Name: Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprenda a medir ritmos diurnos en flujo autofágico y proteasomal en hígado de ratón mediante inyecciones intraperitoneales de inhibidores de proteasas y análisis de western blot. Este método sensible permite evaluar el catabolismo proteico in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue financiado por RO1HL135846 y una beca del Instituto de Desarrollo Infantil (PD-II-2016-529).

El protocolo descrito aquí fue aprobado por la Universidad de Washington en st. Louis Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Carcasa de ratón y diseño experimental
<ol><li>Para detectar ritmos diarios en la rotación de proteínas, ratones domésticos (masculino o femenino C57BL/6J, de 4 a 8 semanas de edad, 20 a 25 g) bajo ciclos estándar de 12 h de luz/oscuridad con alimentos proporcionados ad libitum. Para evitar estresar a los animales, aclimate ratones durante al menos una semana en la instalación antes de usar y evite una sola vivienda. Para demostrar que los ritmos en el catabolismo proteico son verdaderamente circadianos (es decir, impulsados por el reloj biológico interno del animal), los ratones domésticos en condiciones constantes y oscuras, teniendo cuidado de evitar exponer a los ratones a la luz exógena. NOTA: Para obtener más información sobre la carcasa del ratón para experimentos de ritmo circadiano, consulte la siguiente referencia11.</li>
	<li>Para cada punto de tiempo, asigne tres ratones como controles falsos y al menos tres ratones para cada tipo de inhibidor de la proteasa utilizado (leupeptina para flujo autofágico y bortezomib para mediciones de flujo proteasomal). Planifique seis puntos de tiempo espaciados uniformemente a intervalos de 4 h a lo largo del ciclo día/noche para obtener muestras de tejido. NOTA: Un experimento de 24 h y 6 puntos de tiempo con solución salina con fosfato (PBS), leupeptina y bortezomib requerirá un total de 54 ratones (3 por tratamiento x 3 tratamientos x 6 puntos de tiempo).</li>
</ol>2. Preparación de la solución de homogeneización, soluciones de stock de inhibidores y viales para la recolección de hígados de ratón
<ol><li>Preparar el tampón de homogeneización fresco (HB) y mantener en hielo: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM sacarosa, 5 mM EDTA pH 8.0, y 1 comprimido inhibidor de proteasa por 100 mL. NOTA: Se necesitan aproximadamente 10 ml de HB por ratón.</li>
	<li>Para el procesamiento aguas abajo de muestras biológicas, cada muestra requiere un tubo cónico de 15 ml para sostener el homogeneato crudo, un tubo de 15 ml para sostener el sobrenadante post-nuclear, dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para sostener los 3.000 x g y 20.000 x g de peletización material, respectivamente, y un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para sostener la fracción citoplasmática. Añadir 7 ml de HB frío a cada tubo destinado a homogeneizar crudo y mantener en hielo.</li>
	<li>Preparar una solución de 2 mg/ml de hemisulfato de leupeptina en PBS estéril. También preparar una solución de 50 mg/ml de bortezomib en dimetil sulfóxido (DMSO). Aliquot y almacenar las soluciones a -80 oC.</li>
</ol>3. Administración de inhibidores de la proteasa
<ol><li>Descongelar las soluciones de stock de leupeptina (2 mg/ml) y bortezomib (50 mg/ml) a temperatura ambiente 15 minutos antes de cada punto de tiempo. El caldo de leupeptina está listo para la inyección. Diluir el bortezomib en PBS estéril para producir una solución de trabajo de 50 g/ml. NOTA: Bortezomib es sensible a la luz, así que proteja el material de trabajo de la luz hasta su uso.</li>
	<li>Pesar ratones y realizar inyecciones intraperitoneales de PBS "sham" (0,5 ml), leupeptina (40 mg/kg) o bortezomib (1,6 g/kg). Devolver los ratones a jaulas debidamente marcadas agrupadas por el tipo de inyección que recibieron. Registre la hora en que los ratones son tratados o manipulados en una tabla estandarizada (consulte Archivo suplementario " Datosde muestra"). NOTA: Una calculadora de dosis se incluye como una ayuda en el archivo suplementario "Datosde muestra" . Es importante realizar inyecciones rápidamente y en el mismo orden desde el punto de tiempo hasta el punto de tiempo para minimizar la variabilidad.</li>
</ol>4. Adquisición y almacenamiento de tejidos
<ol><li>Dos horas después de la inyección, eutanasia a los ratones de uno en uno de acuerdo con el protocolo IACUC aprobado institucionalmente. Por ejemplo, los ratones anestetizan luego etanizan por dislocación cervical. Continúe con el paso de disección inmediatamente después de la eutanasia. NOTA: Asegurar la anestesia completa antes de la luxación cervical pellizcando las patas delanteras sin un reflejo observable.</li>
	<li>Retire el lóbulo izquierdo del hígado haciendo una incisión de 1,5 a 2,0 cm con tijeras Metzenbaum en el abdomen ventral del ratón. Externalizar el lóbulo izquierdo del hígado e extirparlo con tijeras quirúrgicas. Sumerja la muestra hepática en 7 ml de HB helada en un tubo cónico de 15 ml debidamente etiquetado. Mantenga la muestra en hielo durante todo el procesamiento. NOTA: Las muestras se pueden mantener en hielo o a 4 oC durante la noche antes de proceder. Si los marcadores estándar de macroautofagia y actividad proteasomal son las únicas lecturas previstas, las muestras de hígado pueden congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 oC para su posterior procesamiento. Para examinar otros objetivos de degradación (por ejemplo, a través de proteómica), procese las muestras sin congelarlas.</li>
	<li>Proceda a eutanasiay y diseccione el ratón siguiente hasta que se adquieran todas las muestras. Procesar ratones en el mismo orden de grupo que se inyectaron y registrar la duración de este paso (consulte Archivo suplementario "Datos de muestra"). Cada ratón debe procesarse en menos de 5 minutos para limitar la diferencia en los tiempos de exposición de los inhibidores inyectados.</li>
</ol>5. Fraccionamiento bioquímico de muestras de hígado
NOTA: La Figura 1B muestra el esquema de fraccionamiento.
<ol><li>Transfiera cada muestra de hígado y 7 ml de HB a un homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidad. Homogeneizar la muestra con 10 golpes del pistón suelto y 15 golpes del pistón apretado. Devolver el homogeneizador crudo resultante al tubo cónico de 15 ml del que se originó. Repita hasta que todas las muestras de hígado hayan sido homogeneizadas.</li>
	<li>Espíre muestras de homogeneización bruta a 700 x g durante 10 min a 4 oC a núcleos de pellets y escombros. Transfiera los 4 ml superiores del sobrenadante postnuclear (S1) a un tubo cónico fresco de 15 ml.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteína de la fracción S1 utilizando ensayos de Bradford o ácido bicinchínico (BCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, igualar las concentraciones de todas las muestras a 2,1 mg/ml o a la concentración deseada añadiendo HB fresco a S1 cuando sea necesario. Las muestras normalizadas son la fracción "Proteína total" (Tot). Para fines analíticos posteriores y mejora de la calidad, alícuota 500 l de la fracción Tot y almacenar a -80 oC.</li>
	<li>Transfiera 1,5 ml de la fracción Tot restante a un tubo de microcentrífuga y gire a 3.000 x g durante 15 min a 4 oC. Transfiera 1 ml del sobrenadante resultante (S2) a un tubo de microcentrífuga fresco y poner sobre hielo.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante restante y lavar el pellet de 3.000 x g (3KP) dos veces con 1,5 ml de HB fría. El pellet de 3KP se puede almacenar seco a -80 oC si se prevé una proteómica aguas abajo. Si sólo se prevé la hincha occidental, resuspenda el pellet de 3KP en 200 ml de electroforesis de gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de 3KP en 200 ml de dodecyl sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) tampón de muestra(Tabla de materiales)y hierva a 95 oC durante 5 min.</li>
	<li>Gire la fracción S2 a 20.000 x g durante 20 min a 4 oC. Transfiera el sobrenadante resultante (S3) a un tubo de microcentrífuga fresco. S3 es la fracción citoplasmática (Cyto). Para SDS-PAGE, combine 150 éL de fracción de Cito con 50 ml de tampón de muestra De 4 x SDS-PAGE y hierva a 95 oC durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante restante del pellet de 20.000 x g (20KP) y lavar dos veces con 1,5 ml de HB fría. El pellet de 20KP se puede almacenar seco a -80 oC si se prevé una proteómica aguas abajo. Si sólo se prevé la hincha occidental, resuspenda el pellet de 20KP en 100 ml de tampón de muestra SDS-PAGE y hierva a 95 oC durante 5 min.</li>
</ol>6. Lectura de Western Blotting
<ol><li>Con el fin de cuantificar el flujo macroautofágico y proteasomal a través de la hincha occidental, componer una solución en stock de GST-LC3b purificado (2 g/mL), p62-Su6 (2 g/ml) y Lys48 poliubiquitina vinculada (K48-Ub, 50 g/mL) en 1 búfer de muestra SDS-PAGE. Después de hervir a 95oC durante 5 min, alícuota y conservar a -80oC para uso futuro.</li>
	<li>En el momento de SDS-PAGE, genere una curva estándar de 6 puntos de la mezcla de proteínas estándar diluyendo en serie 1:3 en 1 búfer de muestra SDS-PAGE. Cargue 10 l de cada muestra de curva estándar en un midi-gel de 26 pozos 4-12% SDS-PAGE, seguido de los estándares de proteína sensibilizado(Tabla de materiales),un estándar de peso molecular comercial.</li>
	<li>Para medir el flujo autofágico, cargue 12 ml de muestra de 3KP en cada poca. NOTA: Suponiendo que se realizaran tratamientos de farsa, bortezomib y leupeptina y suponiendo 3 ratones por tratamiento, cada punto de tiempo debe consistir en 9 muestras. Por lo tanto, cada midi-gel puede acomodar 2 puntos de tiempo más la curva estándar y un experimento típico de series temporales requerirá 3 midi-gels para la lectura.</li>
	<li>Para medir el flujo proteasomal, cargue 12 ml de fracción de cito en cada pocal.</li>
	<li>Separe las muestras de proteínas por SDS-PAGE y transfiera a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando protocolos estándar. Si se prevé la hincha occidental de LC3b, transfiera geles con un búfer de transferencia que contenga metanol al 20%. De lo contrario, utilice un búfer de transferencia que contenga 10% de metanol, ya que esto permitirá una transferencia más eficiente de especies de proteínas de alto peso molecular.</li>
	<li>Realice la hincha occidental utilizando protocolos estándar. Para analizar el flujo macroautofofagico, las membranas de la mancha que contienen muestras de 3KP con anticuerpos anti-p62 o anti-LC3b (1:1,000) durante la noche a 4 oC. Para analizar el flujo proteasomal, las membranas manchadas que contienen muestras de Cito con poliubiquitina específica anti-Lys48 (1:1.000) durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Imágenes occidentales utilizando anticuerpos secundarios estándar y dispositivos de imagen. Imagen de todas las membranas que constituyen un experimento de serie temporal determinado juntos.</li>
</ol>7. Análisis de datos
NOTA: Consulte Archivo suplementario "Datos de muestra".
<ol><li>Para realizar densitometría en muestras de manchas occidentales, utilice el software de gráficosestándar, Image Studio o, alternativamente, ImageJ.</li>
	<li>Realice mediciones densitométricas en bandas de interés tanto para la curva estándar como para las muestras experimentales. En Image Studio, usando p62 como ejemplo, dibuje un rectángulo largo que abarque el monómero de proteínas en la parte inferior y se extienda hasta la parte superior de la membrana. Copie, pegue y mueva el rectángulo a las muestras restantes. Es importante mantener el rectángulo utilizado para la cuantificación coherente entre muestras.</li>
	<li>Guarde la cuantificación en una hoja de cálculo presionando Informe e inicio de hoja de cálculo en la parte inferior derecha de la ventana de análisis.</li>
	<li>Genere una curva estándar densitométrica con hoja de cálculo utilizando la muestra estándar diluida en serie y utilice la regresión lineal o polinómica para obtener una ecuación de curva estándar de mejor ajuste. Usando esta ecuación, extrapolar la cantidad de p62, LC3b-II o Lys48-poly Ub en las muestras experimentales.</li>
	<li>Para obtener mediciones de flujo, reste la cantidad de proteína extrapolada de cada muestra tratada con inhibidores del valor medio de las muestras de PBS desde el mismo punto de tiempo (consulte Archivo suplementario "Datosde muestra" ).</li>
	<li>Evaluar la importancia estadística de la variación temporal en la rotación de proteínas utilizando ANOVA de 1 vía. Esto se puede hacer usando el software de hoja de cálculo estándar.</li>
</ol>

<ol><li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meter+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li>
<li>Ma, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS+suppresses+expression+of+asialoglycoprotein-binding+protein+through+TLR4+in+thioglycolate-elicited+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">LPS suppresses expression of asialoglycoprotein-binding protein through TLR4 in thioglycolate-elicited peritoneal macrophages.</a> Glycoconjugate Journal. 24 (4-5), 243-249 (2007).</li>
<li>Ryzhikov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+Rhythms+Spatially+and+Temporally+Organize+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diurnal Rhythms Spatially and Temporally Organize Autophagy.</a> Cell Reports. 26 (7), 1880-1892 (2019).</li>
<li>Martinez-Lopez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+Benefits+of+Intermeal+Fasting+by+Autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">System-wide Benefits of Intermeal Fasting by Autophagy.</a> Cell Metabolism. 26 (6), 856-871 (2017).</li>
<li>Desvergne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+modulation+of+proteasome+activity+and+accumulation+of+oxidized+protein+in+human+embryonic+kidney+HEK+293+cells+and+primary+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circadian modulation of proteasome activity and accumulation of oxidized protein in human embryonic kidney HEK 293 cells and primary dermal fibroblasts.</a> Free Radical Biology and Medicine. 94, 195-207 (2016).</li>
<li>Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+immunity+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy in immunity and inflammation.</a> Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+protein+degradation%3A+from+a+vague+idea+thru+the+lysosome+and+the+ubiquitin-proteasome+system+and+onto+human+diseases+and+drug+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Intracellular protein degradation: from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (9), 1178-1190 (2005).</li>
<li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Logic+of+the+26S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li>
<li>Haspel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+macroautophagic+flux+in+vivo+using+a+leupeptin-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Characterization of macroautophagic flux in vivo using a leupeptin-based assay.</a> Autophagy. 7 (6), 629-642 (2011).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
<li>Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+Circadian+Rhythms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Phenotyping Circadian Rhythms in Mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (3), 271-281 (2015).</li>
<li>Hughes, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Genome-Scale+Analysis+of+Biological+Rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Genome-Scale Analysis of Biological Rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 32 (5), 380-393 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro protocolo describe un medio técnicamente sencillo de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas en ratones utilizando equipos de biología molecular comúnmente disponibles. Debido a la duración de los experimentos de series temporales y el número de muestras biológicas involucradas, es importante ser consistente en todo el experimento con respecto a cómo se inyectan los ratones, el momento de la adquisición de tejidos y el procesamiento bioquímico de Muestras. Las etapas de inyección, eutanasia y luxa...

Los ritmos circadianos se refieren a variaciones diarias y predecibles en la función biológica que son evidentes en toda la naturaleza. Existen a todas las escalas biológicas, desde comportamientos macroscópicos como ciclos sueño-vigilia, hasta fenómenos moleculares como la abundancia rítmica de biomoléculas. En los últimos años, la investigación sobre los ritmos circadianos se ha transformado por el descubrimiento de "genes de reloj" que son críticos para la generación del ritmo circadiano. Los estudios en ratones knockout del gen del reloj han revelado un papel central para los ritmos circadianos en la organización temporal de los procesos celulares centrales como el metabolismo1. Entre las formas en que los ritmos circadianos hacen que esto suceda es impartir una estructura temporal al catabolismo proteico.
Varios grupos incluyendo el nuestro han demostrado que las dos principales vías para el catabolismo proteico celular, la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma, están sujetas a ritmos diurnos2,3,4,5. La autofagia representa el brazo lisososodependiente del catabolismo proteico en el que las proteínas de interés se entregan a este orgánulo degradante ya sea a través de la construcción de una vesícula novedosa (macroautofagia) o a través de una translocación directa a través de una canal (autofagia mediada por chaperón)6. El sistema ubiquitina-proteasoma es la principal vía no lisosomal, donde las proteínas son poliubiquitinadas y luego se alimentan en el proteosoma, una máquina degradante macromolecular que se encuentra en todo el citoplasma y el núcleo7,8. Los ritmos en la actividad autofágica y proteasomal son importantes porque probablemente juegan un papel en la limpieza celular. Como resultado, es valioso tener un procedimiento estandarizado que pueda detectar oscilaciones diarias en el catabolismo proteico que es compatible con modelos de enfermedad preclínica.
Aquí, proporcionamos nuestro protocolo para cuantificar las variaciones diurnas en el flujo autofágico en el hígado de ratón, que ha servido de base para el trabajo en nuestro laboratorio3,9. Nuestro método se clasifica como un "ensayo de volumen de negocios"10,un enfoque utilizado por numerosos grupos para medir la actividad proteolítica (o flujo). En este enfoque, los inhibidores de la proteasa específicos de los lisosomas o proteasomas se administran a ratones y luego se obtienen muestras de tejido después de un intervalo de tiempo fijo. Paralelamente, las muestras de tejido se obtienen de ratones sometidos a inyecciones falsas. Las muestras de tejido se homogeneizan y luego se separan bioquímicamente para obtener las fracciones lisosomas y citoplasmáticas. Estas fracciones se analizan en paralelo a través de la hincha occidental utilizando anticuerpos específicos de los marcadores de macroautofagia (LC3b y p62) o sustratos proteasomales (proteína poliubiquitinada). Con el tiempo, los animales inyectados con inhibidores de la proteasa acumulan proteínas que normalmente se habrían reciclado. Como resultado, la tasa de rotación se deduce comparando la abundancia de proteínas marcadoras en las muestras tratadas con inhibidores de la proteasa con las muestras tratadas con farsa. Al repetir este método a intervalos de tiempo fijos a lo largo del día es posible reconstruir variaciones circadianas en la proteólisis(Figura 1A).

<table><tbody><tr><td>4x SDS PAGE Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>EMD Millipore</td><td>Cat# 5.04314.0001; CAS: 179324-69-7</td><td></td></tr><tr><td>Estudio de imagen</td><td>LICOR</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Membrana de PVDF 0,45 micras</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>Cat# IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>K48-linkage Specific Polyubiquitin (D9D5) Rabbit mAb Cell</td><td>Technology</td><td>Cat#8081S; RRID:AB_10859893</td><td></td></tr><tr><td>LC3a</td><td>Boston Biochem</td><td>Cat# UL-430</td><td></td></tr><tr><td>LC3b anticuerpo Novus</td><td></td><td>Cat#NB100-2220; RRID:AB_10003146</td><td></td></tr><tr><td>Tecnología de señalización celular</td><td>de anticuerpos LC3b</td><td>Cat#2775; RRID:AB_915950</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>Cat# L2884; CAS: 103476-89-7</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Cat# WG1403BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Cat# NP0007</td><td></td></tr><tr><td>P62-his</td><td>Novus</td><td>Cat# NBP1-44490</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# 1610373</td><td></td></tr><tr><td>Conejo Anti-P62/SQSTM1</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Cat#P0067; RRID:AB_1841064</td><td></td></tr><tr><td>rhPoly-Ub WT (2-7) (K48)</td><td>Boston Biochem</td><td>Cat# UC-230</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Geles de tamaño medio</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# WG1403</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST Tabletas Inhibidoras de la Proteasa</td><td>Millipore-Sigma</td><td>Cat# S8830</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Las células emplean varios métodos para reciclar proteínas no deseadas y otros materiales, incluyendo vías lisosomal y no lisosomal. La vía principal dependiente del lisosoma se llama autofagia, mientras que el método principal no lisosomal para el catabolismo proteico es el sistema ubiquitina-proteosoma. Estudios recientes en organismos modelo sugieren que la actividad de la autofagia y el sistema ubiquitina-proteasoma no es constante a lo largo del día, sino que varía según un ritmo diario (circadiano). La capacidad de medir los ritmos biológicos en la rotación de proteínas es importante para entender cómo se logra el control de calidad celular y para entender la dinámica de proteínas específicas de interés. Aquí presentamos un protocolo estandarizado para cuantificar el flujo autofágico y proteasomal in vivo que captura el componente circadiano de la rotación de proteínas. Nuestro protocolo incluye detalles para el manejo del ratón, procesamiento de tejidos, fraccionamiento y cuantificación de flujo autofágico utilizando el hígado del ratón como material de partida.

Los datos representativos se presentan en la Figura 2A,B, y la cuantificación de estos datos se proporciona en la Figura 2C,D (véase también Archivo Suplementario "Datosde muestra" ). Para simplificar, no hemos representado los controles de carga en la Figura 2, pero estos deben obtenerse en paralelo. Típicamente, las manchas occidentales contra la actina se utilizan para este propó...

Describimos nuestro protocolo para medir los ritmos biológicos en el catabolismo proteico a través de la autofagia y el proteosoma en el hígado de ratón.

Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Nuestro protocolo permite medir la velocidad de autofagia y actividad proteasomal en los tejidos del ratón y es lo suficientemente sensible como para detectar variaciones circadianas dentro de estas actividades. Esta técnica se puede utilizar in vivo para evaluar el catabolismo proteico en células y tejidos y los materiales requeridos son relativamente de baja tecnología y accesibles a cualquier laboratorio de biología molecular. Demostrando el procedimiento estará Mikhail Ryzhikov, un post-doc de mi laboratorio.Durante quince minutos antes de cada punto de tiempo, caliente las soluciones de stock de leupeptina y bortezomib a temperatura ambiente y diluya el bortezomib descongelado en PBS estéril para producir una solución de trabajo de 50 miligramos por mililitro. Para la administración de inhibidores de la proteasa, inyectar por vía intraperitoneal 40 miligramos por kilogramo de leupeptina o 1,6 microgramos por kilogramo de bortezomib en cada animal experimental. Para un control negativo, inyecte ratones con 0,5 mililitros de PBS.Devolver cada ratón a las jaulas agrupadas por el tipo de tratamiento recibido a medida que se inyectan y registrar el tiempo que los ratones son tratad

measuring-diurnal-rhythms-in-autophagic-and-proteasomal-flux

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video demuestra cómo medir la actividad del proteasoma en diferentes compartimentos subcelulares de la amígdala lateral de cerebros de ratas condicionados por el miedo y de control utilizando un ensayo de péptidos fluorogénicos. El proteasoma escinde el sustrato del péptido fluorogénico, liberando moléculas fluorescentes, que se cuantifican utilizando un lector de placas para evaluar la actividad del proteasoma en las fracciones de proteínas nucleares y sinápticas. El aumento de la...

Medición de la actividad del proteasoma en diferentes compartimentos subcelulares del cerebro de rata

La autofagia es un proceso ubicuo que permite a las células para degradar y reciclar las proteínas y orgánulos. Aplicamos microscopía de fluorescencia avanzada para visualizar y cuantificar la pequeña, pero, cambios físicos esenciales asociados con la inducción de la autofagia, incluyendo la formación y distribución de autofagosomas y lisosomas, y su fusión en autolisosomas.

Análisis cuantitativo de la autofagia mediante microscopía de fluorescencia avanzada 3D

Time-lapse microscopía de marcadores autofagia marcados con fluorescencia permite la monitorización de la respuesta de la autofagia dinámico con alta resolución temporal. Usando la autofagia específico y los marcadores de orgánulos en una combinación de 3 colores diferentes, podemos seguir la aportación de una proteína a la formación autophagosome en un contexto espacial y temporal robusto.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

Aquí se describe un protocolo simple y bien validado para medir la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. El método se basa en cuantificar la proporción de lactato deshidrogenasa (LDH) en fracciones celulares de sedimentables en comparación con los niveles de LDH celulares total.

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

Mitofagia, la degradación selectiva de las mitocondrias, se ha implicado en la homeostasis mitocondrial y desregulado en varias enfermedades humanas. Sin embargo, convenientes métodos experimentales para medir la actividad de la mitofagia son muy limitados. Presentamos un ensayo sensible para medir la actividad de la mitofagia mediante citometría de flujo.

Medida sensible de la mitofagia por reportero fluorescente flujo Cytometry usando el pH-dependiente mt-Keima

Este protocolo está diseñado para cuantificar eficientemente la actividad del sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) en diferentes compartimentos celulares del cerebro de roedores. Los usuarios pueden examinar el funcionamiento de UPS en fracciones nucleares, citoplasmáticas y sinápticas en el mismo animal, reduciendo la cantidad de tiempo y número de animales necesarios para realizar estos análisis complejos.

Cuantificación de la actividad ubiquitina-proteosoma subcelular en el cerebro de los roedores

Este protocolo describe el flujo de trabajo para el etiquetado metabólico de células senescentes y no en división con SILAC pulsado, análisis de espectrometría de masas no dirigido y un cálculo simplificado de las vidas medias de las proteínas.

Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Perfiles de isótopos estables de análisis de cromatografía de gases espectrometría de masa de flujo de intermediario metabólico se describe en el...

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

Aprenda a medir ritmos diurnos en flujo autofágico y proteasomal en hígado de ratón mediante inyecciones intraperitoneales de inhibidores de proteasas y análisis de western blot. Este método sensible permite evaluar el catabolismo proteico in vivo.

Medición de ritmos diurnos en flujo autofésico y proteasomal

Explorar más videos