Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos
4 de septiembre de 2019
Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.
En este video, demostramos cómo expresar construcciones de ADN exógenos en neuronas ópticas y cómo hacer una imagen de los árboles axonales ópticos individuales que expresan GFP en renacuajos Xenopus laevis intactos y vivos. Se trata de un procedimiento sencillo y barato para la transgénesis transitoria específica de células que permite determinar la función del gen autónomo celular en los árboles axonales ópticos individuales, desarrollándose en un sistema de modelo de vertebrado vivo. Demostrando el procedimiento seremos yo, Sophia Dao, Asistente de Investigación, y la Dra. Tamira Elul, Investigadora Principal de Laboratorio.
Para empezar, recorte suavemente la punta de una pipeta micro capilar de vidrio tirado con fórceps finos. Rellene la pipeta micro capilar de vidrio con aceite mineral utilizando un MICROFIL de tal manera que aparezca una pequeña gota de aceite mineral en la punta recortada de la micro pipeta. Llene la pipeta micro capilar de vidrio a mitad de camino con aceite mineral.
En un inyector, expulse el émbolo hasta la mitad y cargue la pipeta micro capilar de vidrio tirado en el soporte de inyección. A continuación, extienda el émbolo en toda su extensión para confirmar que la pipeta micro capilar está fuertemente unida al inyector y no se mueve con la extensión del émbolo. Transfiera una gota de tres microlitros de la mezcla de ADN/DOTAP a una hoja cuadrada de papel de parafina de una pulgada.
Bajo un microscopio de disección estéreo, mueva la punta de la pipeta micro capilar de vidrio a la gota de ADN/DOTAP. Utilice la opción de llenado en el aparato de inyección, succiona lentamente la gota de ADN/DOTAP en la pipeta micro capilar de vidrio. El límite entre el aceite mineral y la solución DNA/DOTAP es visible en la pipeta micro capilar de vidrio debido a la ligera opacidad de la solución DNA/DOTAP.
Si es necesario, deje de llenar periódicamente la pipeta micro capilar para permitir que se recalibra la presión en la pipeta micro capilar de vidrio. En primer lugar, en un plato Petri de 10 mililitros lleno de MMR 0,1X, des-vitellinize manualmente 10 etapa 20 a 24 embriones Xenopus con fórceps finos. Sujete el sobre de la vitellina en la cintura para evitar dañar los embriones.
Con fórceps en la mano izquierda y derecha del experimentador, haga estallar la burbuja del sobre de la vitellina y libere el embrión del sobre de la vitellina. Tenga cuidado de no lesionar los embriones al extraer el sobre de la vitellina. A continuación, utilice una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada para transferir de cinco a 10 etapas des vitelinizadas 22 a 24 embriones a un plato Petri de 10 mililitros lleno de 1X MMR.
Bajo un microscopio estéreo, agarre uno de los embriones des vilitenizados en la placa Petri con fórceps y organice el embrión de manera que su polo anterior se apunte hacia arriba en el campo de visión. A continuación, orientar el embrión de modo que se acueste lateralmente y uno de sus cogollos del ojo izquierdo a derecho está mirando hacia arriba. Sostenga el embrión con los fórceps en la mano no dominante del experimentador y con la mano dominante del experimentador, introduzca la punta de la micro pipeta de vidrio del lado ventral o dorsal justo debajo de la epidermis en el yema del ojo.
Inyectar entre 70 y 210 nanolitros de la solución DNA/DOTAP. A continuación, gire el embrión y realice la misma microinyección en el otro brote del ojo en el lado contralateral del embrión. Inyectar ambos cogollos de seis a 10 embriones en cada experimento.
Después de la microinyección, almacene los embriones en un plato de Petri con 1X MMR durante aproximadamente 30 minutos para facilitar la cicatrización de la herida. Después de 30 minutos, transfiera los embriones inyectados con una pipeta de transferencia de plástico a una solución DE MMR 0.1X con 0.001%agente blanqueador feniltiocarbamida para reducir la pigmentación. Cubra el plato de Petri con una tapa para cultivar los embriones durante aproximadamente cinco días hasta que los embriones se hayan convertido en renacuajos en las etapas 46 a 47.
Este protocolo produce una tasa de éxito de 30 a 60% de los embriones Xenopus inyectados que expresan GFP en uno a 10 árboles axonales ópticos. Las imágenes confocales representativas de GFP muestran el control expreso y los árboles axonales ópticos mutantes en los renacuajos Xenopus intactos. Dos mutantes de dominio de APC, APCNTERM y APBbeta-cat fueron clonados en plásmidos pCS2.
Se reconstruyeron imágenes de la serie Z de control GFP y árboles axonales ópticos mutantes APC. Las gráficas del número de ramas, la longitud total de la rama del árbol y la longitud media de la rama confirman las diferencias observadas entre el control y el mutante APC que expresa los árboles axonales. Las gráficas de dispersión adicionales del número de ramas frente a la longitud media de la rama con las líneas de regresión muestran la correlación inversa entre estos parámetros y los arboresales axonales ópticos que expresan los dominios APC.
La punta de la pipeta micro capilar debe insertarse correctamente muy superficialmente en el capullo del ojo para que la epidermis gris que sobresalía del yema del ojo se hinche durante cada micro inyección. Este procedimiento se puede utilizar para etiquetar y alterar la función genética específica en las neuronas ópticas mientras se evalúa el crecimiento, la focalización y la ramificación de los axones de estas neuronas ópticas. Esta técnica de microinyección y lipofección del ADN ha permitido a los investigadores de la neurobiología del desarrollo estudiar mecanismos moleculares autónomos celulares que regulan la arborización óptica de axón en renacuajos Xenopus laevis intactos y vivos.
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Descripción general
Este protocolo demuestra la microinyección de una mezcla de ADN/DOTAP en los primordios oculares de embriones de Xenopus laevis de un día de edad y la obtención de imágenes de arborizaciones axónicas ópticas que expresan GFP en renacuajos vivos. Este método permite el estudio de la función génica en un modelo de vertebrado.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Transgénesis
Antecedentes
- Xenopus laevis es un organismo modelo ampliamente utilizado en biología del desarrollo.
- La transgénesis transitoria específica de células permite el estudio de la función génica en tipos celulares específicos.
- La GFP permite la visualización de estructuras neuronales en especímenes vivos.
- Esta técnica es rentable y sencilla.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método para expresar ADN exógeno en neuronas ópticas.
- Visualizar arborizaciones axónicas ópticas individuales en renacuajos vivos.
- Facilitar el estudio de la función génica autónoma celular.
Métodos Utilizados
- Microinyección de la mezcla de ADN/DOTAP en los brotes oculares embrionarios.
- Uso de pipetas de microcapilar de vidrio para la inyección.
- Imagen de neuronas que expresan GFP en renacuajos vivos.
- Reconstrucción de los arborescencias axónicas ópticas en el mesencéfalo tectal.
Resultados principales
- Expresión exitosa de GFP en neuronas ópticas.
- Visualización de arborizaciones axónicas individuales en especímenes vivos.
- Demuestra la eficacia del procedimiento para estudiar la función génica.
- Establecimiento de un método confiable para la transgénesis transitoria en Xenopus laevis.
Conclusiones
- Este protocolo proporciona una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia.
- Mejora la comprensión de la función génica en modelos vertebrados en desarrollo.
- El método es accesible y reproducible para los investigadores.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La microinyección directa de ADN en los primordios oculares de Xenopus laevis permite una manipulación genética precisa y específica a nivel celular, así como la obtención de imágenes en vivo de la arborización axonal óptica. Este enfoque proporciona una plataforma robusta para desentrañar los mecanismos moleculares autónomos celulares que subyacen a la conectividad neuronal, apoyando la validación temprana de objetivos y la reducción del riesgo mecanicista en la investigación del desarrollo neurológico. Los resultados cuantitativos y la reproducibilidad del método aumentan la confianza predictiva en la selección de carteras y la continuidad traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la función génica en neuronas ópticas individuales dentro de un sistema vertebrado vivo.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante el aislamiento de efectos autónomos celulares sobre la ramificación y proyección axonal.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante la visualización directa y cuantificación de la morfología neuronal.
- Proporciona confianza predictiva para avanzar objetivos de neurodesarrollo en la fase de descubrimiento.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara sistemas biológicos vivos validados para flujos de trabajo de análisis cuantitativo e imágenes posteriores.
- Proporciona resultados reproducibles y cuantificables, como el número de ramas y la longitud del arbor, para estudios comparativos.
- Permite la estandarización y escalabilidad de ensayos para evaluar construcciones genéticas o moduladores de vías.
- Apoya el cribado confiable de la función génica y de los resultados fenotípicos en un contexto vertebrado.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la enfermedad en el estudio de la conectividad neuronal y el desarrollo sináptico.
- Proporciona continuidad desde descubrimientos mecanicistas hasta la validación preclínica de dianas en neurodesarrollo.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en lecturas funcionales in vivo.
- Facilita la identificación de biomarcadores traslacionales mediante imágenes en vivo de la arquitectura neuronal.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir estudios hipotéticos sobre la función génica, fenotipificación cuantitativa e imágenes en vivo en un modelo vertebrado.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en el desarrollo neuronal.
- Selección: Proporciona sistemas listos para ensayos y reproducibles para evaluar intervenciones genéticas o farmacológicas.
- Análisis: Genera datos morfológicos cuantitativos para la comparación estadística de condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento mecanicista con la validación preclínica en sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para diversos estudios de función génica y conectividad en programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuronales.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, escalables y reproducibles para la manipulación genética y el análisis por imágenes.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción del proyecto y la eficiencia del capital al proporcionar datos sólidos in vivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de objetivos relacionados con el desarrollo neurológico.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microinyección, imagenología en vivo y análisis morfológico cuantitativo.
- Necesita acceso a un equipo de microinyección, microscopía confocal y software de análisis de imágenes.
- Exige estandarización entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede ser necesario adaptarlo a otros sistemas modelo o subtipos neuronales.
- Las tasas de éxito y el rendimiento están influenciadas por la destreza técnica y el manejo de embriones.
