Name: Tono Basal Biaxial y Pruebas Pasivas del Sistema Reproductivo Murino Usando un Miógrafo de Presión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprende a realizar pruebas biaxiales de tono basal y pasivo en el sistema reproductivo murino usando un miógrafo de presión. Este método preserva la geometría del órgano para evaluar propiedades mecánicas.

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La obra fue financiada por la concesión de la beca NSF CAREER #1751050.

El protocolo proporcionado en este artículo presenta un método para determinar las propiedades mecánicas de la vagina murina y el cuello uterino. Las propiedades mecánicas analizadas en este protocolo incluyen las condiciones de tono pasivo y basal de los órganos. Las condiciones de tono pasivo y basal se inducen alterando el entorno bioquímico en el que el órgano está sumergido. Para este protocolo, los medios involucrados en las pruebas basales contienen calcio. La prueba de la condición del tono basal permite el aisla...

La pared vaginal se compone de cuatro capas, el epitelio, lamina propria, muscularis, y adventitia. El epitelio se compone principalmente de células epiteliales. La lámina propria tiene una gran cantidad de fibras elásticas y fibrilares de colágeno. El muscularis también se compone de fibras de elastina y colágeno, pero tiene una mayor cantidad de células musculares lisas. La adventitia se compone de elastina, colágeno y fibroblastos, aunque en concentraciones reducidas en comparación con las capas anteriores. Las células musculares lisas son de interés para los grupos de investigación biomecánicos motivados, ya que juegan un papel en la naturaleza contráctea de los órganos. Como tal, cuantificar la fracción de área muscular lisa y la organización es clave para entender la función mecánica. Investigaciones anteriores sugieren que el contenido muscular liso dentro de la pared vaginal está organizado principalmente en el eje circunferencial y longitudinal. El análisis histológico sugiere que la fracción de área muscular lisa es aproximadamente 35% para las secciones proximal y distal de la pared1.
El cuello uterino es una estructura altamente colágeno, que hasta hacepoco, se pensaba que tenía un contenido mínimo de células musculares lisas 2,3. Estudios recientes, sin embargo, han sugerido que las células musculares lisas pueden tener una mayor abundancia y papel en el cuello uterino4,5. El cuello uterino presenta un gradiente de células musculares lisas. El os interno contiene 50-60% células musculares lisas donde el os externo sólo contiene 10%. Estudios de ratón, sin embargo, reportan que el cuello uterino está compuesto de 10-15% células musculares lisas y 85-90% tejido conectivo fibroso sin mención de diferencias regionales6,7,8. Dado que el modelo de ratón difiere del modelo humano frecuentemente reportado, se necesitan más investigaciones sobre el cuello uterino del ratón.
El propósito de este protocolo era dilucidar las propiedades mecánicas de la vagina murina y el cuello uterino. Esto se logró mediante el uso de un dispositivo miógrafo de presión que permite la evaluación de las propiedades mecánicas en las direcciones circunferenciales y axiales simultáneamente, manteniendo las interacciones célula-matriz nativas y la geometría de órganos. Los órganos se montaron en dos cánulas personalizadas y se aseguraron con suturas de seda 6-0. Se realizaron pruebas de diámetro de presión alrededor del estiramientoaxial fisiológico estimado para determinar el cumplimiento y el mínimo tangente 9. Se realizaron pruebas de longitud de fuerza para confirmar el estiramiento axial estimado y para asegurar que las propiedades mecánicas se cuantificaran en el rango fisiológico. El protocolo experimental se realizó en la vagina murina no embarazada y el cuello uterino a los 4-6 meses de edad en estrus.
El protocolo se divide en dos secciones principales de pruebas mecánicas: tono basal y pruebas pasivas. Un tono basal se define como la constricción parcial basal de las células musculares lisas, incluso en ausencias de estimulación local, hormonal y neuronal externa10. Esta naturaleza contráctea basal de la vagina y el cuello uterino produce comportamientos mecánicos característicos que luego se miden por el sistema miógrafo de presión. Las propiedades pasivas se evalúan mediante la eliminación del calcio intercelular que mantiene el estado basal de contracción, lo que resulta en la relajación de las células musculares lisas. En el estado pasivo, las fibras de colágeno y elastina proporcionan las contribuciones dominantes para las características mecánicas de los órganos.
El modelo murino se utiliza ampliamente para estudiar patologías en la salud reproductiva de las mujeres. El ratón ofrece varias ventajas para cuantificar las relaciones en evolución entre eCM y las propiedades mecánicas dentro del sistema reproductivo11,12,13,14. Estas ventajas incluyen ciclos estrosos cortos y bien caracterizados, costo relativamente bajo, facilidad de manejo, y un tiempo gestacional relativamente corto15. Además, el genoma de los ratones de laboratorio es bien mapeado y los ratones modificados genéticamente son herramientas valiosas para probar hipótesis mecanicistas16,17,18.
Los sistemas de miógrafo a presión disponibles comercialmente se utilizan ampliamente para cuantificar las respuestas mecánicas de diversos tejidos y órganos. Algunas estructuras notables analizadas en el sistema de miógrafo de presión incluyen arterias elásticas19,20,21,22, venas e injertos vasculares de ingeniería de tejido23,24, el esófago25,y los intestinos gruesos26. La tecnología de miógrafo de presión permite la evaluación simultánea de las propiedades en las direcciones axial y circunferencial, manteniendo las interacciones celulares nativas y la geometría in vivo. A pesar del uso extensivo de sistemas de miógrafo en la mecánica de tejidos blandos y órganos, no se había desarrollado previamente un protocolo que utilizaba la tecnología de miógrafo de presión para la vagina y el cuello uterino. Se evaluaron las investigaciones previas sobre las propiedades mecánicas de la vagina y el cuello uterino uniaxialmente27,28. Estos órganos, sin embargo, experimentan carga multiaxial dentro del cuerpo29,30, por lo tanto cuantificar su respuesta mecánica biaxial es importante.
Por otra parte, trabajos recientes sugieren células musculares lisas pueden desempeñar un papel potencial en patologías de tejidos blandos5,28,31,32. Esto proporciona otra atracción de la utilización de la tecnología de miógrafo de presión, ya que preserva las interacciones célula-matriz nativas, permitiendo así la delineación de la contribución que las células musculares lisas juegan en fisiológica y fisiopatológica Condiciones. Aquí, proponemos un protocolo para cuantificar las propiedades mecánicas multiaxiales de la vagina y el cuello uterino tanto en el tono basal como en las condiciones pasivas.

<table><tbody><tr><td>Catéter 2F</td><td>Millar</td><td>SPR-320</td><td>catéter para medir la presión cervical</td></tr><tr><td>6-0 Sutura</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td>lazos de sutura más grandes</td></tr><tr><td>CaCl2 (anhidro)</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td>Concentración de HBSS: 140 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl2-2H20</td><td>Fischer químico</td><td>BDH9224-1KG</td><<td>br/> Concentración de KRB: 3,68 g/L</td></tr><tr><td>Dextrosa (D-glucosa))</td><td>VWR</td><td>101172-434 Concentración de</td><td>HBSS: 1000 mg/mL Concentración de KRB: 19,8 g/L</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5/45 Pinzas</td><td>de ciencia fina</td><td>11251-35</td><td>pinza curva</td></tr><tr><td>Dumont SS Pinzas</td> de ciencia <td>fina</td><td>11203-25</td><td>Pinza recta</td></tr><tr><td>Eclipse</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td>Microscopio utilizado para la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Caudalímetro</td><td>Danés MyoTechnologies</td><td>Caudalímetro 161FM</td><td>dentro del aparato de ensayo</td></tr><tr><td>Transductor de fuerza - 110P</td><td></td><td>Transductor de fuerza</td><td>100079 danés MyoTechnologies</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>SciJava</td><td>ImageJ1</td><td>utilizado para medir el volumen</td></tr><tr><td>Cajas de instrumentos</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td>carcasa para sujetar herramientas de disección</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>97061-566</td><td>Concentración de HBSS: 400 mg/ mL Concentración de KRB: 3,5 g/L</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>G-Biosciences</td><td>71003-454</td><td>Concentración de HBSS: 60 mg/mL</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97064-150</td><td> Concentración de KRB: 1,14 g/L</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td>VWR</td><td>BDH9244-500G</td><td>Concentración de HBSS: 100 mg/ mL</td></tr><tr><td>MgSO4-7H20</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>Concentración de HBSS: 48 mg/mL</td></tr><tr>Programa de <td>6278402</td><td>de Microsoft</td> <td>de Excel Mircosoft</td><td>utilizado para la hoja de cálculo</td></tr><tr><td>Na2HPO4 (anhidro dibásico)</td><td>VWR</td><td>97061-588</td><td>Concentración de HBSS: 48 mg/mL Concentración de KRB: 1,44 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td>Concentración de HBSS: 8000 mg/mL Concentración de KRB: 70,1 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>97062-460</td><td>Concentración de HBSS: 350 mg/ mL Concentración de KRB: 21.0 g/L</td></tr><tr><td>Sistemas de miógrafos</td><td>de presión Danish MyoTechnologies</td><td>110P y 120CP</td><td>Sistema de miógrafo de presión: programa , dispositivo de canulación y unidad de control</td></tr><tr><td>Transductor de presión</td><td>Danish Myo</td><td>100106</td> Technologies <td>Transductor de presión</td></tr><tr><td>Estudiante Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>pinzas rectas</td></tr><tr><td>Student Vannas Tijeras de resorte Fine</td><td>Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Microtijeras</td></tr><tr><td>Tinte para tejidos</td><td>Productos Bradley</td><td>1101-3</td><td>tinta para medir el estiramiento in vivo</td></tr><tr><td>Transductor de ultrasonido</td><td>FujiFilm Visual Sonics</td><td>LZ-550</td><td>transductor de ultrasonido utilizado; 256 elementos, frecuencia central de 40 MHz</td></tr><tr><td>VEVO2100</td><td>FujiFilm Visual Sonics</td><td>VS-20035</td><td>ultrasonido utilizado para la obtención</td></tr><tr><td>de imágenes Wagner Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14069-12</td><td>tijeras más grandes</td></tr></tbody></table>

tono basal biaxial y pruebas pasivas del sistema reproductivo murino usando un miógrafo de presión

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

Los órganos reproductores femeninos, específicamente la vagina y el cuello uterino, se componen de varios componentes celulares y una matriz extracelular única (ECM). Las células musculares lisas exhiben una función contráctea dentro de las paredes vaginales y cervicales. Dependiendo del entorno bioquímico y la distensión mecánica de las paredes del órgano, las células musculares lisas alteran las condiciones contráctas. La contribución de las células musculares lisas en condiciones fisiológicas basales se clasifica como un tono basal. Más específicamente, un tono basal es la constricción parcial basal de las células musculares lisas en ausencia de estimulación hormonal y neuronal. Además, el ECM proporciona soporte estructural para las paredes de los órganos y funciona como un reservorio para señales bioquímicas. Estas señales bioquímicas son vitales para varias funciones del órgano, como incitar al crecimiento y mantener la homeostasis. El ECM de cada órgano se compone principalmente de fibras de colágeno (principalmente tipos de colágeno I, III y V), fibras elásticas y glicosaminoglicanos/proteoglicanos. La composición y organización del ECM dicta las propiedades mecánicas de cada órgano. Un cambio en la composición de la ECM puede conducir al desarrollo de patologías reproductivas, como el prolapso de órganos pélvicos o la remodelación cervical prematura. Además, los cambios en la microestructura y rigidez de ECM pueden alterar la actividad celular muscular lisa y el fenotipo, lo que resulta en la pérdida de la fuerza contráctea.
En este trabajo, los protocolos reportados se utilizan para evaluar el tono basal y las propiedades mecánicas pasivas de la vagina de la murina no embarazada y el cuello uterino a los 4-6 meses de edad en estrus. Los órganos se montaron en un miógrafo de presión disponible comercialmente y se realizaron pruebas de diámetro de presión y de longitud de fuerza. Se incluyen datos de muestra sin muestras y técnicas de análisis de datos para la caracterización mecánica de los órganos reproductivos. Dicha información puede ser útil para construir modelos matemáticos y diseñar racionalmente intervenciones terapéuticas para las patologías de salud de las mujeres.

El análisis exitoso de las propiedades mecánicas de los órganos reproductores femeninos está supeditado a la disección adecuada de órganos, la cannulación y las pruebas. Es imperativo explantar los cuernos uterinos a la vagina sin defectos (Figura1). Dependiendo del tipo de órgano, el tamaño de la cánula variará (Figura 2). La cannulación debe hacerse para que el órgano no pueda moverse durante el experimento, pero tampoco dañar la pared del órgano durante el procedimien...

Este protocolo utilizó un sistema de miógrafo de presión disponible comercialmente para realizar pruebas de miógrafo de presión en la vagina murina y el cuello uterino. Utilizando medios con y sin calcio, las contribuciones del tono basal de las células musculares lisas (SMC) y la matriz extracelular pasiva (ECM) se aislaron para los órganos en condiciones fisiológicas estimadas.

Tono Basal Biaxial y Pruebas Pasivas del Sistema Reproductivo Murino Usando un Miógrafo de Presión

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). ...

Este protocolo investiga las propiedades mecánicas biaxiales de los órganos reproductivos que aclaran la contribución de las células musculares lisas y la matriz pasiva. Esta técnica mantiene la geometría del órgano y las interacciones nativas de la célula muscular lisa a la matriz permitiendo la sujeción del órgano a un rango fisiológico de presiones y extensiones axiales. La investigación de la función biaxial del órgano bajo cargas fisiológicamente relevantes puede ayudar a comprender mejor la etiología de las patologías reproductivas.Las pruebas biaxiales del cuello uterino y la vagina proporcionan información sobre los campos de la salud de las mujeres y la biomecánica. Métodos similares se utilizan para estudiar los vasos sanguíneos, el esófago y el intestino grueso. Cuando se trabaja con un nuevo órgano, puede tomar tiempo para finalizar los detalles técnicos tales como cómo suturar mejor el tejido o cómo determinar la longitud descargada.Para recoger el sistema reproductivo del animal experimental, coloque el ratón sobre una almohadilla absorbente bajo un microscopio diseccionante y utilice pinzas y tijeras en ángulo para levantar la piel alrededor del abdomen. Haga una incisión inicial en la base del abdomen por encima del hueso púbico lo suficientemente superficial como para no perforar la pared muscular abdominal y continuar la incisión superiormente hacia la caja torácica y profundamente a través de los músculos abdominales. Después de eliminar la grasa superficial y cortar cuidadosamente la sínfisis púbica, utilice pinzas rectas para agarrar la vejiga para crear tensión y utilizar la disección contundente para separar el tejido circundante de la vagina.Luego corte la base del sistema reproductivo para eliminar los tejidos de la cavidad corporal. Después de determinar la cánula de tamaño adecuado para el sistema cosechado, monte el lado cervical en la porción del transductor de fuerza del dispositivo de canulación y monte el extremo opuesto del órgano en la porción del micrómetro del dispositivo. A continuación, apriete ambos extremos con suturas.Para encontrar la longitud descargada del tejido montado, primero estire el órgano para que la pared no esté en tensión. Para la vagina, observe los surcos en la pared vaginal. Para el cuello uterino, corte inmediatamente debajo de los puntos de tinta situados por encima y por debajo de la marca central del cuello uterino.Utilice pinzas para medir la longitud del sistema desde la sutura hasta la sutura y aumentar la presión del sistema de miografía de cero a 10 milímetros de mercurio en un milímetro de incrementos de mercurio. La presión en la que el órgano ya no está colapsado se puede determinar como el salto más grande en el diámetro exterior a una presión dada. Después de registrar la presión y el diámetro exterior, observe estos datos como el primer punto en el que el órgano no se contrae y cero la fuerza.Para encontrar el estiramiento in vivo experimental, ajuste el órgano a la longitud in vivo estimada mientras que a la presión descargada y haga clic en comenzar para evaluar los valores de presión frente a fuerza para los valores de presión que van desde la presión descargada hasta la presión máxima. A continuación, haga clic en detener y guarde el archivo. Para el preacondicionamiento del diámetro de presión, ajuste la presión a cero milímetros de mercurio, la longitud a la longitud in vivo experimental y el gradiente a 1,5 milímetros de mercurio por segundo.Ejecute una secuencia que lleve la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima más la presión descargada, mantenga durante 30 segundos y vuelva a cero milímetros de mercurio con un período de retención adicional de 30 segundos. Después de repetir esta secuencia para un total de cinco ciclos, haga clic en Detener y guarde el archivo. Para el preacondicionamiento de la longitud de fuerza, introduzca 1/3 de la presión máxima más la presión descargada para las presiones de entrada y salida y ajuste el órgano a menos 2% de la longitud in vivo.Haga clic en Inicio y ajuste la longitud a más 2% de longitud in vivo y vuelva a menos 2% a una velocidad de 10 micrómetros por segundo. Repita la extensión axial para un total de cinco ciclos antes de hacer clic en Detener y guardar el archivo. Para las pruebas de diámetro de presión de la longitud in vivo, haga clic en iniciar y ajustar el órgano a la longitud in vivo, establezca la presión en cero milímetros de mercurio y establezca el gradiente en 1,5 milímetros de mercurio por segundo.Aumente la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima antes de reducir la presión a cero milímetros de mercurio con un período de retención de 20 segundos. A continuación, repita la prueba durante cinco ciclos antes de detener el sistema y guardar los datos. Para la prueba de longitud de fuerza de 1/3 de la presión máxima más la presión descargada, ajuste la presión a 1/3 de la presión máxima más la presión descargada y ajuste el órgano a menos 2% de la longitud in vivo.Después de hacer clic en inicio, estire el órgano a más 2% de la longitud in vivo y de nuevo a menos 2% de la longitud in vivo a una velocidad de 10 micrómetros por segundo. A continuación, repita la prueba para un total de tres ciclos antes de detener el sistema y guardar los datos. Después de la última prueba, retire el medio de prueba KRB y lave el órgano con un medio KRB libre de calcio.Después del lavado, incubar el órgano con una solución KRB fresca sin calcio complementada con dos EGTA milimétricas durante 30 minutos antes de sustituir la solución de tratamiento por KRB fresco libre de calcio. Al finalizar la prueba de tono basal, para el preacondicionamiento del diámetro de presión, haga clic en iniciar y establezca la presión en cero milímetros de mercurio, la longitud como la longitud in vivo estimada y el gradiente a 1,5 milímetros de mercurio por segundo. Comience a ejecutar una secuencia que lleve la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima y de vuelta a cero milímetros de mercurio.Repita este proceso a través de cinco ciclos con un tiempo de espera de 30 segundos. Para el preacondicionamiento de la longitud de fuerza, ajuste el órgano a la longitud in vivo e introduzca manualmente la presión descargada para ambas presiones. Haga clic en Inicio y establezca el gradiente en 1,5 milímetros de mercurio y la presión en 1/3 del máximo.Estirar el órgano hasta más 2% y volver a menos 2% estirar a 10 micrómetros por segundo y repetir el ciclo para un total de cinco veces. Para las pruebas de diámetro de presión, con el órgano en menos 2% de la longitud in vivo determinada experimentalmente y la presión a cero milímetros de mercurio, haga clic en iniciar y aumentar la presión de cero milímetros de mercurio a la presión máxima y de vuelta a cero milímetros de mercurio. Mantenga los cero milímetros del paso de mercurio durante 20 segundos y repita el ciclo cinco veces.Para las pruebas de longitud de fuerza, ajuste la presión a una presión nominal y ajuste el órgano a menos 2% de la longitud in vivo. Estirar el órgano hasta más el 2% de la longitud in vivo y volver a menos 2% de la longitud in vivo a una velocidad de 10 micrómetros por segundo. Después de un total de tres ciclos, guarde los datos y repita la prueba de longitud de fuerza para 1/3 de la presión máxima, 2/3 de la presión máxima y a la presión máxima.Para un análisis exitoso de las propiedades mecánicas de los órganos reproductivos femeninos, es imperativo explanar los cuernos uterinos a la vagina sin ningún defecto. Dependiendo del tipo de órgano, el tamaño de la cánula variará. La cannulación debe realizarse para que el órgano no pueda moverse durante el experimento, pero sin dañar la pared del órgano durante el procedimiento.El sistema de miógrafo de presión se puede utilizar para monitorear varios aspectos del órgano, ya que se somete a pruebas mecánicas y el sistema de ultrasonido se puede utilizar para medir el grosor de los órganos en estado descargado con y sin tono basal. Después de las pruebas mecánicas, los módulos tangentes pueden calcularse para las direcciones circunferenciales y axiales. Tanto las pruebas de tono basal como las pruebas pasivas producen propiedades mecánicas clave del tracto reproductivo con y sin la contribución contráctil de las células musculares lisas.La escala entre los órganos requiere algunos ajustes en los protocolos, ya que el cuello uterino y la vagina experimentan diferentes cargas in vivo. Es clave realizar la disección rápidamente para mantener la viabilidad de las células musculares lisas, pero cuidadosamente no perforar el órgano deseado. Los experimentos de ángulo de apertura que miden la tensión residual del órgano se pueden realizar después de los procedimientos de prueba mecánica, así como varios ensayos histológicos y bioquímicos.Después de su desarrollo e investigación de la contribución basal de la célula muscular lisa, esta técnica también permite evaluar la máxima respuesta contráctil del músculo reproductivo bajo cargas fisiológicamente relevantes.

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