Prueba de inmunohistoquímica para la detección de antígenos de lisavirus en tejidos fijos de formalina

Los tejidos utilizados para la inmunohistoquímica y para la histopatología diagnóstica se fijan rutinariamente en formalina tampón de fosfato al 10%. La detección del antígeno del virus de la rabia en el tejido cerebral que se ha fijado en formalina presenta un desafío único, y se ha encontrado que la prueba IHC es un método sensible y específico para la detección del antígeno del virus de la rabia. La principal ventaja de la biopsia u otros métodos de detección es que los antígenos se pueden detectar en relación con la morfología tisular y celular.

Con IHC, la localización del antígeno de la rabia en tejidos cerebrales y no cerebrales, proporciona información adicional que no se pudo obtener a través de las secciones de rutina de tinción de hematoxilina y eosina. Las pruebas de diagnóstico de la rabia son importantes para el inicio de la profilaxis posterior a la exposición en humanos expuestos al virus de la rabia. IHC es uno de los ensayos más comúnmente realizados en tejidos fijos de formalina.

Con anticuerpos específicos, se puede utilizar para la detección de patógenos respectivos. Para comenzar este procedimiento, coloque de tres a cinco milímetros de piezas de tejido cerebral, recolectadas después de la necropsia, en una solución de formalina tamponada al 10% durante 24 a 72 horas. Registre el peso aproximado del tejido, el tipo de tejido y el volumen de formalina.

Coloque los tejidos en etanol al 70% para un almacenamiento de tejido más largo después de la fijación de formalina y antes del procesamiento. Después de la fijación de la muestra, diseccione el tejido para incluir las áreas cerebrales importantes, como las secciones transversales del tronco encefálico, el cerebelo o el hipocampo. Cada uno, cortado a un grosor entre tres y cinco milímetros.

Coloque los tejidos en casetes de procesamiento. Procese los casetes de tejido para la infiltración de cera de parafina. Incrustarlos en bloques de parafina y seccionarlos en un microtomo.

Primero configure el plato de tinción como se describe en la Figura 1 del protocolo de texto. Llene cada plato con 250 mililitros de la solución preparada. Para preparar la solución de caldo de sustrato AEC, use una pipeta de vidrio para disolver una tableta de 20 miligramos de AEC en 5 mililitros de N, N-Dimetilformamida.

Para preparar la solución de caldo de proteasa, disuelva 7 miligramos de la proteasa en 200 mililitros de PBS. Para preparar el tampón de enjuague, agregue 100 mililitros de Tween 80 a 990 mililitros de PBS y mezcle bien para formar una solución homogénea de PBT-T. Usando un microtomo, haga una sección de parafina de cinco micrómetros.

Cargue la sección en un baño de agua a 38 grados centígrados y recójala en toboganes de vidrio. Etiquete las diapositivas con una pluma resistente a los reactivos. Coloque los toboganes en una bandeja y derrita en un horno a 55 a 60 grados centígrados durante una hora.

Luego, retira los portaobjetos del horno e inmediatamente desparafinarlos, utilizando 3 enjuagues consecutivos de xileno de 5 minutos cada uno. Después de esto, rehidrate las secciones en la diapositiva mediante inmersiones secuenciales en diluciones decrecientes de etanol a agua desionizada, como se describe en el protocolo de texto. Trate los portaobjetos con la proteasa durante 30 minutos para la recuperación del antígeno proteolítico, luego enjuague los portaobjetos en PBS-T durante 10 minutos y trátelos con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos.

Después de esto, lave las diapositivas nuevamente con PBS-T durante 10 minutos. Para comenzar, retire una diapositiva del búfer, asegurándose de manejar solo una diapositiva a la vez, mientras las otras permanecen sumergidas, y use una toalla de papel para borrar el exceso de amortiguación de alrededor de la sección de tejido. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad e incube con suero de cabra normal a temperatura ambiente durante 15 minutos.

A continuación, incube los portaobjetos en la cámara de humedad con el anticuerpo antirrábico primario de dilución predeterminado óptimo y anticuerpos de control negativos, a temperatura ambiente durante 60 minutos sin lavados intermedios. Después de esto, lave los portaobjetos con PBS-T durante 10 minutos e incube en una cámara de humedad con el anticuerpo biotinilado a temperatura ambiente durante 15 minutos. Lave los portaobjetos de nuevo con PBS-T durante 10 minutos.

Incubar los portaobjetos y la cámara de humedad con división de tiras y complejo HRB a temperatura ambiente durante 15 minutos y lavar el PBS-T durante 10 minutos. Luego, incube con AEC en una cámara de humedad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lave los portaobjetos en agua desionizada durante 10 minutos y contraconta con hematoxilun de Gill, diluido uno o dos con agua desionizada durante dos minutos.

Después de esto, enjuague el exceso de hematoxilina enjuagando los por inmersión los portaobjetos en agua desionizada. Enjuague los toboganes en Scott's Tap Water durante 30 segundos y lávelos en agua desionizada durante 10 minutos. Retire las diapositivas de una en una y móntelas con un medio de montaje soluble en agua.

Luego, use un microscopio de luz para leer las diapositivas. En este estudio, se demuestra una prueba de química inmunocítica para la detección del antígeno del virus de la rabia como una prueba diagnóstica alternativa para los tejidos fijos con formalina. Aquí se muestra un resultado representativo de tinción química inmunocítica de muestras de control positivas y negativas en diferentes tejidos cerebrales, incluidos el tronco encefálico, el cerebelo y las células de purkinje, y el hipocampo.

La tinción de rojo magenta, que indica el desarrollo del color mediante el uso de sustrato AEC contra el fondo azul contramantado, se debe a la reactividad de los anticuerpos contra el antígeno de la rabia. Un resultado positivo en Inmunohistoquímica corresponde a la tinción de color rojo magenta en las secciones de tejido. La tinción de inclusiones citoplasmáticas e inclusiones granulares de tamaño variable son indicativas de muestras positivas para infecciones por RABV.

Las muestras se consideran negativas si no se observó ninguna tinción roja específica o solo el fondo azul, debido a la hematoxilina. Además de la tinción positiva, la distribución de las inclusiones podría proporcionar una cuantificación indirecta de los niveles de antígeno antirrábico en la muestra, que podría corresponder a la carga viral de la muestra de tejido. Independientemente de los niveles de distribución, cualquier tinción específica clasificará la muestra como positiva para la detección de antígenos RABV.

Los tejidos deben fijarse adecuadamente en formalina y evitar congelar los tejidos durante este proceso. El antígeno de la rabia es detectado por IHC, luego se pueden realizar técnicas moleculares en secciones de parafina para determinar la variante de Lyssavirus basada en la información de la secuencia de ARN. Los reactivos como el xileno y la formalina deben manipularse en campanas extractoras.

Se debe tener cuidado al manipular AEC, ya que es un carcinógeno.