Name: Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende a cultivar esferoides 3D de fibroblastos asociados al cáncer usando metilcelulosa y MEM con suero. Este modelo permite estudiar la diferenciación celular en un entorno tumoral más fisiológico que los cultivos 2D.

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Reconocemos la ayuda de Barbara Schedding en la preparación del BM2 y el lebein-1. Reconocemos a Gnes Noel por compartir su experiencia en ensayos esferoides. Agradecemos a Sonja Schelhaas y Michael Sch-fers por su ayuda en el manejo de la transfección lentiviral bajo condiciones S2. Reconocemos la asistencia de Sabine von R-den en la preparación de los CAF a partir del tejido de cáncer de páncreas.
La investigación que ha llevado a estos resultados ha recibido financiación del Programa de Personas (Marie Curie Actions) del Séptimo Programa Marco FP7/2007-2013 de la Unión Europea/ en virtud del acuerdo de subvención rea (316610) a J.A.E. Además, J.A.E. y A.C.M.C. contaron con el apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro del Clúster de Excelencia de Cells-in-Motion (EXC 1003-CiM). Este proyecto también fue apoyado por Wilhelm Sander Stiftung (subvención: 2016.113.1 a J.A.E.).

1. Esferoides 3D como modelo in vitro para la diferenciación de fibroblastos/CAF utilizando diferentes compuestos de inhibición de TGF-1 de interacción célula-matriz
<ol><li>Mezclar 1 parte de la solución de metilcelulosa de 6 mg/ml y 3 partes de los medios de cultivo celular, MEM complementado con 1% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina para obtener la solución de formación de esferoides.</li>
	<li>Resuspender los fibroblastos normales inmortalizados recién desconectados (iNF), CAF inmortalizado (iCOF) o integrin a 3o KO iCAF (paso hasta 25) en la solución de formación de esferoides. Si prepara una placa de 96 pozos, prepare un exceso de solución de formación de esferoides, 10 ml y agregue 75.000 células, teniendo en cuenta que cada esferoide está compuesto por 750 células, y que se distribuyen 100 ml por cada pocil de la placa.</li>
	<li>Si las citoquinas o inhibidores de la integrina están incluidos en el estudio, agregue estos compuestos a la suspensión celular, con el fin de incrustarlos en los esferoides durante su formación. Tenga en cuenta que los iNF se estimulan con 10 ng/ml de TGF-1 para desencadenar la diferenciación. Cuando proceda, añada los compuestos inhibidores junto con el TGF-1, como 20 g/ml BM2 o 10 g/ml de lebeína 1.</li>
	<li>Preparar los homoesferoides CAF de la misma manera pero sin el estímulo TGF--1, ya que ya están diferenciados. Preparar los homospheroides de capero sin adición de ningún compuesto.</li>
	<li>Distribuya la solución de formación de esferoides en una placa de 96 pocillos de fondo redondo añadiendo 100 ml de la solución en cada pocal. Cada vez que la solución de esferoides se distribuye en los pozos, mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo, varias veces.</li>
	<li>Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas para permitir que se forme un esferoide en cada pocal.</li>
	<li>Recoger los esferoides después de aproximadamente 24 h y utilizarlos para diferentes propósitos aguas abajo: tinción inmunofluorescente, en tiempo real (RT) q-PCR y citometría de flujo. Para detectar la expresión de antígenos intra y extracelulares, incluida la deposición de proteínas ECM dentro del esferoide, utilice la tinción inmunofluorescente. Después de la desintegración de los esferoides en células individuales, cuantificar el receptor anclado por membrana por citometría de flujo. Para detectar la activación genética y los cambios transcripcionales, utilice RT q-PCR de ARNm aislado de las células esferoides.</li>
</ol>2. Tinción inmunofluorescente de esferoides
<ol><li>Recoger los esferoides después de unas 24 horas en un tubo de reacción de 1,5 ml por condición experimental o por proteína a analizar. Por ejemplo, coloque los esferoides de los iNF estimulados con TGF-1 en un tubo diferente de los iNF de control, que no fueron tratados. Para evitar la rotura de esferoides debido a fuerzas de cizallamiento demasiado fuertes, corte el extremo de la punta de la pipeta para agrandar el orificio. Incluir al menos 5-10 esferoides en un tubo de reacción, para permitir réplicas y tener en cuenta las posibles pérdidas durante los pasos de lavado.</li>
	<li>Centrifugar los esferoides con una centrífuga de sobremesa durante unos 30-60 s a 1.000 x g. Retire cuidadosamente el sobrenadante que contiene metilcelulosa pipeteando, sin perturbar los esferoides peletizares.</li>
	<li>Lavar con 50 s de 1x PBS. Repita el paso de centrifugación y retire cuidadosamente el PBS pipeteando, como se describe en 2.2.</li>
	<li>Dependiendo de la proteína a teñir, fijar con 50 éL de 4% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (para las subunidades de laminina- 3oC, NG2 e integrina n.o 3o1) o con 50 ml de metanol durante 10 min a -20 oC (para las subunidades laminina-332).</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3.</li>
	<li>Permeabilizar las células con 0.1% Triton-X en PBS durante 4 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3 tres veces.</li>
	<li>Incubar los esferoides en PBS que contienen 5% DE FBS y 2% de BSA, durante 1 h a RT para bloquear sitios de interacción proteica no específicos.</li>
	<li>Incubar los esferoides con 30 oC de anticuerpos primarios en PBS, 2,5% FBS y 1% de BSA a 4oC durante la noche. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-SMA Cy-3 conjugado y anti-NG2 a 5 g/ml; BM2 anti-laminin a 3, 6F12 anti-laminin a 3 y anti-laminin a 2 20 g/ml.</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3 tres veces.</li>
	<li>Incubar los esferoides con 30 l de anticuerpos secundarios en PBS, 2,5% FBS y 1% BSA a RT durante 90 min. Los siguientes anticuerpos secundarios utilizados fueron: Alexa 488 anticonejo y antiratón (5 g/ml).</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3 tres veces.</li>
	<li>Incubar las células con 30 ml de solución de tinción DAPI durante 4 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en los pasos 2.2-2.3.</li>
	<li>Coloque los esferoides en un portaobjetos de vidrio, en una gota de PBS, usando un pipeta Pasteur de vidrio.</li>
	<li>Imagen de los esferoides mediante microscopía de fluorescencia en un microscopio de escaneo láser utilizando un aumento de 10x. Tome diferentes secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes planos ópticos de una pila z (15-20 planos de pila). Para establecer la configuración del láser en el microscopio, utilice un esferoide compuesto de células negativas para el antígeno de interés o un esferoide manchado sólo con el anticuerpo secundario. Reutilice la misma configuración para todos los ejemplos que se compararán.</li>
	<li>Analice las imágenes microscópicas con el software ImageJ tal como se publicó anteriormente14. Los pasos se resumen en la Figura suplementaria 1. Como fondo, determine la densidad de señal integrada de una región de interés (ROI) libre de células. Calcule el total de fluorescencia celular corregida (TCCF) como: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60122/60122eq1.jpg">
</li>
	<li>Determinar la fluorescencia total corregida (TCF) de los esferoides como el TCCF normalizado al área de esferoide y el número de pilas. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60122/60122eq2.jpg">
</li>
</ol>3. RT q-PCR de homoesferoides
<ol><li>Para realizar RT-qPCR, recoja al menos 288 esferoides (correspondientes a tres placas de 96 pocillos) en un tubo de reacción de 50 ml. Centrifugar durante 5 min a 1.000 x g y eliminar cuidadosamente el sobrenadante que contiene metilcelulosa pipeteando sin molestar a los esferoides peletizados.</li>
	<li>Lavar con 1 ml de 1x PBS y transferir los esferoides a un tubo de reacción de 1,5 ml. Centrifugar los esferoides con una centrífuga de sobremesa durante unos 30-60 s a 1.000 x g. Retire cuidadosamente el PBS pipeteando, sin molestar a los esferoides peletizaron.</li>
	<li>Disociar los esferoides con 250 oL de colagenasa B de 4 mg/ml, 50 g/ml de DNase I, 2% de BSA, 1 mM de CaCl2 en PBS a 37 oC durante unos 30-45 minutos vórtice suavemente y pulsando intermitentemente durante unos segundos cada 5 minutos.</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en el paso 3.2.</li>
	<li>Aísle el ARN total de las células de los esferoides desintegrados utilizando un kit de aislamiento de ARN comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Reverse transcribe el ARNm aislado en ADNc con un kit comercial, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Cuantifique los niveles de transcripción en réplicas por PCR en tiempo real. Los imprimadores utilizados fueron: -SMA: Fw 5o-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3o, Rev 5o ACAGAGTATTTGCGCCCGAA-3o15; Cadena Laminin n.o 3: Fw 5o-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3o, Rev 5o-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3o16; Cadena Laminin n.o 3: Fw 5o-GGCAGATGATTAGCAGCCGAGGA-3o Rev 5o-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGT-3o17; Cadena Laminin n.o 2: Fw 5o-GATGGCATTCCTGCGAGAAG-3'Rev 5'-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3' 16; NG2: Fw 5o-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3'Rev 5'-TTGGCTTTTGACCCTGACTATG-3'18; integrin 3 subunidad: Fw 5'-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3'19; TOP-1: Fw 5o-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3o Rev 5o-GTCCAGG-GCTCTATCTTGAA-3o20.</li>
	<li>Corrija los valores ct para el valor Ct de un gen de referencia endógeno como TOP-1 utilizando la ecuación: 2- . •Ct (muestra de objetivo) – Ct (muestra de referencia) y Ct de gen objetivo o gen de referencia – TOP-I.</li>
</ol>4. Análisis de citometría de flujo de la expresión de integrina
<ol><li>Para el análisis citométrico de flujo, recoja al menos 288 esferoides (correspondientes a tres placas de 96 pocillos) en un tubo de reacción de 50 ml. Centrifugar durante 5 min a 1.000 x g y eliminar cuidadosamente el sobrenadante que contiene metilcelulosa pipeteando.</li>
	<li>Lavar con 1 ml de 1x PBS y transferir los esferoides a un tubo de reacción de 1,5 ml. Repita el paso de centrifugación y retire cuidadosamente el PBS pipeteando.</li>
	<li>Disociar los esferoides como se describe en el paso 3.3.</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en el paso 4.2.</li>
	<li>Para bloquear sitios de unión no específicos y evitar la unión de anticuerpos relevantes para la detección a los receptores de Fc -receptores (CD16, CD32 y CD64), incubar las células en 100 ol de PBS que contengan un 2% de suero de caballo (o suero de otra especie animal, cuyos anticuerpos no serán en el experimento) y 0,1% de BSA durante 20 min a 4oC con rotación.</li>
	<li>En caso de tinción de marcadores intracelulares, fijar/permeabilizar las células como se describe en el paso 2.2-2.5.</li>
	<li>Incubar las células con los anticuerpos primarios en 100 ml de PBS que contienen 2% de suero de caballo y 0,1% de BSA durante 30 min a 4 oC con rotación. Diluir el anticuerpo primario a 10 g/ml.</li>
	<li>Lavar con 100 s de PBS + 0,1% de BSA tres veces, con pasos de centrifugación en la centrífuga superior del banco a 1.000 x g en el medio.</li>
	<li>Incubar las células con los anticuerpos secundarios en 100 ml de PBS que contienen 2% de suero de caballo y 0,1% de BSA durante 30 min a 4 oC con rotación. Diluir el anticuerpo secundario a 10 g/ml.</li>
	<li>Repita el paso de lavado como se explica en el paso 4.7.</li>
	<li>Analice 2.0 x 104 células manchadas en un catómetro de flujo. Puerta para células vivas individuales a través de la gráfica de puntos FSC-SSC y analizar la fluorescencia de las células cerradas en el canal apropiado para el fluoróforo seleccionado.</li>
</ol>5. Ensayo de invasión con heteroesferoides
<ol><li>Preparar la solución de formación de esferoides para heteroesferoides, que contiene los diferentes tipos de células y los medios correspondientes, como se resume en la Tabla1. Las células habían sido previamente transducidas con lentivirus que contenían vectores para la expresión mCherry o GFP.</li>
	<li>Llenar 100 l de la solución de formación de esferoides en cada pocal de la placa e incubar la placa en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas para permitir que se forme un esferoide en cada poca.</li>
	<li>Preparar 60 ml de mezcla de matriz gelatinosa que contenga 2 mg/ml de colágeno de cola de rata I, 30% de matriz gelificante comercial y 2,5 g/ml de laminina-332 en un tubo de reacción de 1,5 ml. Distribuir rápidamente 15 l en 3 pozos de la cámara de angiogénesis de deslizamiento. Incruste un esferoide en cada pocal que ya contenga el gel.</li>
	<li>Si es necesario, ajuste rápidamente la ubicación del esferoide al centro del pozo con una pipeta bajo el microscopio.</li>
	<li>Repita los pasos 5.2-5.3 para los siguientes heterospheroides y repita de nuevo para los homoesferoides.</li>
	<li>Incubar los geles en la incubadora durante 1 h para solidificar y, a continuación, superponer suavemente los geles con medio de cultivo celular.</li>
	<li>Imagen de los esferoides mediante microscopía de fluorescencia en un microscopio de escaneo láser. Tome diferentes secciones transversales ópticas del esferoide en diferentes planos ópticos de una pila z y en diferentes puntos de tiempo de invasión (por ejemplo, 0 h, 24 h, 48 h y 72 h).</li>
	<li>Analice las imágenes contando el número de células cancerosas invasoras. Las células invasoras son las que han salido del esferoide y han entrado en el área invasora. El área invasora se define como el área del anillo entre los perímetros exterior e interior dados por la célula invadida más leal y por el borde esferoide del esferoide al comienzo de los experimentos de invasión, respectivamente, como se describe en la Figura Suplementaria 2 .</li>
</ol>

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<li>Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses. Este material refleja únicamente las opiniones del autor y la Unión Europea no se hace responsable de ningún uso que pueda hacerse de la información contenida en el mismo.

Desarrollar un modelo in vitro adecuado para estudiar la diferenciación CAF es una tarea difícil. Después de emplear diferentes enfoques, llegamos a la conclusión de que un modelo de esferoides 3D es el modelo más práctico, fisiológico y clínicamente relevante, en el que se puede estudiar la interacción entre células de carcinoma pancreático con CAF inmortalizados. Este modelo previno la diferenciación espontánea de fibroblastos, debido a factores de estrés artefactosfásicos como la rigidez del plástico de cultivo celula...

El microambiente tumoral es un nicho muy complejo y extremadamenteimportante para el mantenimiento y la progresión de las células tumorales 1. Se forma no sólo por las células cancerosas, sino también por los fibroblastos estromales. Las células tumorales están rodeadas por un estroma quees específico y diferente del estroma de los tejidos normales 2. Laminin-332 es una proteína de matriz extracelular expresada ectópicamente en el estroma de diferentes tumores, como el adenocarcinoma pancreático3. Además, la composición bioquímica del ECM y también sus propiedades biofísicas, comola rigidez y la tensión, cambian dentro del tumor a granel 4. Este estroma tumoral, o "estroma reactivo", es causado por una adaptación de fibroblastos a las células cancerosas vecinas y por el reclutamiento de otros actores muy importantes que desarrollan un ambiente favorable y de apoyo para la progresión tumoral. La diferenciación de los fibroblastos estromales da como resultado fibroblastos asociados al cáncer (CAF). Estas células se pueden identificar utilizando diferentes marcadores, como la actina muscular lisa (SMA)5 o el antígeno neural/glial 2 (NG2)6.
Es difícil seleccionar el modelo in vitro más adecuado para recapitular el microambiente tumoral (TME) con CAF. El método para imitar los parámetros fisiológicos del TME de una manera rentable y reproducible debe ser considerado para un sistema modelo de este tipo. Dentro del TME, se producen diferentes procesos, como la proliferación, diferenciación, migración e invasión de los diferentes tipos de células. Estos procesos celulares se pueden realizar individualmente con diferentes métodos. Sin embargo, las condiciones experimentales deben considerar las interacciones celulares con el eCM estroma tumoral, ya que la rigidez del sustrato influye en el proceso de diferenciación CAF. R.G. Wells comentó sobre el impacto de la rigidez de la matriz en el comportamiento celular y destacó que la organización citoesquelética y el estado de diferenciación observados en células cultivadas in vitro podrían ser artefactofactuales7. Diferentes estímulos parecen estar involucrados en la diferenciación CAF, incluyendo la tensión mecánica5,7. Para evitar esto, los sustratos blandos 2D podrían ser posibles enfoques para los estudios de diferenciación, ya que eluden el problema del plástico de la placa de cultivo rígido. Una superficie 2D suave, en la que se pueden cultivar fibroblastos, puede ser geles de poliacrilamida recubiertos de colágeno I, por lo que la rigidez del gel puede ser manipulada por la concentración de poliacrilamida y el retigente de gel. La adhesión y la formación de fibras de tensión ricas enSMA se potencian en fibroblastos junto con la rigidez del gel 8. Estos resultados subrayan la importancia de los andamios de sustrato blando para modelos de diferenciación in vitro más fisiológicas. Sin embargo, en nuestras manos la reproducibilidad experimental y la imagen de estos geles eran un reto. Para superar estas deficiencias, cambiamos el sistema de sustrato suave 2D por un modelo de esferoides 3D para estudios de diferenciación e invasión. Este modelo es más relevante desde el momento clínica y, al igual que un organoide in vitro, recapitulalas interacciones in vivo de células celulares, la producción y deposición de ECM, así como el comportamiento celular 9.
Los esferoides se forman cuando las células carecen de un sustrato al que adherirse. Cuando las células se quedan sin una superficie adhesiva, se agregan para formar una estructura más o menos esférica. Si los esferoides se componen de un tipo de célula, se llaman homoesferoides; si se compone de dos o más tipos de células diferentes que forman heterospheroids.
Entre los diferentes métodos para la preparación de esferoides, realizamos el protocolo utilizando placas de fondo inferior de 96 pocillos no adherentes. Es muy eficaz con respecto a los costes. Aquí, producimos tanto homoesferoides de fibroblastos, CAF o HCA que carecen de la subunidad integrina n.o 3 para examinar el proceso de diferenciación y los heteroesferoides de los CAF o la integrina 3 KO HCA y las células del carcinoma de conductopante (AsPC-I y PANC-I) para estudiar la invasión en la matriz circundante.
El objetivo de estos estudios era utilizar CAF primarios aislados de biopsias de carcinoma pancreático humano. Sin embargo, las biopsias para obtener las células son escasas y por esta razón, los CAC utilizados en estos estudios han sido inmortalizados utilizando lentivirus que contiene HTERT. Se llaman iCIF, y sus homólogos normales, los fibroblastos pancreáticos humanos primarios, se denominan iNF. Los fibroblastos pancreáticos humanos y las células del carcinoma del conducto pancreático, AsPC-I y PANC-I, están disponibles comercialmente.
Este protocolo se utilizó para estudiar el efecto de la interacción laminina-332-integrina en el proceso de diferenciación CAF. Para probar la especificidad de esta interacción y su función, se utilizaron compuestos inhibidores: BM2, un anticuerpo monoclonal que bloquea el sitio de unión de integrina de la cadena laminina-332 x 310,o lebeina 1, un compuesto derivado del veneno de serpiente que bloquea el integrinas de laminina 3o1, 6o1 y 7o111,12.
Para el ensayo de invasión, las células habían sido transducidas con lentivirus que contenían cDNA codificando mCherry (iCIF y integrin a 3 KO iCFÁs) o GFP (AsPC-I y PANC-I) para distinguir los diferentes tipos de células en los heteroesferoides. La transducción de las células para inmortalizarlas y/o etiquetarlas con expresión de proteína fluorescente (mCherry y GFP) se describe en un estudio anterior13,que debe ser consultado para más información.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro (DAPI)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D9542-10</td><td></td></tr><tr><td>6F12 anti-Laminina y beta; 3 subunidades Ratón (monoclonal)</td><td></td><td></td><td>Casero</td></tr><tr><td>A3IIF5 Anti-y alfa; 3 subunidad de integrina Ratón (monoclonal)</td><td></td><td></td><td>Amablemente proporcionado por el Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Fracción V de Albúmina - BSA</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) anti-Ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Cabra (policlonal) Conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Anti-laminina y gamma; 2 subunidades Ratón (monoclonal)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-28330</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Conejo (policlonal) Millipore, AB5320</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-SMA-Cy3 Ratón (monoclonal)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1 línea celular</td><td>ATCC</td><td></td><td>Amablemente dado por el prof. Jörg Haier's Lab</td></tr><tr><td>Centrífuga de banco</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-589-620</td><td>Sprout</td></tr><tr><td>BM2 anti-laminina y alfa; 3 subunidades de ratón (monoclonal)</td><td></td><td></td><td>Amablemente proporcionado por la Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Centrífuga Fluka</td><td>21074</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td>Multifuge 1S-R</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa B</td><td>Roche 11088831001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colágeno-I, cola de rata</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 y 800</td></tr><tr><td>DMEM (Alta glucosa 4,5 g/L)</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>FACSCaliburTM</td></tr><tr><td>Matriz gelificante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1413202</td><td>Matrigel, Geltrex</td></tr><tr><td>Cabra IgG, isotipo</td><td>DAKO</td><td>X 0907</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>12449-C</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos pancreáticos primarios humanos</td><td>PELOBiotech</td><td>PB-H-6201</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Heraeus</td><td>B6060</td><td></td></tr><tr><td>Laminina-332</td><td>Biolamina</td><td>LN332</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, 96 pocillos, fondo en U</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG, isotipo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador giratorio multieje</td><td>CAT</td><td>RM5 80V</td><td></td></tr><tr><td>PANC-I</td><td>ATCC</td><td></td><td>Amablemente dado por el Prof. Jorg </td></tr><tr><td>Paraformaldehído de laboratorio de</td> Haier<td>, Riedel-de Ha&euml; n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Kit de transcripción inversa</td><td>Qiagen</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>IgG para ratas, isotipo</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reacción, 1,5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Ciclantador de PCR en tiempo real</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Rotor-Gene Q</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene SYBR Verde Kit PCR</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Añadir glucosa a 4,5 g (filtro de 0,2 mmm) y piruvato de sodio al 1%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100RS</td><td></td></tr><tr><td>V&oacute; rtex</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>Vortex-Genie 2</td></tr><tr><td>&mu;-Slide Angiogenesis, sin recubrimiento</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de esferoides 3d como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in vitro

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Definir el modelo ideal para un estudio in vitro es esencial, principalmente si se estudian procesos fisiológicos como la diferenciación de células. En el estroma tumoral, los fibroblastos del huésped son estimulados por las células cancerosas para diferenciarse. Por lo tanto, adquieren un fenotipo que contribuye al microambiente tumoral y apoya la progresión tumoral. Mediante el uso del modelo de esferoides, hemos configurado un sistema de modelo 3D in vitro, en el que analizamos el papel de laminina-332 y su receptor integrador n.o 3-1 en este proceso de diferenciación. Este sistema modelo esferoide no sólo reproduce las condiciones tumorales de microambiente de una manera más precisa, sino que también es un modelo muy versátil ya que permite diferentes estudios aguas abajo, como la tinción inmunofluorescente tanto intra- como extracelular marcadores, así como proteínas de matriz extracelular depositadas. Además, los análisis transcripcionales por qPCR, citometría de flujo e invasión celular se pueden estudiar con este modelo. Aquí, describimos un protocolo de un modelo esferoide para evaluar el papel de la integrina de los CAFs n.o 3-1 y su ligando depositado ectopáticamente, laminina-332, en la diferenciación y en el apoyo a la invasión de células cancerosas de páncreas.

Los resultados de este diseño experimental se publican en Martins Cavaco et al.13, que se recomienda para una lectura posterior sobre las conclusiones que se extrajeron de estos experimentos.
Figura 1, una imagen representativa de un esferoide inmunofluorescente, muestra la inmunomancha de la subunidad integrina n.o 3 tanto de los fibroblastos normales inmortalizados como de ...

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

El cultivo de fibroblastos en el recapitular esferoide el tejido tumoral mucho mejor que el sistema 2D comúnmente utilizado en plástico rígido. Permite estudiar la diferenciación de fibroblastos en un ambiente similar a un tumor. En este método, la rigidez del trabajo plástico de cultivo celular no influye artefactos en la diferenciación de fibroblastos.En su lugar, la influencia de la interacción de la matriz celular en la diferenciación inducida por tumores de fibroblastos se puede analizar in vitro. Para comenzar este procedimiento, obtener el medio de cultivo celular, que se complementa con 1%calor inactivado FBS y 1%estreptomicina de penicilina. Además, obtener una solución de seis miligramos por mililitro de metilcelulosa.Mezclar una parte de la metilcelulosa con tres partes del medio de cultivo celular para preparar la solución de formación de esferoides. Resuspender fibroblastos normales inmortalizados recién descongelados u otros tipos de células como se indica en el protocolo de texto en la solución de formación de esferoides. Si se incluyen citoquinas o inhibidores de la integrina en el estudio, añadir estos compuestos a la suspensión celular con el fin de incrustados en

a-3d-spheroid-model-as-more-physiological-system-for-cancer

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

Un Cancer Cell esferoide Ensayo para evaluar la invasión en un entorno 3D

Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.

Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Se establece un novedoso modelo de esferoides tridimensional basado en la interacción heterotípica de células tumorales y fibroblastos estromales. Aquí, presentamos cocultivo de células tumorales y fibroblastos estromales, imágenes de lapso de tiempo y microscopía confocal para visualizar la formación de esferoides. Este modelo tridimensional ofrece una plataforma pertinente para estudiar las interacciones tumor-stroma y probar las terapias contra el cáncer.

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Faltan modelos integrales in vitro que recapitulen fielmente la enfermedad humana relevante. El presente estudio presenta la creación y cultivo de esferoides tumorales tridimensionales (3D), una herramienta in vitro fiable para estudiar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular humano.

Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

Se prepararon esferoides tumorales 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos, seguidos del aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de estos esferoides. Los CAF aislados se compararon con fibroblastos normales para evaluar la salud mitocondrial mediante el estudio del potencial transmembrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y las actividades enzimáticas.

Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D

Presentamos un protocolo para el cultivo de esferoides de alta reproducibilidad y su caracterización fenotípica mediante captura de imágenes y proteómica.

Análisis fenotípico semiautomatizado de cultivos celulares esferoides funcionales en 3D

Existe una necesidad crítica de modelos de cáncer en 3D que capturen la diafonía heterocelular para estudiar la metástasis del cáncer. Nuestro estudio presenta la generación de estromas-epiteliales heteromulticelulares en un entorno de andamios y libres de andamios que pueden ser utilizados para estudiar la invasión y las distribuciones espaciales celulares.

Células estromales heteromulticelulares en cultivos 3D sin andamios de células de cáncer epitelial para impulsar la invasión

Aprende a cultivar esferoides 3D de fibroblastos asociados al cáncer usando metilcelulosa y MEM con suero. Este modelo permite estudiar la diferenciación celular en un entorno tumoral más fisiológico que los cultivos 2D.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro (Video) | JoVE Journal

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

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