Name: Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende a reprogramar fibroblastos dérmicos humanos mediante expresión forzada de GATA2, GFI1B y FOS para generar células madre hematopoyéticas. Este protocolo ofrece una plataforma in vitro para estudiar el desarrollo hematopoyético humano.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La fundación Knut y Alice Wallenberg, la Facultad de Medicina de la Universidad de Lund y la Región de Escania son reconocidas por su generoso apoyo financiero. Esta obra fue apoyada por una subvención de Olle Engkvists Stiftelse (194-0694 a Filipe Pereira) y becas de doctorado de la Fundación para la Ciencia y La Tecnología (PTDC/BIM-MED/0075/2014 a Filipe Pereira, y SFRH/BD/135725/2018 y SFRH/BD/51968/2012 a Rita Alves y Andreia Gomes). Este estudio también fue apoyado por fondos de NIH y NYSTEM (1R01HL119404 y C32597GG a Kateri A. Moore).

Este protocolo se realizó de acuerdo con las directrices del comité de ética de investigación humana de la Universidad de Lund y debe hacerse de acuerdo con las directrices institucionales individuales.
1. Preparación de reactivos
<ol><li>Para el suero bovino fetal (FBS) de Eagle modificado de Dulbecco, mezcle el DMEM de alta glucosa que contiene piruvato sódico con 20% de FBS, 1% penicilina-estreptomicina (penitrina/estreptocina), 1% L-glutamina, 1% aminoácidos no esenciales y 10-4-M 2- Mercaptoetanol.</li>
	<li>Para DMEM completo, mezcle DMEM de alta glucosa que contenga piruvato sódico con 10% FBS, 1% Pluma/estreptococo y 1% L-glutamina.</li>
	<li>Para medio hematopoyético, mezcle el medio hematopoyético(Tabla de Materiales)con hidrocortisona de 10-6 M y 1% pluma/estreptococo.</li>
	<li>Utilice solución salina con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio.</li>
</ol>2. Aislamiento de Fibroblastos Dermal Humano
NOTA: Los HDF se pueden comprar a proveedores certificados(Tabla de Materiales). En ese caso, expanda los fibroblastos y utilícelos directamente en experimentos de reprogramación (sección 4). Alternativamente, los HDF pueden aislarse de los donantes. Si los fibroblastos están aislados de diferentes donantes, mantenga las muestras separadas entre sí en todos los pasos del protocolo. Etiquetar placas/pozos y tubos de recogida con el número de identificación de cada donante.
<ol><li>Obtener HDFs a partir de biopsias redondas de punzonado de la piel de 3 mm realizadas por médicos calificados.</li>
	<li>Recubrir tres pocillos de una placa de 6 pocillos tratada con cultivo tisular con 500 ml de gelatina al 0,1% e incubar durante 20 min a 37 oC.</li>
	<li>Aspirar la solución de gelatina restante y añadir 750 s l de DMEM/20% FBS a cada poca. Toda la superficie del pozo debe estar cubierta con medio.</li>
	<li>Añadir 1,5 ml de DMEM/20% FBS a la superficie interior de una tapa estéril de 100 mm petri para plato y esparcir la gota con la ayuda de una pipeta serológica de 5 ml.</li>
	<li>Coloque la biopsia de piel en el medio de la tapa con fórceps esterilizados.</li>
	<li>Diseccionar la biopsia de piel en nueve secciones idénticas, usando un bisturí esterilizado para mantener la biopsia en su lugar y un segundo bisturí para cortar.</li>
	<li>Coloque tres piezas de biopsia por pozo usando fórceps puntiagudos. Asegúrese de que las piezas se adhieren a la parte inferior del pozo.</li>
	<li>Poner un cubreobjetos de 22 mm en la parte superior de las piezas y aplicar un poco de presión.</li>
	<li>Incubar la placa a 37oC, 5% CO2,durante una semana. Compruebe las celdas diariamente y agregue 200 s de DMEM/20% FBS cada 2 días para reemplazar el medio evaporado.</li>
	<li>Después de una semana, agregue hasta 2 ml de DMEM/20% FBS y reemplace el medio cada 2 x 3 días.</li>
	<li>
Pasar las celdas en proporción 1:4 cuando los pozos son confluentes (alrededor de 4-8 semanas).
	<ol>
<li>Preparar 0.1% gelatina recubierta de tejido tratado con 6 placas de 6 pocillos.</li>
		<li>Aspirar el medio de los pozos al 80% de confluencia y lavar una vez con 1 ml de PBS.</li>
		<li>Retire el cubreobjetos con fórceps estériles y coloque el cubreobjetos en un nuevo pozo de una placa de 6 pocillos, con el lado del tejido hacia arriba. NOTA: También se cosecharán las células que permanecieron unidas al cubreobjetos.</li>
		<li>Añadir 500 l de solución de disociación(Tabla de materiales)por pozo (incluidos los pozos con los labios de las cubiertas) e incubar a 37 oC, 5% deCO2 durante 5-10 min. Compruebe cuándo las células comienzan a subir desde la parte inferior del pozo e inactivar la solución de disociación añadiendo 500 sl de DMEM/20% FBS a cada poca.</li>
		<li>Recoger los fibroblastos de todos los pozos en un tubo cónico de 15 ml. Agregue un medio adicional a los pozos para recoger las celdas restantes. Centrifugar el tubo a 350 x g durante 5 min.</li>
		<li>Mientras tanto, añada 500 ml de DMEM/20% FBS a cada pozo de placas recubiertas previamente de gelatina.</li>
		<li>Aspirar medio y resuspender fibroblastos en 6 mL de DMEM/20% FBS.</li>
		<li>Añadir 500 l de suspensión de fibroblastos a cada pocal (dos placas de 6 pocillos por muestra/donante en total). Incubar células durante la noche a 37oC, 5%CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al día siguiente, agregue 1 mL de DMEM/20% FBS a cada pocto. Reemplace el medio por 2 ml de DMEM/20% FBS cada 2 a 3 días hasta que los pozos sean confluentes al 80%.</li>
	<li>Repita la sección 2.11 para tres pozos de confluentes hasta que se alcance el tercer pasaje.</li>
	<li>
Congele los fibroblastos de los pozos confluentes (pasajes 1 y 3).
	<ol>
<li>Aspirar el medio de los pozos y lavar una vez con 1 mL de PBS.</li>
		<li>Disociar y recoger fibroblastos como se describe en los pasos 2.11.4 y 2.11.5.</li>
		<li>Cuente las células con un hemocitómetro y centrifugar el tubo a 350 x g durante 5 min.</li>
		<li>Después de la centrifugación, aspirar medio y resuspender fibroblastos en FBS con 10% DMSO a una densidad de 5 x 105 células/ml.</li>
		<li>Añadir 1 ml de la suspensión celular por criovial y congelar las células durante la noche a -80 oC utilizando un recipiente de congelación. Mover los viales a -150 oC (nitrógeno líquido) para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Producción Lentiviral
<ol><li>Cultivar células HEK293T en un plato tratado con cultivo tisular de 100 mm con 10 ml de DMEM completo, a 37 oC, 5% CO2,hasta que se alcance la confluencia.</li>
	<li>El día anterior a la transfección, aspirar el medio y lavar el plato cuidadosamente con 5 ml de PBS.</li>
	<li>Después de retirar el PBS, añadir 1,5 ml de solución de disociación e incubar a 37 oC, 5%CO2 durante 5 x 10 min para disociar las células del plato. NOTA: Se recomienda calentar tanto el PBS como la solución de disociación antes de usar, para que las células no sufran un choque térmico.</li>
	<li>Inactivar la solución de disociación con 3 ml de DMEM completo y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Lave el plato con 5 ml de DMEM completo para eliminar las células adheridas restantes y transferir este volumen al tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Suspensión de celda de centrífuga a 350 x g durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar sobrenadante y dividir el pellet celular uniformemente entre seis platos tratados con cultivo de tejido de 100 mm en un volumen final de 10 ml de DMEM completo por plato. Las células deben ser aproximadamente 60% confluentes en el momento de la transfección.</li>
	<li>Al día siguiente, las células transfect con el plásmido se mezclan de la siguiente manera: NOTA: Esta parte del protocolo describe la producción de lentivirus en un plato tratado con cultivo tisular de 100 mm por mezcla de plásmido. Para obtener mayores volúmenes de sobrenadante lentiviral para la concentración, utilice al menos cuatro platos de cultivo celular HEK293T de 100 mm por mezcla.<ol>
<li>En un tubo cónico de 15 ml, añadir 10 g de los tres plásmidos de transferencia juntos: 3,33 g de pFUW-tetO-GATA2 (#125028 de Plásmido de Addgene)14, 3,33 g de pFUW-tetO-GFI1B (Addgene #125597)14 y 3,33 g de pFUW-tetO-FOS (Addgene #125598)14 10 g de la2a generación de vectores de embalaje psPAX2 que codifican los genes Gag, Pol, Tat y Rev (Addgene #12260) y 5 g de vector de envolvente pMD2.G que codifica el gen VSV-G (Addgene #12259). Agregue agua de hasta 500 s.</li>
		<li>En dos nuevos tubos cónicos de 15 ml añaden 10 g de plásmido FUW-M2rtTA (Addgene #20342)17, 10 g de vector de embalaje psPAX2 y 5 g de vector de envolvente pMD2.G a cada tubo. Agregue agua de hasta 500 s. Un tubo va a ser utilizado como un control.</li>
		<li>A cada tubo añadir 62,5 ml de 2 M CaCl2. A continuación, suelte las burbujas en cada mezcla utilizando un pipeta Pasteur insertado en un controlador de pipetas. Mientras se forman burbujas, pipeta 500 l de N,N-bis(2-hidroxietilo)-2-ácido aminoetanosulfónico (BES) salina tamponada (pH 7.1, 25 oC), con una pipeta P1000, gota contra el pipeta Pasteur y sobre la mezcla.</li>
		<li>Incubar tubos a temperatura ambiente durante al menos 15 min. Las mezclas aparecerán ligeramente turbias después de algún tiempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Mientras tanto, aspirar el medio de los platos celulares HEK293T (pasado el día anterior) y añadir 10 ml de DMEM completo sin antibióticos. Tenga cuidado y agregue el medio lentamente ya que las células HEK293T son semiadherentes.</li>
	<li>Distribuir cada mezcla individual (aproximadamente 1 ml) uniformemente y en la gota en platos separados e incubar durante la noche a 37 oC, 5% CO2.</li>
	<li>Reemplace el medio por 4 ml de DMEM completo, 24 h después de la incubación. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2. Si está disponible, incubar en su lugar a 32 oC, 5% CO2, ya que la temperatura reducida aumentará la vida media de las partículas lentivirales.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante con partículas lentivirales tres veces a un tubo cónico de 50 ml. No mezcle diferentes partículas lentivirales en este punto. Cada plato resultará en 12 ml de sobrenadante lentiviral. Cuatro platos de la misma preparación viral encajan en un tubo cónico de 50 ml. ADVERTENCIA: Realizar la recolección lentiviral en un laboratorio de nivel 2 de bioseguridad en una campana de flujo laminar dedicada al trabajo lentiviral y colocar residuos virales contaminados (tubos, puntas, platos) en un recipiente adecuado para materiales biopeligrosos.<ol>
<li>Haga la primera recolección 16 h después de la última incubación y agregue 4 ml de DMEM completo. Incubar a 37oC, 5% CO2.</li>
		<li>Hacer la segunda recolección 8 h después de la primera al mismo tubo, añadir 4 mL de DMEM completo e incubar a 37 oC, 5% CO2.</li>
		<li>Hacer la tercera colección 16 h después de la segunda al mismo tubo y desechar los platos. NOTA: Conservar los sobrenatantes lentivirales a 4oC después de cada colección.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrar cada sobrenadante lentiviral utilizando un filtro de unión de proteína baja de 0,45 m con una membrana de acetato de celulosa(Tabla de materiales)a un tubo limpio.</li>
	<li>Añadir un máximo de 15 ml de sobrenadante filtrado a una unidad de filtro centrífugo con una membrana de celulosa regenerada(Tabla de Materiales)y girar a 4.000 x g durante 25 min, a 4oC. Deseche el flujo. Un líquido viscoso que contenga lentivirus permanecerá en la unidad de filtro.</li>
	<li>Repita el paso 3.13 añadiendo 15 ml de sobrenadante en la parte superior de la unidad de filtro, hasta que no quede más sobrenadante lentiviral. NOTA: Cuando sólo hay unos pocos mililitros de sobrenadante para concentrarse, disminuir el tiempo de hilado a 10 min. Si todavía hay líquido extra (no viscoso) en el filtro, centrífuga durante 10 minutos adicionales.</li>
	<li>Hacer alícuotas (50-200 l dependiendo del volumen inicial de sobrenadantes) de cada tipo de lentivirus concentrados y almacenar a -80 oC para almacenamiento a largo plazo (1-2 años) o a 4 oC para almacenamiento a corto plazo (1 x 2 semanas). NOTA: Los lentivirus concentrados o no concentrados también se pueden utilizar frescos. No vuelva a congelar y descongelar, ya que esto reduce el rumbo.</li>
</ol>4. Reprogramación hemogénica
NOTA: Utilice discos duros con un número de paso de tres (P3) o superior (hasta P10) para realizar experimentos de reprogramación.
<ol><li>Recubrir un plato tratado con cultivo tisular de 100 mm con 5 ml de gelatina al 0,1% e incubar a 37 oC durante 20 minutos.</li>
	<li>Descongelar un vial de fibroblastos y células de placa en el plato recubierto de gelatina 0.1%. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2. Si es necesario, expanda los fibroblastos durante un período de tiempo más largo hasta que se alcance el paso y la confluencia deseados.</li>
	<li>Recubrir una placa tratada con cultivo de tejido de 6 pocillos con 500 ml de solución de gelatina al 0,1% e incubar a 37 oC durante 20 min. Retire la gelatina extra.</li>
	<li>Placa HDFs a una densidad de 150.000 celdas por placa (25.000 celdas por pozo) en 2 ml de DMEM completo por pozo. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2,para permitir la unión celular.</li>
	<li>Sustituya el medio por 2 ml de DMEM completo más 8 g/ml de polibreno. Prepare una mezcla de proporción 1:1 de lentivirus TF producidos en la piscina y M2rtTA en un nuevo tubo de microcentrífuga. NOTA: En este protocolo, se realiza la producción de lentivirus para los tres TF, lo que, en manos de los autores, resulta en una mayor eficiencia de reprogramación. Alternativamente, se sugiere realizar una valoración de las partículas lentivirales individuales por qPCR18,en una línea celular estándar. Esto se utilizará para definir el volumen de virus individuales necesarios para satisfacer una multiplicidad de infección (MOI) óptima para la co-transducción y la reprogramación hemogénica.</li>
	<li>Distribuir de 10 a 100 ml de mezcla lentiviral por pocto, para transducir HDFs. Este es el día -2 de la reprogramación. NOTA: Definir el volumen óptimo de mezcla lentiviral para una reprogramación eficiente, sin comprometer la viabilidad celular, requiere optimización (consulte la Figura Suplementaria 1 para obtener más detalles). Los HDF con más de 7 pasajes pueden requerir mayores volúmenes de virus que las células con pasajes más bajos.</li>
	<li>Después de 16 h de incubación, eliminar los virus y añadir DMEM completo. Permita que las células se recuperen durante 6 x 8 h.</li>
	<li>Después de la recuperación, aspirar el medio y añadir 2 mL de DMEM completo con 8 g/ml de polibreno.</li>
	<li>Realice una segunda transducción como se describe en el paso 4.6 e incubar a 37oC, 5%CO2 durante 16 h. Este es el día -1 de la reprogramación. La mezcla lentiviral se puede preparar el día -2 para las transducciones y mantenerse a 4 oC.</li>
	<li>Al día siguiente, elimine los virus y agregue el DMEM completo complementado con 1 g/ml DOX. Este es el día 0 de la reprogramación. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante 48 h.</li>
	<li>
En el día 2 de la reprogramación, divida cada pozo en proporción 1:2.
	<ol>
<li>Aspirar células medianas y de lavado con 1 mL de PBS.</li>
		<li>Aspirar PBS y disociar células con 500 ml de solución de disociación. Incubar 5 a 10 min a 37oC, 5%CO2.</li>
		<li>Inactivar la solución de disociación con 1 ml de DMEM completo y recoger las células en un tubo cónico. Centrífuga a 350 x g durante 5 min.</li>
		<li>Resuspenda el pellet en medio hematopoyético (ver paso 1.3), complementado con DOX de 1 g/ml, y las células de la placa en placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejido recubiertas con 0,1% de gelatina a un volumen final de 2 ml por pocto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cambiar medio (medio hematopoyético más DOX) dos veces por semana durante la duración de los cultivos de reprogramación (25 días).</li>
	<li>Analizar las células reprogramadas resultantes en diferentes puntos de tiempo mediante microscopía de campo brillante o fluorescencia (ver Figura Suplementaria 2),citometría de flujo, secuenciación de ARN a granel y de una sola célula, y ensayos de trasplante para la adquisición de morfología hematopoyética, presencia de marcadores endoteliales y hematopoyéticos, adquisición del perfil de expresión génica endotelial/hematopoyética y capacidad de regeneración14.</li>
</ol>5. Optimización de la expansión de fibroblastos para el análisis ChIP-seq al inicio de la reprogramación hemogénica
<ol><li>Placa 300.000 HDFs (<P8) en 0.1% placas de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejido recubierto de gelatina con DMEM completo a un volumen final de 2 ml por pozo. Incubar durante la noche a 37oC, 5% CO2.</li>
	<li>Al día siguiente, sustituya el medio por un DMEM completo complementado con polibreno de 8 g/ml.</li>
	<li>Células transductas con factores individuales: pFUW-tetO-FOS14, pLV-tetO-HA-GFI1B (Addgene #125599)14 y pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 o con un grupo de los tres factores, más FUW-M2rtTA en proporción 1:1. Utilice un virus total de 10 a 20 l (TF + M2rtTA individual o tres TF + M2rtTA). Incubar células durante la noche a 37oC, 5%CO2. NOTA: Se recomienda utilizar doce placas de 6 pocillos por condición (para cada TF individual y los tres TF combinados).</li>
	<li>Retire los lentivirus y agregue DMEM 16 h completo después de la primera transducción. Deje que las células se recuperen durante 6 x 8 h.</li>
	<li>Transducir las células por segunda vez con la misma cantidad de virus por condición e incubar a 37 oC, 5%CO2.</li>
	<li>Al día siguiente, elimine los virus y agregue DMEM completo. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante 24 h.</li>
	<li>Replaca cada pozo en un plato de 100 mm tratado con cultivo de tejido recubierto de gelatina al 0,1% con DMEM completo a un volumen final de 10 ml por plato. Esto representa aproximadamente un pasaje de 1:6.</li>
	<li>Permitir que las células crezcan durante 6 días a 37oC, 5%CO2.</li>
	<li>El día 6 después del re-plating, aspirar el medio y añadir DMEM completo con 1 g/ml DOX. Incubar células a 37oC, 5%CO2 durante 2 días.</li>
	<li>Recoger fibroblastos y analizar los sitios de unión genómica de los tres TF transducidos individualmente o en combinación, por ChIP-seq 2 días después de la suplementación con DOX14. NOTA: Los últimos setenta y dos platos de 100 mm contendrán entre 20 x 50 x 106 células, suficientes para realizar experimentos Y réplicas de ChIP-seq.</li>
</ol>

<ol><li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+potent+human+hematopoietic+stem+cells+first+emerge+in+the+intraembryonic+aorta-gonad-mesonephros+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region.</a> Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).</li>
<li>Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., Péault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of human hematopoiesis.</a> International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).</li>
<li>Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+the+adult+hematopoietic+system%3A+advances+and+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions.</a> Development. 138, 1017-1031 (2011).</li>
<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+haematopoietic+stem+cell+development%3A+from+the+embryo+to+the+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li>
<li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).</li>
<li>Vo, L., Daley, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+HSCs+from+somatic+and+pluripotent+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources.</a> Blood. 125, 2641-2648 (2015).</li>
<li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121, 770-781 (2013).</li>
<li>Ebina, W., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+toward+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells.</a> EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+Hemogenic+Program+in+Mouse+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Reprogramming+In+vitro+Informs+In+Vivo+Identification+of+Hemogenic+Precursors+to+Definitive+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells.</a> Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).</li>
<li>Notta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Single+Human+Hematopoietic+Stem+Cells+Capable+of+Long-Term+Multilineage+Engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment.</a> Science. 333, 218-221 (2011).</li>
<li>Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., Péault, B., Tavian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin-converting+enzyme+%28CD143%29+specifies+emerging+lympho-hematopoietic+progenitors+in+the+human+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo.</a> Blood. 119, 3712-3724 (2012).</li>
<li>Gomes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Transcription+Factor+Induction+Mediates+Hemogenic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming.</a> Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).</li>
<li>Karlsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+The+Tetraspanin+CD9+Affords+High-Purity+Capture+of+All+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Reports. 4, 642-648 (2013).</li>
<li>Leung, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetraspanin+CD9+regulates+migration%2C+adhesion%2C+and+homing+of+human+cord+blood+CD34%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 117, 1840-1851 (2011).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).</li>
<li>Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+concentration+and+titration+of+pseudotyped+HIV-1-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.</a> Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).</li>
<li>Suzuki, Y. S., Suzuki, Y. Gene Regulatable Lentiviral Vector System. Viral Gene Therapy. Ke, X. , (2011).</li>
<li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157, 549-564 (2014).</li>
<li>Lis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+endothelium+to+immunocompetent+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells.</a> Nature. 545, 439-445 (2017).</li>
<li>Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood+to+blood%E2%80%99%3A+de-differentiation+of+hematopoietic+progenitors+to+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">From blood to blood’: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells.</a> EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Signatures+of+Tissue-Specific+Microvascular+Endothelial+Cell+Heterogeneity+in+Organ+Maintenance+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration.</a> Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Murine+Fibroblasts+to+Hematopoietic+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells.</a> Cell Reports. 9, 1871(2014).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mouse+fibroblasts+into+engraftable+myeloerythroid+and+lymphoid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors.</a> Nature Communications. 7, 1-15 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este artículo, se describe un método para generar células progenitoras hematopoyéticas directamente a partir de fibroblastos humanos, que pasan a través de una célula HP intermedia, de forma similar a los HSC14definitivos.
Se prefirió la producción de partículas lentivirales que codifican GATA2, GFI1B y FOS sobre la producción individual, ya que en nuestras manos se traduce en mayores eficiencias de reprogramación (datos no publicados). Lentiviruses, como miembros de la familia Retroviridae, normalmente contienen dos copias de ARN positivo de una sola cadena19. El aumento de la eficiencia de reprogramación puede deberse al empaquetado de dos transgenes diferentes en la misma partícula lentiviral, lo que resulta en un mayor número de células cotransducidas con los tres factores de transcripción. Para asegurar el éxito de este protocolo, es necesario transducir los HDF con una cantidad adecuada de virus dependiendo del paso celular para obtener un equilibrio óptimo entre la eficiencia de reprogramación y la viabilidad celular, como se recomienda en el paso 4.6. Además, se pueden utilizar virus frescos no concentrados. Se recomienda transducir las células con 0.5-3 mL de la agrupación 3TF s y M2rtTA. Además, la densidad celular debe ajustarse de acuerdo con la aplicación. 150 000 HDF por placa de 6 pocillos (paso 4.4) proporcionaron la densidad óptima para realizar el análisis de FACS, trasplante y citometría de flujo de células reprogramadas. Para los experimentos ChIP-seq, se requerían más celdas desde el principio (paso 5.1). Es importante revisar las células regularmente en busca de cambios morfológicos y reemplazar el medio hematopoyético dos veces por semana para apoyar la aparición de células hematopoyéticas inducidas. La adición de citoquinas hematopoyéticas o cocultivo en capas de alimentación puede aumentar la eficiencia de reprogramación.
Con este método, podemos identificar nuevos marcadores hematopoyéticos que se expresan dinámicamente durante la reprogramación hemogénica. CD9, que se demostró que estaba regulado en células reprogramadas en el nivel de transcripción14,se expresa rápidamente en la superficie celular en las fases iniciales de reprogramación junto con CD49f y CD143, sirviendo como un marcador novedoso de precursores humanos de HSC. También demostramos que ITGA6 y ACE son objetivos directos de GATA2 durante las etapas iniciales de la reprogramación hemogénica, además de CD9 y CD3414,proporcionando un vínculo mecanicista directo entre los hemogénicos humanos fenotipo precursor y GATA2.
Una ventaja de este sistema reside en el uso de cultivos de fibroblastos relativamente homogéneos. Mientras que los PSC se expanden y mantienen fácilmente in vitro,los protocolos de diferenciación generan poblaciones heterogéneas que incluyen progenitores hematopoyéticos, que injertan mal5,6,7. Además, existe el riesgo de tumorigenesis al trasplantar HSPC derivados de PSC, ya que los PsCCP indiferenciados todavía pueden permanecer en cultivo incluso después de emplear protocolos de diferenciación. Alternativamente a los fibroblastos, la reprogramación directa de los HSC se ha aplicado a los progenitores20 y a las células endoteliales21. Sin embargo, a partir de células progenitoras restringidas en sangre, se dificulta la aplicación terapéutica de los HSC resultantes si el paciente lleva mutaciones que afectan a la población hematopoyética del tallo/progenitor222. En el caso de las células endoteliales, son más difíciles de obtener en comparación con los fibroblastos, y constituyen una población celular muy heterogénea en términos de fenotipo, función y estructura, que dependen de órganos23. Otros estudios han logrado reprogramar fibroblastos de ratón en progenitores hematopoyéticos enesbables24,25 sin embargo, hasta ahora, ningún otro protocolo describe la generación de células similares a HSPC a partir de fibroblastos humanos.
Este enfoque, junto con la inhibición farmacológica, el desconexión genética o los permisos de derribo para definir factores individuales o combinados que se requieren para inducir directamente hSC humanos. Las tecnologías CRISPR-Cas9 en HDF antes de la reprogramación, representan un esfuerzo emocionante para definir nuevos reguladores de la hematopoyesis definitiva humana. En el futuro, la reprogramación de los tipos de células humanas no relacionadas con la sangre, como los fibroblastos, servirá como plataforma para generar células progenitoras hematopoyéticas sanas adaptadas al paciente para aplicaciones clínicas.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.
The second author affiliation was&#160;updated from:
2Wallenberg Center for Molecular, Lund University
to:
2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/60112/hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression">Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors</a>. The author affiliations were updated.

Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Células hematopoyéticas definitivas de tallo y progenitoras (HSPC) emergen en la región aorta-gonad-mesonephros (AGM) y placenta de precursores endoteliales con capacidad hemogénica, a través de una transición endotelial a hematopoyética (EHT)1, 2. Los precursores hemogénicos (HP) expresan marcadores endoteliales y hematopoyéticos, pero su identificación precisa sigue siendo esquiva, particularmente en el sistema humano. A pesar de ser un proceso relativamente conservado en mamíferos, el desarrollo de células madre hematopoyéticas (HSC) todavía difiere significativamente entre los seres humanos y los modelos de ratón3,4. Por lo tanto, se necesitan enfoques in vitro para recapitular el desarrollo humano de HSC.
La diferenciación de las células madre pluripotentes (PSC) a las HSC, aunque prometedora, ha alcanzado un éxito limitado en los últimos 20 años, principalmente debido a los protocolos de diferenciación disponibles, que dan lugar a progenitores hematopoyéticos primitivos con un injerto deficiente capacidad5,6,7. Alternativamente, se han aplicado metodologías de reprogramación directa de celdas para generar células similares a HSPC a partir de varios tipos de celdas, utilizando factores de transcripción (TF)8,9. En particular, la sobreexpresión de tres TF, Gata2, Gfi1b y cFos, convirtió fibroblastos embrionarios de ratón en HSCCP a través de un intermedio de HP con un fenotipo definido (Prom1+Sca-1+CD34+CD45-)10. Este proceso se asemejaba a la EHT que se produce en el embrión y la placenta, durante la especificación de la hematopoyesis definitiva. Este fenotipo permitió la identificación y aislamiento de una población de HP en la placenta del ratón que después del cultivo a corto plazo y la activación de notch generaron HSCs trasplantables en serie11.
Hasta ahora, no se ha establecido ningún fenotipo que distinga los HSC humanos de sus precursores, pero se sabe que algunas moléculas se expresan en los HSC emergentes. células en el compartimiento12del HSC, y la enzima de conversión de angiotensina (ACE o CD143) está presente en los precursores hematopoyéticos negativos CD34 en los tejidos embrionarios que forman sangre13.
Recientemente, hemos demostrado que las versiones humanas de los tres TF, GATA2, FOS y GFI1B reprograman fibroblastos dérmicos humanos (HDF) en HP con capacidad de injerto a corto plazo14. En las fases iniciales de reprogramación, GATA2 activa la cromatina abierta y recluta a GFI1B y FOS para reprimir los genes fibroblastos y activar genes endoteliales y hematopoyéticos. Células inducidas altamente expresadas CD49f y ACE, y contenían un pequeño porcentaje de células que expresaban el marcador HSPC CD34. El gen CD9, que se expresa en los HSC15 y es importante para la cesión16,se demostró que era un objetivo directo de GATA2 y entre los genes más regulados en las células reprogramadas14. Por lo tanto, CD9 puede constituir un marcador adicional para los HP de hematopoyesis definitiva humana.
En este protocolo, describimos la generación de células similares a HSPC a partir de fibroblastos humanos a través de la expresión forzada de GATA2, GFI1B y FOS, así como un método adaptado para el análisis de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) (seq) Reprogramación. Los TF se codificaron en un vector lentiviral inducible por doxiciclina (DOX) (pFUW-tetO) que contiene un elemento de respuesta a la tetraciclina (TRE) y un promotor mínimo de CMV, y fueron transducidos junto con un vector constitutivo que contiene la tetraciclina inversa transactivador (pFUW-M2rtTA). Cuando DOX (análogo de la tetraciclina) se añade después de la transducción, se une a la proteína rtTA que interactúa con el TRE permitiendo la transcripción TF (sistema Tet-On). El procedimiento requiere 25 días para completarse. Para los experimentos ChIP-seq, los HDF fueron transducidos con versiones etiquetadas de GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) y GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), además de pFUW-tetO-FOS y sitios de enlace TF se analizaron dos días después de la suplementación con DOX.
En última instancia, la reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos proporciona un sistema manejable in vitro para estudiar los mecanismos subyacentes a la hematopoyesis del desarrollo humano y una fuente potencial de HSCCP específicos del paciente para su aplicación clínica futura.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Filtro de unión a proteínas de baja proteína, 150 mL Filtro de vacío con tapa de botella Corning</td><td></td><td>#430625</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M6250</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-humano clon de CD34 581</td><td>BioLegend</td><td>#343518</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Ratón APC Anti-Humano Enzima convertidora de angiotensina (CD143) clon BB9</td><td>BD Biosciences</td><td>#557929</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada BES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#14280</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#449709</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo, Amicon Ultra-15 Unidad de filtro centrífugo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#UFC903096</td><td></td></tr><tr><td>Solución de disociación, TrypLE Express Enzyme (1x) rojo sin fenol</td><td>Gibco</td><td>#12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Hicalato de doxiciclina (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D9891</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience CD49f (Integrina alfa 6) Anticuerpo monoclonal (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7</td><td>Invitrogen</td><td>#25-0495-82</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>#20342</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina tipo A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G1890</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-Glutamina (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Medio hematopoyético, MyeloCult H5100</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#05150</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de hexadimetrina (polibreno)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H9268</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos dérmicos humanos (HDFs)</td><td>ScienCell</td><td>#2320</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modificado Eagles Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>#SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Suero fetal bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>#SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicilina Estreptomicina 100x Solución (Pluma/Estreptococo)</td><td>GE Healthcare</td><td>#SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Solución salina tamponada de fosfato (PBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>#SH30256.01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#7904</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ratón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M5905</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-humano CD9 clon HI9a</td><td>BioLegend</td><td>#312105</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2</td><td>Addgene</td><td>#125600</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-FOS</td><td>Addgene</td><td>#125598</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-GATA2</td><td>Addgene</td><td>#125028</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO-GFI1B</td><td>Addgene</td><td>#125597</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-HA-GFI1B</td><td>Addgene</td><td>#125599</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr></tbody></table>

reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la especificación de las células madre hematopoyéticas humanas (HSC) siguen siendo esquivas. Se requieren estrategias para recapitular la aparición humana de HSC in vitro para superar las limitaciones en el estudio de este complejo proceso de desarrollo. Aquí, describimos un protocolo para generar tallo hematopoyético y células similares a progenitoras a partir de fibroblastos dérmicos humanos que emplean un enfoque de reprogramación celular directa. Estas células transitan a través de un tipo de célula intermedia hemogénica, que se asemeja a la transición endotelial a hematopoyética (EHT) característica de la especificación HSC. Los fibroblastos fueron reprogramados a células hemogénicas a través de la transducción con factores de transcripción GATA2, GFI1B y FOS. Esta combinación de tres factores indujo cambios morfológicos, expresión de marcadores hemogénicos y hematopoyéticos y programas transcripcionales dinámicos de EHT. Las células reprogramadas generan progenie hematopoyética y repoblan ratones inmunodeficientes durante tres meses. Este protocolo se puede adaptar a la disección mecanicista del proceso de EHT humano como se ejemplifica aquí mediante la definición de objetivos DE GATA2 durante las primeras fases de la reprogramación. Por lo tanto, la reprogramación hemogénica humana proporciona un enfoque simple y manejable para identificar nuevos marcadores y reguladores de la aparición humana de HSC. En el futuro, la inducción fiel del destino hemogénico en fibroblastos puede conducir a la generación de HSC específicos del paciente para trasplante.

En la Figura 1Ase ilustra una representación esquemática del enfoque de reprogramación mediante discos duros de definición. Los fibroblastos se adquieren de fuentes comerciales o se recogen de donantes humanos y se expanden in vitro antes de la reprogramación. Después del chapado, las células se transduyen dos veces con lentivirus DE GATA2, GFI1B y FOS (y M2rtTA), y la doxiciclina se agrega en el día 0 de la reprogramación. El día 2, las células se dividen y se chapan en medio hematopoyético hasta el día 25 del cultivo. Las células reprogramadas pueden generarse en diferentes momentos para múltiples aplicaciones, incluyendo trasplante en ratones inmunocomprometidos, secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) de poblaciones de células purificadas (día 2 sin clasificar, día 15 CD49f+ CD34 y día 25 CD49f+CD34+ células), así como análisis de microscopía y citometría de flujo para los marcadores de superficie celular CD49f, CD34, CD9 y CD143. Las gráficas representativas de la citometría muestran el 17 % de las celdas reprogramadas que expresan CD49f y CD9(Figura 1B, panel izquierdo),después de 25 días de reprogramación. La mayoría de las células positivas dobles expresan CD143 (86%) y una pequeña población expresa CD34 (0,9%), lo que sugiere una inducción dinámica del destino hemogénico. Estos marcadores no se activan en los HDF transducidos por M2rtTA cultivados durante 25 días(Figura 1B, panel derecho). Las imágenes de inmunofluorescencia confirman la expresión de CD9 y CD143 en células adherentes y redondas, morfológicamente distintas de los fibroblastos negativos para estos marcadores(Figura 1C). Las colonias hemogénicas humanas también expresan CD49f y CD3414. El análisis ScRNA-seq de HDFs, el día 2 de células no ordenadas y las células reprogramadas purificadas en el día 15 (CD49f+CD34-) y el día 25 (CD49f+CD34+) muestran un aumento escalonado en la expresión CD49f, CD9 y CD143 desde el día 2 hasta el día 25. Las células positivas CD49f y CD9 aparecen primero durante el proceso de reprogramación, entre los días 2 y 15, lo que indica que estas moléculas pueden representar marcadores de hemogénesis humana temprana. La expresión CD143 comienza a detectarse en el día 15 y las celdas de expresión CD34 se detectan solo en los puntos de tiempo posteriores (día 25). CD34+ Se utilizaron como referencia las células de la sangre del cordón umbilical (UCB)(Figura 1D).
La Figura 2A describe un protocolo modificado para generar un número suficiente de células para el análisis ChIP-seq en las etapas iniciales de la reprogramación hemogénica (día 2). En primer lugar, los HDF se celen a una densidad dos veces mayor que en el protocolo estándar (300.000 celdas frente a 150.000 celdas por placa). Después de la transducción, cada pozo se re-placa en un plato de 100 mm permitiendo que las células se expandan durante 6 días antes de complementar el medio con DOX. Las celdas se analizan 2 días después de agregar DOX y la expresión TF consecuente. La Figura 2B muestra los perfiles del navegador del genoma de GATA2 que se unen a las regiones reguladoras genómicas de ITGA6 y ACE cuando las células se transduelen con los tres factores (3TO) o GATA2 individualmente. GATA2 también se une a las regiones abiertas de cromatina de los genes CD9 y CD34 14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig1a.jpg"> Figura 1: Inducción del destino hemogénico en fibroblastos dérmicos humanos. (A) Estrategia experimental para la reprogramación hemogénica de fibroblastos dérmicos humanos (HDF). Los fibroblastos de las biopsias de punzonado de la piel se recogen de donantes, se expanden y transdujeron con lentivirus GATA2, GFI1B, FOS y M2rtTA. La doxiciclina (DOX) se agrega al cultivo en el día 0 de la reprogramación y las células se analizan en varios puntos de tiempo hasta el día 25. scRNA-seq, secuenciación de ARN de una sola célula. FACS, Clasificación de células activadas por fluorescencia. (B) Estrategia de gating utilizada para evaluar la expresión de marcadores hemogénicos/hematopoyéticos mediante citometría de flujo en el día 25 después de la transducción con los tres factores de transcripción (3TO). Las gráficas de citometría muestran el porcentaje de celdas positivas dobles para CD49f y CD9, cerradas en la población de células vivas (DAPI negativa). Dentro de la doble población positiva, se muestra la expresión de CD143 y CD34. Los HDF transducidos sólo con el virus M2rtTA en las mismas condiciones de cultivo se utilizan como control. (C) Imágenes de inmunofluorescencia de las colonias reprogramadas del día 25 que confirman la expresión de CD9 (panel superior) y CD143 (panel inferior). Las células se tiñeron con anticuerpos(Tabla de Materiales)diluidas 1:100 en PBS/2% FBS con suero de ratón, incubadas 20 min a 37oC, 5% CO2,lavadas tres veces e imagendas en PBS/2% FBS. Fase, contraste de fase-gradiente. Barras de escala a 50 m. (D) Análisis ScRNA-seq de 253 celdas en diferentes puntos de tiempo. La expresión de ITGA6, CD9, ACE y CD34 se activa durante la reprogramación. Las células se recogen en el día 2 (sin clasificar), el día 15 (CD49f+CD34-) y el día 25 (CD49f+CD34+). Las células HDF y CD34+ sangre de cordón umbilical (34+UCB) se utilizan como referencias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig1alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60112/60112fig02.jpg"> Figura 2: Expansión de fibroblastos dérmicos humanos para el análisis ChIP-seq. (A) Estrategia experimental que representa un protocolo modificado para generar un gran número de fibroblastos dérmicos humanos transducidos (HDF) para ChIP-seq en el día 2 de la reprogramación. 300.000 células se celen en placas de 6 pocillos y se transdulan dos veces con factores individuales (pFUW-tetO-FOS, pLV-tetO-HA-GFI1B o pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) o una combinación de los tres factores (más M2rtTA). Después de eliminar los virus, los fibroblastos se expanden durante seis días en platos de 100 mm. La doxiciclina (DOX) se agrega en el día 0 y las células se recogen dos días después de la adición de DOX. (B) Perfiles del navegador del genoma destacando los sitios de unión DE GATA2 (cajas grises) en ITGA6 y ACE loci dos días después de la transducción con los tres factores de transcripción (3TO) o solo con GATA2. El número total de lecturas asignadas se representa en el eje Y. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1.jpg"> Figura suplementaria 1: Definición de un volumen lentiviral optimizado para una reprogramación hemogénica eficiente. El aumento de los volúmenes de partículas lentivirales concentradas (10 a 100 ol) producidas en piscinas (3TF: GATA2, GFI1B y FOS) se utilizan para transducir fibroblastos dérmales humanos (HDF), junto con M2rtTA en una proporción de 1:1, siguiendo los pasos 4.5 a 4.12 del protocolo. Las células reprogramadas se analizan en el día 25 para definir un volumen óptimo de transducción para la reprogramación hemogénica, dado por el porcentaje de CD49f+CD9+ células cerradas en células vivas (DAPI-negativa). La viabilidad celular se puede evaluar cuantificando el número absoluto de células vivas en el día 25. Los HDF transducidos con M2rtTA (100 l) se utilizan como control negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplementary Figure 2" src="/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2.jpg"> Figura suplementaria 2: Cambios morfológicos durante la reprogramación hemogénica de fibroblastos dérmicos humanos. Los cultivos de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se imágenen en el día de la primera transducción (día -2), cuando doX se añade a los cultivos (día 0), dos días (día 2) y quince días (día 15) después de la suplementación con DOX, y en el punto final del experimento (día 25). Se destacan las colonias hemogénicas en los días 15 y 25. Barras de escala a 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60112/60112suppfig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo demuestra la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos dérmicos humanos mediante la expresión forzada de los factores de transcripción GATA2, GFI1B y FOS para generar células hematopoyéticas madre y progenitoras.

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Este método ayuda a superar las limitaciones en el estudio del desarrollo hematopoyético humano proporcionando una plataforma in vitro simple y manejable basada en la reprogramación directa de células. La demostración visual de este método proporcionará una guía ideal en pasos fundamentales para generar células hemogénicas humanas, a saber, durante la producción lentiviral, la transducción de fibroblastos y el cultivo celular. Al convertir fibroblastos de la piel en precursores hemogénicos, esperamos generar células hematopoyéticas específicas del paciente y células progenitoras en número suficiente para el trasplante de células madre.Comience por el cultivo de células HEK293T en un plato tratado de cultivo de tejido de 100 milímetros con 10 mililitros de DMEM completo a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono hasta la confluencia. El día anterior a la transfección, después de aspirar el medio, lave el plato cuidadosamente con cinco mililitros de PBS y separe las células con 1,5 mililitros de solución de disociación. Después de incubar durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados, inactivar la solución con tres mililitros de DMEM completo y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros.Lave el plato con 5 mililitros de DMEM completo para eliminar las células conectadas restantes y tire del lavado con la solución celular. Recoger las células por centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspend el pellet en seis mililitros de DMEM completo. Luego, divida la suspensión uniformemente entre seis platos tratados de cultivo de tejido de 100 milímetros en un volumen final de 10 mililitros de DMEM completo por plato.Al día siguiente, añadir 10 microgramos de masa total de los tres plásmidos de transferencia juntos a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, añada 10 microgramos de la segunda generación de vectores de empaquetado psPAX2 que codifican los genes gag, pol, tat y rev seguidos de la adición de cinco microgramos de pMD2. Vector de envolvente G que codifica el gen VSV-G al tubo.Por último, agregue agua para llevar el volumen final a 500 microlitros. En dos nuevos tubos cónicos de 15 mililitros, agregue 10 microgramos de plásmido FUW-M2rtTA, 10 microgramos del vector de envasado y cinco microgramos del vector de envolvente a cada tubo. A continuación, agregue agua hasta un volumen final de 500 microlitros a cada tubo.A continuación, añada 62,5 microlitros de dos cloruros de calcio molar a cada uno de los tres tubos y utilice un controlador de pipetas equipado con una pipeta Pasteur para liberar burbujas en cada mezcla. Mientras se forman las burbujas, añada 500 microlitros de solución salina tamponada BES contra la pipeta Pasteur y sobre la mezcla. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos hasta que las mezclas parezcan ligeramente turbias.Durante la incubación, reemplace cuidadosamente el sobrenadante de los cultivos celulares HEK293T por 10 mililitros de DMEM completo sin antibióticos. Distribuya los complejos de ADN dropwise en platos individuales de cultivo celular HEK293T e incubar durante 24 horas. Al día siguiente, sustituya los sobrenadantes por cuatro mililitros de DMEM completo por cultivo y devuelva los platos a una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono de 37 grados Centígrados durante la noche.A la mañana siguiente, recoger los sobrenadantes en un tubo de 50 mililitros por plato y añadir cuatro mililitros de medio fresco a cada plato. Después de ocho horas más de cultivo, acoja el sobrenadante en cada plato con el sobrenadante previamente cosechado y agregue cuatro mililitros de medio fresco. Devuelva los platos a la incubadora de cultivo celular durante la noche y recoja los sobrenadantes una última vez.Cuando se haya recogido todo el virus, filtre cada sobrenadante lentiviral a través de un filtro de unión baja a proteínas de 0,45 micrómetros en tubos individuales y agregue un máximo de 15 mililitros de sobrenadante filtrado a unidades de filtro centrífugo individuales para la centrifugación. Deseche el flujo a través. Un líquido que contiene lentivirus viscoso permanecerá en la unidad de filtro.Cuando todo el sobrenadante lentiviral se ha filtrado alícuota 50 a 200 microlitros de los lentivirus concentrados para almacenamiento en frío. Antes de comenzar el procedimiento de reprogramación, codifique una placa tratada de cultivo de tejido de seis pozos con 500 microlitros de 0,1% de gelatina por pozo e incubar la placa durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, aspirar la solución de gelatina restante.Placa fibroblastos dérmicos humanos a una densidad de 1,5 veces diez a las quintas células por placa en dos mililitros de DMEM completo por pozo e incubar durante la noche. A la mañana siguiente, sustituya el medio de cada pozo por dos mililitros de DMEM completo suplementado con ocho microgramos por mililitro de polibrena y añada una mezcla de lentivirus de factor de transcripción producido en la piscina y M2rtTA en un nuevo tubo de microcentrífuga. A continuación, transducir el fibroblasto con un volumen óptimo de la mezcla lentiviral, entre 10 y 100 microlitros por pozo.Después de 16 horas de incubación, sustituya los sobrenadantes con DMEM completo y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante seis a ocho horas. Después de la recuperación, reemplazar los sobrenadantes con dos mililitros de DMEM completo suplementado con polibreno y realizar una segunda transducción como acaba de demostrar. Al final de la segunda incubación de transducción, sustituya los sobrenadantes con DMEM completo suplementado con un microgramo por mililitro de doxiciclina y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas.Al final de la incubación, dividir cada pozo en una proporción de uno a dos y replatear las células en dos mililitros por pozo de medio hematopoyético complementado con doxiciclina en una nueva gelatina recubierta de seis pozos. Para obtener un número suficiente de células para el análisis de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina, placa tres veces 10 a la quinta fibroblastos en una gelatina recubierta de seis pozos de placa e incubar durante la noche. Al final de la incubación, transducir células dos veces en dos días consecutivos con 10 a 20 microlitros de lentivirus que contienen los factores individuales de interés o un conjunto de los tres factores más FUW-M2rtTA en una proporción de uno a uno.16 horas después de la segunda transducción, eliminar el virus que contiene sobrenadante e incubar las células en DMEM completo durante 24 horas. Al final de la incubación, replaca el contenido de cada pozo en platos individuales recubiertos de gelatina de 100 milímetros tratados con DMEM completo con DMEM completo a un volumen final de 10 mililitros de medio por plato, y devolver las células a la incubadora de cultivo celular. Después de seis días, reemplace el sobrenadante con DMEM completo complementado con doxiciclina.Devuelva los cultivos a la incubadora durante dos días adicionales. Como demuestran estas gráficas representativas de citometría, aproximadamente el 17% de las células reprogramadas expresan CD49f y CD9 después de 25 días de reprogramación. La mayoría de las células doblemente positivas expresan CD143 y una pequeña población expresa CD34, lo que sugiere una inducción dinámica del destino hemogénico.Estos marcadores no se activan en fibroblastos dérmicos humanos transducidos por M2rtTA cultivados durante 25 días. Las imágenes de inmunofluorescencia confirman la expresión de CD9 y CD143 en células adherentes y redondas que son morfológicamente distintas de los fibroblastos, que son negativas para estos marcadores. Las imágenes de Brightfeild se realizan para visualizar la confluencia celular, la morfología y la formación de colonias a lo largo del proceso de reprogramación.El análisis de secuenciación de ARN de una sola célula de las células reprogramadas revela un aumento escalonado en la expresión CD49f, CD9 y CD143 de los días dos a 25. Después de la secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina, los perfiles del navegador genómico muestran la unión GATA2 a las regiones reguladoras genómicas de ITGA6 y ACE cuando los fibroblastos se cotrans inducen con los tres factores o GATA2 individualmente. El volumen de partículas antivirales añadidas al cultivo debe optimizarse para una reprogramación exitosa sin comprometer la viabilidad celular.Esta plataforma se puede combinar con la inhibición farmacológica y las tecnologías de cribado a escala del genoma, como CRISPR-Cas9, para definir nuevos reguladores de la hematopoyesis definitiva humana. Este enfoque de reprogramación directa permitirá a los investigadores explorar nuevas preguntas en el campo de la hematopoyesis del desarrollo humano y descifrar los mecanismos subyacentes a la especificación de las células madre hematopoyéticas humanas. Es importante realizar recogidas y transducciones antivirales en una campana de flujo laminar dedicada al trabajo lentiviral y desechar los residuos contaminados virales en un recipiente adecuado.

hemogenic-reprogramming-human-fibroblasts-enforced-expression

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

Demostramos el protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas humanas con lentivirus mediada por la entrega de los factores humanos Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Pluripotencia fue confirmada por la morfología y la presencia de células madre embrionarias (ES) de células específicas de los marcadores.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos humanos con los Lentivirus Stemgent Humanos TF Set

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Este video muestra la reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas modificadas genéticamente en células madre neuronales. Los factores de transcripción expresados por las células progenitoras hematopoyéticas desencadenan una cascada de eventos moleculares que facilitan su transformación. Se utilizan otros medios específicos para seleccionar y cultivar células madre neuronales inducidas.

Reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas en células madre neurales

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Este protocolo describe la inducción eficiente de endotelio hemogénico y progenitores hematopoyéticos multipotenciales a partir de células madre pluripotentes humanas a través de la expresión forzada de factores de transcripción.

La inducción directa de Hemogenic endotelio y la Sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción en células madre pluripotentes Humanos

El protocolo descrito aquí detalla la inducción de un programa hemogénico en fibroblastos embrionarios de ratón a través de la sobreexpresión de un conjunto mínimo de factores de transcripción. Esta tecnología puede trasladarse al sistema humano para proporcionar plataformas para futuros estudios de la hematopoyesis, la enfermedad hematológica y el trasplante de células madre hematopoyéticas.

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

Reprogramación neuronal directa genera neuronas que mantienen la edad de la partida de la célula somática. Aquí, describimos un método único basado en vectores para generar neuronas inducidas de fibroblastos dérmicos obtenidos de donantes humanos adultos.

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

Aquí presentamos un método robusto para reprogramar fibroblastos embrionarios primarios en cardiomiocitos funcionales a través de la sobreexpresión de GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 y miR-133 (GHMT2m) junto con la inhibición de la señalización de TGF-β. Nuestro protocolo genera cardiomiocitos paliza tan pronto como transducción después de 7 días con hasta un 60% eficiencia.

Supresión de la señalización Pro-fibróticos potencia Factor-mediada la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón en cardiomiocitos inducida

Presentamos nuestro protocolo para producir inducida por progenitores eritroides (iEPs) de fibroblastos adultos ratón usando transcripción basada en el factor dirigen linaje reprogramación (DLR).

Directo linaje reprogramación de fibroblastos de ratón adulto a progenitores eritroides

Aquí describimos un método clínicamente relevante, alta eficiencia y libre de alimentador para reprogramar fibroblastos primarios humanos en células pluripotentes inducidas, usando modificado mRNAs que codifican factores de reprogramación y microRNA maduro-367/302 imita. También se incluyen métodos para evaluar la eficiencia de reprogramación, ampliar las colonias clonales iPSC y confirmar la expresión de los marcadores de pluripotencia TRA-1-60.

Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

Aprende a reprogramar fibroblastos dérmicos humanos mediante expresión forzada de GATA2, GFI1B y FOS para generar células madre hematopoyéticas. Este protocolo ofrece una plataforma in vitro para estudiar el desarrollo hematopoyético humano.

Reprogramación hemogénica de fibroblastos humanos por expresión forzada de factores de transcripción

Explorar más videos