Name: Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprende inmunohistoquímica para detectar antígenos de virus de la rabia en tejidos fijados con formalina. Este método sensible y específico permite localizar antígenos preservando la morfología celular y tisular.

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Agradecemos a los laboratoristas, epidemiólogos y afiliados de los departamentos de salud pública por las presentaciones de muestras a los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. Los hallazgos y conclusiones de este informe son los de los autores y no representan necesariamente la posición oficial de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades. El uso de nombres comerciales y fuentes comerciales son solo para identificación y no implican el respaldo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.

Si bien el protocolo IHC se realizó en tejidos fijos con formalina, que inactiva el RABV si está presente, se deben seguir adecuadamente los protocolos de bioseguridad apropiados. Todos los procedimientos de bioseguridad se describen en la 5ª edición de Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluido el uso de equipo de protección personal (EPP) adecuado y el requisito de vacunación como se describe12. Además, se debe seguir la contención y el manejo adecuados de productos químicos peligrosos (como formalina, AEC y xileno) (por ejemplo, campanas extractoras).
1. Fijación de formalina de los tejidos
<ol><li>Coloque los tejidos cerebrales de 3-5 mm recolectados después de la necropsia13 en una solución de formalina tamponada con fosfato al 10% (proporción de 1:20 a 1:50 tejido/formalina) durante 24-72 h. PRECAUCIÓN: La formalina es un fijador tóxico.</li>
	<li>Registre el peso aproximado del tejido (tamaño), el tipo de tejido (áreas del cerebro) y el volumen de formalina. Es importante que los laboratorios documenten y mantengan registros sobre los tiempos de fijación.</li>
	<li>Para un almacenamiento de tejido más largo después de la fijación de formalina y antes del procesamiento, coloque el tejido en etanol al 70%.</li>
</ol>2. Procesamiento de tejidos
<ol><li>Después de la fijación de la muestra, diseccione el tejido para incluir las áreas cerebrales importantes, por ejemplo, secciones transversales del tronco encefálico, el cerebelo (3 lóbulos) o el hipocampo (ambos hipocampos) cada uno cortado de 3 a 5 mm de grosor y colocado en casetes de procesamiento.</li>
	<li>Procese los casetes de tejido para la infiltración de cera de parafina, incrustados en bloques de parafina y seccionados (3 a 6 μm) en un microtomo.</li>
</ol>3. Preparación de Materiales / Platos de tinción
<ol><li>Configure el plato de tinción14 (Tabla de materiales)como se muestra en la Figura 1. Llene cada plato con 250 ml de la solución.</li>
	<li>Preparación de la solución de sustrato de 3-Amino-9-etilcarbizol (AEC)<ol>
<li>Disuelva una tableta de 20 mg de 3-amino 9-etilcarbazol (AEC) en 5 ml de N,N, dimetilformamida usando una pipeta de vidrio. PRECAUCIÓN: AEC es un carcinógeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la solución madre de proteasa (por ejemplo, Pronasa) para la recuperación de antígenos<ol>
<li>Disolver 7 mg de la proteasa en 200 ml de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del tampón de enjuague PBS-T<ol>
<li>Agregue 10 mL de Tween 80 a 990 mL de PBS. Mézclalo bien para formar una solución homogénea.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Desparafinación y rehidratación tisular
<ol><li>Haga una sección de parafina de 5 μm con un microtomo, flote en un baño de agua a 38 ° C y recójala en portaobjetos de vidrio. Etiquete las diapositivas con un bolígrafo/marcador resistente a los reactivos.</li>
	<li>Coloque los toboganes en una bandeja y derrita en un horno de 55-60 °C durante 1 h. No eleve la temperatura por encima de 60 ° C, ya que puede destruir el antígeno viral.</li>
	<li>Retira los portaobjetos del horno e inmediatamente desparafina en 3 enjuagues consecutivos de xileno de 5 min cada uno en los platos 1, 2 y 3.</li>
	<li>Rehidratar las secciones en la diapositiva mediante inmersiones secuenciales en la dilución decreciente de etanol a agua desionizada: (4 a 11 es un enjuague por inmersión) plato 4: xileno / 100% etanol (1: 1); plato 5: 100% etanol; plato 6: 100% etanol; plato 7: 95% etanol; plato 8: 95% etanol; plato 9: 80% etanol; plato 10: 70% etanol; plato 11: agua desionizada (Figura 1. Configuración del plato). PRECAUCIÓN: El xileno es un producto químico peligroso y el trabajo debe realizarse en una campana extractora de humos.</li>
</ol>5. Recuperación de antígenos proteolíticos
<ol><li>Tratar los portaobjetos con la proteasa (2,5 μg/ml de PBS) durante 30 min para la recuperación de antígenos proteolíticos en el plato 12.</li>
	<li>Luego enjuague en PBS-T durante 10 minutos (plato 13).</li>
	<li>Tratar con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min (plato 14).</li>
	<li>De nuevo, lavar con PBS-T durante 10 min (plato 15).</li>
</ol>6. Procedimiento de tinción
<ol><li>Maneje las diapositivas de una en una manteniendo las diapositivas restantes sumergidas en el búfer (no retire todo el soporte de la diapositiva, mantenga las diapositivas húmedas). Retire un portaobjetos y elimine el exceso de tampón (con una toalla de papel) de alrededor de la sección de pañuelos de papel teniendo cuidado de no perturbar la sección de pañuelos. Incubar diapositivas en una cámara de humedad, hecha colocando toallas de papel humedecidas, en el banco de laboratorio14 a temperatura ambiente con suero de cabra normal (bloqueo) durante 15 min.</li>
	<li>Incubar con el anticuerpo antirrábico primario de dilución predeterminado óptimo (dilución 1:250 del suero antirrábico de ratón, no publicado) (control positivo) y anticuerpos de control negativos a temperatura ambiente igual que el anterior (paso 6.1.) durante 60 min sin lavados intermedios.</li>
	<li>Después de 60 min, lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).</li>
	<li>Incubar con el anticuerpo biotinilado (específico de la especie) en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manipulación igual que el paso 6.1.).</li>
	<li>Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).</li>
	<li>Incubar con el complejo Streptavidin-HRP en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 15 min (manipulación igual a 6.1.).</li>
	<li>Lavar con PBS-T durante 10 min (plato 16).</li>
	<li>Incubar con sustrato de peroxidasa, amino-etilcarbazol (AEC), en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 min. Haga AEC justo antes de su uso. Para hacerlo, agregue 1 ml de solución de stock AEC a 14 ml de tampón de acetato 0.1M, pH 5.2. Añadir 0,15 mL de 3% H2O2. Filtrar la mezcla justo antes de su uso (filtro de 0,45 μm). NOTA: La solución de trabajo de AEC solo es estable durante 2-3 h. La solución de stock AEC se puede almacenar en el refrigerador durante períodos más largos.</li>
	<li>Lavar en agua desionizada 10 min (plato 17)</li>
	<li>Contrateñido con hematoxilina de Gill diluida 1:2 con agua desionizada durante 2 min (plato 18).</li>
	<li>Enjuague el exceso de hematoxilina con enjuague por inmersión con agua desionizada (platos 19 y 20).</li>
	<li>Enjuague en Scott's Tap water 30 s (solución de azulado) plato 21.</li>
	<li>Lavar en agua desionizada 10 min (plato 22)</li>
	<li>Retire las diapositivas de una en una: monte con un medio de montaje soluble en agua.</li>
	<li>Lea diapositivas en un microscopio de luz.</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consulation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).</li>
<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Debido a la alta tasa de mortalidad de la rabia después del inicio de los síntomas, el diagnóstico de animales sospechosos de infección por RABV es extremadamente crítico para un tratamiento profiláctico adecuado después de la exposición. El diagnóstico de la rabia depende principalmente de técnicas basadas en DFA, DRIT y PCR que utilizan tejidos frescos o congelados. Para las pruebas de tejidos fijos con formalina, la prueba IHC proporciona un método alternativo para la detección sensible y específica del antígeno RABV....

La rabia es una encefalitis progresiva aguda causada por los virus de ARN de sentido negativo pertenecientes al género lyssavirus1. Casi el 99% de todas las muertes humanas causadas por la infección con el virus de la rabia (RABV), el miembro tipo del género, es transmitida por perros2. El diagnóstico de rabia de animales sospechosos se basa en la detección de antígeno (principalmente nucleoproteína codificada viralmente, proteína N) en complejo con ARN genómico (complejo ribonucleoproteína, RNP) en el tejido cerebral3. La detección de antígenos mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) se considera el estándar de oro para el diagnóstico de la rabia4. El método utiliza material cerebral fresco o fresco congelado, una impresión táctil en una diapositiva, fijación en acetona, tinción utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales (mAbs/pAbs) de isotiocianato fluorescente (FITC) disponibles comercialmente y leídos por la microscopía de fluorescencia5. La prueba DFA es rápida, sensible y específica para la detección de antígenos de rabia en tejido cerebral fresco. Recientemente, se demostró que una prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT), técnica de inmunohistoquímica modificada (IHC), exhibe una sensibilidad similar a la DFA, pero ofrece la ventaja de la microscopía de luz para la visualización6. Si bien el método de detección utilizado en DRIT es similar al IHC, el paso inicial utiliza tejidos frescos o congelados para generar impresiones táctiles de la muestra seguidas de fijación en formalina.
IHC es una técnica ampliamente utilizada para determinar cambios histológicos y la detección de proteínas utilizando anticuerpos específicos en tejidos fijos con formalina incrustados en bloques de parafina. IHC es una prueba alternativa establecida para la detección del antígeno de la rabia en las secciones de tejido7. La IHC se ha utilizado particularmente para el diagnóstico de casos retrospectivos que exhibieron enfermedades neurológicas para determinar la carga de la rabia8. Los tejidos fijados en formalina incrustados en parafina preservan las proteínas para la detección incluso después de varios años cuando se almacenan a temperatura ambiente9. El tratamiento con formalina modifica las proteínas mediante la reticulación y alteración de las cadenas laterales de aminoácidos, lo que podría hacer que los epítopos ya no sean reactivos contra los anticuerpos10. Si bien la prueba IHC para la detección de antígenos de rabia involucra mAbs o pAbs, este último es ventajoso ya que se pueden detectar múltiples epítopos y lissavirus divergentes11.
Los pasos estándar involucrados en la IHC son la fijación de formalina de los tejidos, la incrustación en bloques de parafina, la seccionamiento de los tejidos, la desparafinación y la hidratación, la recuperación del epítopo, la reactividad contra los anticuerpos primarios y secundarios, y el desarrollo utilizando sustratos cromogénicos. Este manuscrito describe una descripción detallada del protocolo para el diagnóstico de la rabia. Para la detección de antígenos de la rabia, se utiliza suero de ratón inmunizado con RABV (pAbs) generado en los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos en Atlanta, Georgia, en combinación con anticuerpos secundarios biotinilados contra ratones. Los abs biotinilados se detectan mediante la adición del complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) seguido del desarrollo del color con sustrato de amino-etilcarbazol.

<table><tbody><tr><td>3% peróxido de hidrógeno Marcas</td><td></td> de <td>Pharamacy</td><td>Listo para usar 3% H2O2</td></tr><tr><td>3-amino-9-etilcarbazol (AEC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de acetato pH 5.2</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Formalina tamponada 10% Fosfato tamponado</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Certified</td></tr><tr><td>Cubreobjetos Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-471</td><td>24 X 50 mm</td></tr><tr><td>Etanol 190 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Formulación de hematoxilina de Gill #2</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>HistoMark Biotina-Estreptavidina Peroxidasa Kit</td><td>seracare</td><td>71-00-18</td><td>Anticuerpo primario de ratón&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>Medios</td></tr><tr><td>de montaje N,N, Dimetilformamida GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objetivo</td><td>Múltiples proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objetivo</td><td>Múltiples proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Proteasa, Streptomyces griseus</td></tr><tr><td>Scott's Tap Water&nbsp;</td><td>Investigación y análisis de Poly Scientific D Corp.</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Juego de tinciones Slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Grado histológico</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 imágenes - microscopio</td><td>Múltiples proveedores</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Una de las principales modalidades diagnósticas para la rabia es la detección del complejo de ribonucleoproteína viral (RNP) (antígeno) en las muestras de tejido infectadas. Si bien la prueba de anticuerpos fluorescentes directos (DFA) o la prueba inmunohistoquímica rápida directa (DRIT) se utilizan con mayor frecuencia para la detección de antígenos, ambas pruebas requieren tejidos frescos y / o congelados para impresiones en diapositivas antes de la detección de antígenos con anticuerpos. Si las muestras se recogen y se fijan en formalina, ninguna de las pruebas es óptima para la detección de antígenos, sin embargo, las pruebas se pueden realizar mediante inmunohistoquímica convencional (IHC) después de incrustar en bloques de parafina y seccionamiento. Con este método IHC, los tejidos se tiñen con anticuerpos antirrábicos, las secciones se desparafinan, el antígeno se recupera mediante proteólisis parcial u otros métodos, y se incuba con anticuerpos primarios y secundarios. Los antígenos se tiñen con peroxidasa de rábano picante / amino etil carbazol y se contrateñen con hematoxilina para la visualización utilizando un microscopio de luz. Además de la detección específica de antígenos, la fijación de formalina ofrece otras ventajas como la determinación de cambios histológicos, condiciones relajadas para el almacenamiento y transporte de muestras (bajo temperatura ambiente), capacidad para probar casos retrospectivos y una mayor seguridad biológica a través de la inactivación de agentes infecciosos.

La Figura 2 muestra resultados representativos de tinción de IHC de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales analizados. La Figura 2A, D, G representa muestras positivas a 200x, mientras que la Figura 2B, E, H corresponde a un aumento de 400x, respectivamente. Figura 2A-C corresponden al...

Aquí, presentamos un protocolo de prueba de inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina.

Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Los tejidos utilizados para la inmunohistoquímica y para la histopatología diagnóstica se fijan rutinariamente en formalina tampón de fosfato al 10%. La detección del antígeno del virus de la rabia en el tejido cerebral que se ha fijado en formalina presenta un desafío único, y se ha encontrado que la prueba IHC es un método sensible y específico para la detección del antígeno del virus de la rabia. La principal ventaja de la biopsia u otros métodos de detección es que los antígenos se pueden detectar en relación con la morfología tisular y celular.Con IHC, la localización del antígeno de la rabia en tejidos cerebrales y no cerebrales, proporciona información adicional que no se pudo obtener a través de las secciones de rutina de tinción de hematoxilina y eosina. Las pruebas de diagnóstico de la rabia son importantes para el inicio de la profilaxis posterior a la exposición en humanos expuestos al virus de la rabia. IHC es uno de los ensayos más comúnmente realizados en tejidos fijos de formalina.Con anticuerpos específicos, se puede utilizar para la detección de patógenos respectivos. Para comenzar este procedimiento, coloque de tres a cinco milímetros de piezas de tejido cerebral, recolectadas después de la necropsia, en una solución de formalina tamponada al 10% durante 24 a 72 horas. Registre el peso aproximado del tejido, el tipo de tejido y el volumen de formalina.Coloque los tejidos en etanol al 70% para un almacenamiento de tejido más largo después de la fijación de formalina y antes del procesamiento. Después de la fijación de la muestra, diseccione el tejido para incluir las áreas cerebrales importantes, como las secciones transversales del tronco encefálico, el cerebelo o el hipocampo. Cada uno, cortado a un grosor entre tres y cinco milímetros.Coloque los tejidos en casetes de procesamiento. Procese los casetes de tejido para la infiltración de cera de parafina. Incrustarlos en bloques de parafina y seccionarlos en un microtomo.Primero configure el plato de tinción como se describe en la Figura 1 del protocolo de texto. Llene cada plato con 250 mililitros de la solución preparada. Para preparar la solución de caldo de sustrato AEC, use una pipeta de vidrio para disolver una tableta de 20 miligramos de AEC en 5 mililitros de N, N-Dimetilformamida.Para preparar la solución de caldo de proteasa, disuelva 7 miligramos de la proteasa en 200 mililitros de PBS. Para preparar el tampón de enjuague, agregue 100 mililitros de Tween 80 a 990 mililitros de PBS y mezcle bien para formar una solución homogénea de PBT-T. Usando un microtomo, haga una sección de parafina de cinco micrómetros.Cargue la sección en un baño de agua a 38 grados centígrados y recójala en toboganes de vidrio. Etiquete las diapositivas con una pluma resistente a los reactivos. Coloque los toboganes en una bandeja y derrita en un horno a 55 a 60 grados centígrados durante una hora.Luego, retira los portaobjetos del horno e inmediatamente desparafinarlos, utilizando 3 enjuagues consecutivos de xileno de 5 minutos cada uno. Después de esto, rehidrate las secciones en la diapositiva mediante inmersiones secuenciales en diluciones decrecientes de etanol a agua desionizada, como se describe en el protocolo de texto. Trate los portaobjetos con la proteasa durante 30 minutos para la recuperación del antígeno proteolítico, luego enjuague los portaobjetos en PBS-T durante 10 minutos y trátelos con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos.Después de esto, lave las diapositivas nuevamente con PBS-T durante 10 minutos. Para comenzar, retire una diapositiva del búfer, asegurándose de manejar solo una diapositiva a la vez, mientras las otras permanecen sumergidas, y use una toalla de papel para borrar el exceso de amortiguación de alrededor de la sección de tejido. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad e incube con suero de cabra normal a temperatura ambiente durante 15 minutos.A continuación, incube los portaobjetos en la cámara de humedad con el anticuerpo antirrábico primario de dilución predeterminado óptimo y anticuerpos de control negativos, a temperatura ambiente durante 60 minutos sin lavados intermedios. Después de esto, lave los portaobjetos con PBS-T durante 10 minutos e incube en una cámara de humedad con el anticuerpo biotinilado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Lave los portaobjetos de nuevo con PBS-T durante 10 minutos.Incubar los portaobjetos y la cámara de humedad con división de tiras y complejo HRB a temperatura ambiente durante 15 minutos y lavar el PBS-T durante 10 minutos. Luego, incube con AEC en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lave los portaobjetos en agua desionizada durante 10 minutos y contraconta con hematoxilun de Gill, diluido uno o dos con agua desionizada durante dos minutos.Después de esto, enjuague el exceso de hematoxilina enjuagando los por inmersión los portaobjetos en agua desionizada. Enjuague los toboganes en Scott's Tap Water durante 30 segundos y lávelos en agua desionizada durante 10 minutos. Retire las diapositivas de una en una y móntelas con un medio de montaje soluble en agua.Luego, use un microscopio de luz para leer las diapositivas. En este estudio, se demuestra una prueba de química inmunocítica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina. Aquí se muestra un resultado representativo de tinción química inmunocítica de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales, incluidos el tronco encefálico, el cerebelo y las células de purkinje, y el hipocampo.La tinción de rojo magenta, que indica el desarrollo del color mediante el uso de sustrato AEC contra el fondo azul contramantado, se debe a la reactividad de los anticuerpos contra el antígeno de la rabia. Un resultado positivo en Inmunohistoquímica corresponde a la tinción de color rojo magenta en las secciones de tejido. La tinción de inclusiones citoplasmáticas e inclusiones granulares de tamaño variable son indicativas de muestras positivas para infecciones por RABV.Las muestras se consideran negativas si no se observó ninguna tinción roja específica o solo el fondo azul, debido a la hematoxilina. Además de la tinción positiva, la distribución de las inclusiones podría proporcionar una cuantificación indirecta de los niveles de antígeno antirrábico en la muestra, que podría corresponder a la carga viral de la muestra de tejido. Independientemente de los niveles de distribución, cualquier tinción específica clasificará la muestra como positiva para la detección de antígenos RABV.Los tejidos deben fijarse adecuadamente en formalina y evitar congelar los tejidos durante este proceso. El antígeno de la rabia es detectado por IHC, luego se pueden realizar técnicas moleculares en secciones de parafina para determinar la variante de Lyssavirus basada en la información de la secuencia de ARN. Los reactivos como el xileno y la formalina deben manipularse en campanas extractoras.Se debe tener cuidado al manipular AEC, ya que es un carcinógeno.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Este video muestra la tinción inmunohistoquímica para la detección del antígeno del virus de la rabia en tejido cerebral de ratón infectado. El proceso incluye la desparafinación y el tratamiento con alcohol, seguidos de un tratamiento proteolítico para mejorar la accesibilidad al antígeno. La tinción inmunohistoquímica revela precipitados rojos, lo que confirma la presencia de antígenos de rabia en la sección de tejido.

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Aquí presentamos un protocolo optimizado y detallado para la inmunotinción doble en secciones de tejido del sistema nervioso central (SNC) y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) de rata fijadas en formol, incluidas en parafina.

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

Las nuevas técnicas de limpieza de tejidos compatibles con la inmunomancha, como la imagen 3D definitiva de órganos con disolventes, permiten la visualización 3D de la infección cerebral del virus de la rabia y su complejo entorno celular. Las rebanadas gruesas de tejido cerebral con etiqueta de anticuerpos se hacen ópticamente transparentes para aumentar la profundidad de la imagen y permitir el análisis 3D mediante microscopía de escaneo láser confocal.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

Este protocolo introduce un procedimiento operativo de laboratorio estándar para las pruebas de diagnóstico de antígenos de lissavirus en murciélagos en Taiwán.

Procedimiento Operativo Estándar para la Vigilancia de Lyssavirus de la Población Bat en Taiwán

Este RT-PCR en tiempo real que utiliza tinte intercalador dsDNA es adecuado para diagnosticar infecciones por lissavirus. El método comienza con el ARN extraído de la rabia sospechada de muestras ante mortem o post mortem, detallando la preparación de mezclas maestras, la adición de ARN, la configuración de la máquina en tiempo real y la correcta interpretación de los resultados.

Pan-lyssavirus en tiempo real RT-PCR para diagnóstico de rabia

Presentamos un protocolo completo para el diagnóstico postmortem de la rabia animal en condiciones de campo utilizando una prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido (RIDT), desde el muestreo de biopsia cerebral hasta la interpretación final. También describimos otras aplicaciones que utilizan el dispositivo para el análisis molecular y el genotipado viral.

Prueba de diagnóstico inmunocromatográfico rápido postmortem de campo para la configuración de recursos limitados con otras aplicaciones moleculares

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Este protocolo demuestra el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) pan-lyssavirus LN34 en tiempo real desde la recolección de tejidos hasta la interpretación de los resultados, incluidas las actualizaciones de las secuencias de cebadores y formulaciones para mejorar el rendimiento del ensayo para algunos lyssavirus y lagomorfos no antirrábicos. También demostramos la configuración del ensayo para un formato multiplexado LN34 de un solo pocillo (LN34M).

Diagnóstico postmortem de la rabia en animales mediante el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa LN34 en tiempo real multiplexado actualizado

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende inmunohistoquímica para detectar antígenos de virus de la rabia en tejidos fijados con formalina. Este método sensible y específico permite localizar antígenos preservando la morfología celular y tisular.

Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

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