los sustratos sólidos. La deposición de pulverización microfluídica se puede explotar en lugar de una manual para preservar la arquitectura de la muestra y la heterogeneidad.

Estos métodos allanan el camino para desentrañar la estructura química y las propiedades de las biomoléculas individuales y sus interacciones en el entorno fisiológico y líquido nativo.