Name: Una dieta sin sangre para criar mosquitos anofelinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende a criar mosquitos Anopheles sin sangre mediante una dieta artificial que sustituye la alimentación sanguínea. Este método ético facilita la investigación sobre malaria y mejora la producción de vectores en insectarios.

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Nos gustaría agradecer a Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) por el apoyo técnico, Joana Gomes y Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) por el mantenimiento de las colonias de mosquitos Anopheles. Financiado por la Fundación Bill y Melinda Gates (OPP1138841), la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Los ratones fueron obtenidos de la casa de animales IHMT. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con la ley portuguesa y las directrices para el uso de animales de laboratorio. El Dire-O-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural y das Pescas, Portugal aprobó todos los protocolos de estudio (aprobaciones de identificación: 023351 y 023355).
NOTA: Realice todos los ensayos de alimentación a 26 oC.
1. Mosquitos
<ol><li>Mantener aAnopheles coluzzii (antigua forma de Anopheles gambiae M) Mosquitos de cepa Yaundé a 26 oC, 75% de humedad bajo un ciclo de luz de 12 h:12 h: ciclo oscuro. Casa de mosquitos que utilizan condiciones insectarias estándar para garantizar el apareamiento.</li>
	<li>Recoger las puas de mosquitos en un pequeño recipiente de agua. Coloque el recipiente dentro de una jaula de mosquitos para permitir que los mosquitos adultos emerjan y se apareen. Proporcionar un 10% de solución de alimentación de glucosa. Tres días después de la aparición recoger el número necesario de mosquitos de la jaula de almacenamiento utilizando un aspirador.</li>
	<li>Un día antes de los ensayos de alimentación, retire la solución de alimentación de glucosa al 10%. NOTA: Se utilizaron 3 mosquitos de un día de edad durante todo el experimento.</li>
</ol>2. Alimentación de mosquitos
<ol><li>Preparación de dietas líquidas artificiales<ol>
<li>Preparar las dietas líquidas artificiales en condiciones estériles en un gabinete de flujo laminar. Preparar la dieta líquida rica (r-liq_diet) añadiendo lo siguiente a la dieta líquida inicial (i-liq_diet; El medio de Eagle modificado de Dulbecco [glucosa alta con L-glutamina], ver Tabla 1:0,55 g/L ATP, 1 g/L de colesterol y 200 g/L de albúmina sérica bovina (BSA). Mezcle todos los ingredientes a fondo y filtre con un microfiltro de 0,45 m. NOTA: No almacene las dietas; preparar dietas recién a partir de las soluciones de stock para cada experimento, ya que pierden calidad cuando se almacenan. Los componentes de las dietas se describen en la Tabla 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolección de sangre de ratón<ol>
<li>Anestetizar 6 x 8 semanas de edad CD1 ratones hembra (Mus musculus) con ketamina (120 mg/kg) y xilazina (16 mg/kg) utilizando la vía intraperitoneal.</li>
		<li>Realizar punción cardíaca(Figura 1) cuando el ratón no muestra ninguna reacción muscular en respuesta a diferentes estímulos físicos (por ejemplo, pellizcos de dedo del dedo del sol y cola).</li>
		<li>Recoger sangre con una jeringa estéril de 1 ml con una aguja de 27 G x 1/2o (0,4 x 12 mm2) que contenga 100 ml de 1 mg/ml de heparina (sal sódica) para evitar la formación de coágulos sanguíneos. Mantener la sangre a 37 oC con un baño de agua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimentación artificial<ol>
<li>Recoger aproximadamente 30 mosquitos hembra de la jaula de stock utilizando un aspirador.</li>
		<li>Transfiera los mosquitos hembra a tazas de papel de 500 ml y cúbralos con una fina malla de mosquitera para que no puedan escapar. Aplique un alimentador de vidrio conectado a tubos de plástico para mantener un flujo de agua constante en la parte superior de cada taza(Figura 2). Proporcione un flujo de agua constante al tubo cilíndrico y al alimentador para que la temperatura interior se mantenga a aproximadamente 37,5 oC. NOTA: Se utilizó un aparato de alimentación artificial de campana de vidrio estándar16 para suministrar las dietas formuladas a los mosquitos hembra.</li>
		<li>Estirar la membrana de la película de parafina a través de la boca del alimentador de vidrio para contener la comida.</li>
		<li>Precalentar la i-liq_diet y r-liq_diet a 37 oC utilizando un baño de agua. Aplique 1 ml en el alimentador de vidrio. Alimentar a los mosquitos durante 60 minutos en la oscuridad con i-liq_diet, r-liq_diet o sangre fresca de ratón. Realizar ensayos a 26oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluación de la tasa de alimentación.<ol>
<li>Después de la alimentación artificial, anestetizar en frío los mosquitos a -20 oC durante 30 s. Coloque los mosquitos en un plato de Petri refrigerado.</li>
		<li>Registre el número de mosquitos hembra completamente engordados(Figura 3). NOTA: El porcentaje de mosquitos alimentados se utiliza como apoderado para el éxito de la alimentación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Rasgos de la historia de la vida
<ol><li>Producción de huevos y fertilidad<ol>
<li>Transfiera las hembras completamente engordadas, usando un cepillo, a jaulas individuales (20 cm x 20 cm x 20 cm).</li>
		<li>Mantener los mosquitos a 26 oC, 75% de humedad y una luz de 12 h:12 h: ciclo oscuro con 10% de glucosa ad libitum.</li>
		<li>Cuarenta y ocho h después de la alimentación, añadir un papel de filtro humidificado en la parte inferior para la puesta de huevos(Figura 4). Cuente los huevos a las 48 h y 72 h después de la adición del papel de puesta de huevos utilizando una lupa de mano. Inundar el papel filtrante con agua destilada para recoger los huevos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mortalidad de larvas<ol>
<li>Recoger los huevos en bandejas (23 cm x 15 cm x 6 cm) llenas de agua destilada(Figura 5). Mantenga constante el nivel de agua en las bandejas durante los experimentos.</li>
		<li>Alimente las larvas diariamente con aproximadamente 13 mg de alimento de pescado molido por bandeja. Aplique un régimen de alimentación similar a todas las bandejas de réplica.</li>
		<li>Retire las pusilas muertas y las larvas diariamente. Finalizar los experimentos cuando todas las pupupas se han convertido en adultos y contar el número de machos y hembras adultos.</li>
		<li>Registre las fechas de eclosión y muerte y calcule las tasas de mortalidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Longevidad<ol>
<li>Recoger 15 machos adultos y 15 hembras adultas de la generación F1 de cada grupo de dieta. Mantenga a machos y hembras en la misma jaula.</li>
		<li>Alimente a los adultos con una solución de glucosa al 10% ad libitum. Retire a los adultos muertos todos los días.</li>
		<li>Mantener los mosquitos a la misma temperatura, humedad, condiciones del ciclo ligero y régimen de alimentación del azúcar como se describió anteriormente.</li>
		<li>Registre las fechas de defunción y calcule la longevidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medición de la longitud del ala<ol>
<li>Anestetizar mosquitos adultos F1 de cinco días de edad (hombres y hembras) de cada grupo de dieta a -20 oC durante 90 s.</li>
		<li>Debajo de un estereoscopio, agarre suavemente el tórax de cada mosquito con fórceps y colóquelos de lado ventral hacia arriba.</li>
		<li>Recoger ambas alas con un bisturí y colocarlas en un portaobjetos de microscopio limpio que contiene una gota seca de medio de montaje. Con la ayuda de una aguja de 20 G añadir medios de montaje adicionales a los bordes de la cubierta y bajar lentamente el cubreobjetos sobre las alas.</li>
		<li>Mida la longitud del ala(Figura 6)con un estereoscopio utilizando un micrómetro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Sumba, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+oviposition+patterns+of+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+Giles+%28Diptera%3A+Culicidae%29+on+different+types+of+aqueous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Circadian+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates.</a> Journal of Circadian Rhythms. 2, 6(2004).</li>
<li>Baughman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+stable+blood+meal+alternative+for+rearing+Aedes+and+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El éxito de nuestra dieta sin sangre formulada es probablemente el resultado del efecto fisiológico sinérgico de todos los componentes añadidos a la i-liq_diet (rico en azúcar, aminoácidos, vitaminas y microelementos): BSA (fuente de proteína), ATP (fagestimulante) y colesterol (fuente lipídica). La suplementación de la r-liq_diet con los componentes individuales por sí solos no fue eficaz en la estimulación de la producción de óvulos (datos no mostrados). Un inconveniente del protocolo podría ser el costo de algunos de los componentes, como el colesterol. Aún así, su presencia es fundamental, ya que los insectos son incapaces de sintetizarlo19 y esta molécula es el precursor de las hormonas ecdysteroid que regulan la síntesis de yema y la maduración del óvulo en artrópodos20. Se deben probar cantidades más bajas de colesterol para optimizar la cantidad necesaria con el objetivo de reducir los costes y aumentar los beneficios de la dieta artificial.
Otra limitación del método es que la dieta artificial tiene que estar recién preparada a partir de soluciones de stock, ya que una vez preparada en su forma líquida final pierde calidad después del almacenamiento. En el futuro nuestra dieta formulada podría ser preparada como un poder seco, similar a SkitoSnackt, un reemplazo artificial de la comida de sangre para los mosquitos Aedes aegypti 21.
Además de suministrar los nutrientes necesarios, una comida artificial necesita atraer y estimular a los mosquitos hembra según se alimenten de la misma manera que cuando se alimentan de sangre fresca vertebrada. La dieta artificial sin sangre aquí descrita dio lugar a un aumento del 20% en mosquitos hembra completamente engordados en comparación con el grupo alimentado con sangre vertebrada. Esta medida indirecta de atracción podría aclararse aún más mediante el uso de olfactómetros para confirmar que la dieta artificial es más atractiva y más atractiva para los mosquitos que la sangre fresca.
El mayor impacto de la dieta en la mortalidad larval se observó para las larvas derivadas de mosquitos alimentados con sangre, lo que sugiere que una dieta artificial de composición estable puede contribuir a reducir la mortalidad y mejorar el éxito de la reproducción de mosquitos en comparación con la sangre fresca. El resultado menos predecible de una comida de sangre puede surgir de las variaciones del huésped en la composición17 y la presencia en la sangre de moléculas que pueden interferir con la fisiología de mosquitos22. Los hechos anteriores enfatizan las ventajas para la cría de mosquitos de alta calidad de dietas libres de sangre fresca.
En general, el número medio de huevos puestos en nuestro estudio fue bajo en relación con los reportados en algunos insectarios, pero el número medio de huevos ovipositados fue comparable a la cepa criada en laboratorio de A. gambiae alimentada con sangre humana (22,6 x 5,5 huevos/hembra)23. No se observaron diferencias estadísticas significativas entre nuestros grupos experimentales alimentados con sangre fresca o en las comidas artificiales(Tabla 2),lo que sugiere que la implementación de un sistema de alimentación por membrana artificial con nuestra dieta formulada es suficiente para mantener y propagar colonias de mosquitos Anopheles en cautiverio.
Las comidas sin sangre artificiales pueden mantener las colonias de Aedes 22,pero cuando se aplican a los mosquitos Anopheles son de éxito limitado o no11. Recientemente, se describió una comida artificial basada en plasma para los mosquitos Anopheles 24, pero las tasas de alimentación y el potencial reproductivo eran bajas. Nuestros resultados representan un avance sustancial en el estado de la técnica (revisado por Gonzales y Hansen11)ya que nuestro r-liq_diet formulado tenía un rendimiento similar o mejor que la harina de sangre de vertebrado estándar. Las mejoras adicionales en la estabilidad y el costo del almacenamiento deberían ampliar el alcance de su aplicación.

Las enfermedades transmitidas por vectores afectan a varios millones de seres humanos en todo el mundo y causan millones de muertes cada año. Son transmitidos por insectos infectados con microorganismos que producen enfermedades (protozoos, virus) adquiridos cuando se alimentan de sangre de un huésped infectado. Posteriormente, el vector infectado transmitirá el patógeno a un nuevo huésped durante la siguiente comida de sangre. La malaria es la enfermedad transmitida por vectores más mortífera que se transmite por varias especies diferentes de mosquitos Anopheles y afecta al 40% de la población mundial1. El parásito protista del paludismo es responsable de más de 400.000 muertes cada año, de las cuales la mayoría son niños menores de 5 años (Organización Mundial de la Salud). El mosquito hembra Anopheles transmite el parásito de la malaria del género Plasmodium entre humanos y otros animales cuando se alimenta de sangre vertebrada, un paso necesario para la producción y desarrollo de óvulos2.
Las estrategias actuales para la erradicación del paludismo y otras enfermedades mortales emergentes transmitidas por mosquitos se basan en el desarrollo de estrategias innovadoras de control de mosquitos3,4,5, que incluyen la liberación en la naturaleza de un gran número de mosquitos criados en insectarios. Sin embargo, un factor limitante crucial es la dependencia de un suministro de sangre fresca para la cría y la cría efectivas de mosquitos. La composición variable de la sangre de los vertebrados puede afectar negativamente a la fertilidad de los mosquitos y la aptitud de la progenie y puede limitar la fiabilidad y sostenibilidad de las colonias de cría en cautividad. Los programas de liberación y control de mosquitos requieren sistemas de producción de mosquitos a gran escala y un suministro regular de grandes cantidades de sangre de vertebrados. Este es un obstáculo importante para la producción de mosquitos y plantea una serie de cuestiones éticas relacionadas con el uso de animales vivos y limitaciones logísticas causadas por las exigentes regulaciones de seguridad asociadas. Esto hace que los costos de mantenimiento y seguridad de las colonias de mosquitos sean elevados y desafía la sostenibilidad de las prácticas actuales de cría de mosquitos, especialmente en los países de bajos ingresos donde la amenaza del paludismo es mucho mayor.
Recientemente la investigación se ha centrado en el desarrollo de sustitutos de la sangre que imitan una comida de sangre vertebrada pero hasta ahora, sólo se ha logrado un éxito limitado6,7,8,9. Una dieta artificial exitosa necesita (1) provocar un engorgement completo de mosquitos hembra, (2) desencadenar la producción de vitellogenina, (3) producir grandes lotes de huevos viables, y (4) generar progenie pagana10. Además, las dietas artificiales tienen una composición estándar y por lo tanto son más fiables para la producción de mosquitos con fines de investigación y control. Se han desarrollado dietas exitosas sin sangre para los mosquitos Aedes (revisados por Gonzales y Hansen11), pero no para Anopheles spp. Las dietas artificiales existentes contienen un fegoestimulante (por ejemplo, ATP10), una fuente de proteínapara la maduración de óvulos6,12, como fuente de energía, y los aminoácidos (aa)13 que son fundamentales para la producción de óvulos. Una dieta artificial libre de sangre también necesita proporcionar colesterol15, que mejora la producción de huevos. Aquí describimos una dieta artificial libre de sangre para mosquitos Anopheles hembras y demostramos que tiene un rendimiento consistente y equivalente a una comida de sangre vertebrada de alta calidad.

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato (ATP) hidrato de sal disódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A790G</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>MP Biomedicals</td><td>199342</td><td></td></tr><tr><td>Medio de Eagle modificado de Dulbecco (glucosa alta con L-glutamina)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Montaje de Entellan mediano</td><td>Merck</td><td>1079610100</td><td></td></tr><tr><td>Glassfeeder Vidriero</td><td>local</td><td>por diseño</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sodio Salina</td><td>Reac AppliChem</td><td>A3004,0001</td><td></td></tr><tr><td>Imalg&egrave; ne 1000</td><td>Merial, Portugal</td><td>01MER122</td><td></td></tr><tr><td>Aguja 20 G x 1" Aguja 0,9 x 25 mm</td><td>Terumo Europe</td><td>NN-2025R</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6543-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer, Portugal</td><td>7427831</td><td></td></tr><tr><td>Esterilización Millex-HV 0,45</td><td>Millipore</td><td>SLHVR25KS</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 1ml, 27 G x & frac12; " Aguja de 0,4 x 12 mm</td><td>Terumo Europe</td><td>BS-NIN2713</td><td></td></tr><tr><td>Teich Mix Astra Pond</td><td>Astra</td><td>4030733100957</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Goldfish Flakes</td><td>Tetra</td><td>4004218742642</td><td></td></tr></tbody></table>

una dieta sin sangre para criar mosquitos anofelinas

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

La investigación del paludismo requiere condiciones de producción y cría a gran escala para los mosquitos(Anopheles spp.) en cautiverio. La producción sostenible y fiable de mosquitos se ve inhibida actualmente por el suministro de sangre fresca de vertebrados. Se requieren alternativas a la sangre para promover estrategias de control eficientes para el paludismo y otras enfermedades transmitidas por vectores que son transmitidas por insectos que se alimentan de sangre. Con esto en mente, las dietas líquidas artificiales fueron formuladas como sustitutos de la sangre fresca de vertebrados. Aquí informamos de una dieta líquida artificial libre de sangre que proporciona tasas de alimentación similares a la sangre e imita los efectos fisiológicos de una comida fresca de sangre vertebrada. La dieta induce la maduración ovárica y de óvulos de los mosquitos Anopheles y también produce una buena supervivencia larvaria y el desarrollo de adultos funcionales. La dieta líquida libre de sangre formulada es un avance importante hacia la cría sostenible de mosquitos en cautiverio y reducirá los costos de mantenimiento de las colonias de mosquitos y eliminará la necesidad de sangre fresca de vertebrados.

Los resultados descritos a continuación comparan el rendimiento de los mosquitos Anopheles hembraalimentados con la comida artificial rica formulada (r-liq_diet) y los mosquitos alimentados con la dieta líquida inicial (i-liq_diet) o una comida de sangre fresca. La dieta fue probada siguiendo el protocolo esquemático descrito en la Figura 7. El r-liq_diet aquí descrito forma parte de una patente (PCT/IB2019/052967).
Porcentaje de hembras completamente engordadas
El número de mosquitos hembra engordados alimentados con el r-liq_diet (89%) fue significativamente mayor que el número de hembras engordadas alimentadas de sangre (56%) (Figura 8).
Fecundidad y fertilidad
La fecundidad femenina y la fertilidad para el primer ciclo gonotrófico se utilizaron para evaluar la calidad nutricional de la i-liq_diet y r-liq_diet. Las hembras, alimentadas con sangre fresca de vertebrados, pusieron un promedio de 24 a 11 huevos, mientras que las hembras alimentadas con liq_diet puso un promedio de 25 x 5 huevos(Tabla 2). No se observó la puesta de huevos por las hembras alimentadas con la i-liq_diet.
Mortalidad F1
La aptitud de los mosquitos F1 se evaluó entre colonias alimentadas con sangre de vertebrados o la r-liq_diet. Se registraron larvas, pupas y mortalidad adulta. La variabilidad (error estándar de la media [SEM]) fue mayor en los mosquitos alimentados con sangre(Figura 9 y Tabla 2)en relación con los mosquitos alimentados con el r-liq_diet. La generación F1 de mosquitos alimentados con la sangre o la r-liq_diet tenía tasas de mortalidad y supervivencia comparables.
Esperanza de vida de F1
Se estima por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades que los mosquitos hembra adultos salvajes viven hasta por un mes, pero probablemente no sobreviven durante más de 1 a 2 semanas y que los machos viven durante aproximadamente una semana y se alimentan exclusivamente de néctar y otras fuentes de azúcar. Se observa que las diferencias en la ingesta de alimentos parentales pueden afectar la supervivencia de la progenie de mosquitos17. En nuestro experimento, las hembras adultas y los machos en la sangre (mujeres 24,5 x 6,8; hombres de 18,5 a 6,9) y r-liq_diet (hembra: 22,5 x 8,1; hombres: 11,9 x 6,9) los grupos tenían una media de vida media similar(Tabla 3)y las hembras mostraron un aumento de la vida útil en relación con los hombres.
Tamaño del cuerpo F1
La longitud del ala se utilizó como un indicador del tamaño del cuerpo adulto. En comparación con otras especies, los adultos de Anopheles son mosquitos de tamaño pequeño a mediano con una longitud de ala de entre 2,8 y 4,4 mm de longitud de ala18. El tamaño adulto del cuerpo de los mosquitos F1 Anopheles alimentaba el r-liq_diet estaba dentro del rango esperado y era similar a los mosquitos insectarios alimentados con sangre(Figura 10).
Análisis estadístico
Los datos presentados representan la media de al menos tres experimentos independientes (a menos que se indique lo contrario). Las barras de error representan el SEM. Cuando los datos siguieron a una distribución gaussiana, se compararon grupos independientes utilizando la prueba t del estudiante, de lo contrario se aplicó la prueba Mann-Whitney. Las diferencias entre los grupos alimentados por dieta artificial se analizaron utilizando la prueba exacta de Fisher y se consideraron significativas en P a 0,05.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig1a.jpg"> Figura 1: Recolección de sangre de ratón CD1 por punción intracardiaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig2a.jpg"> Figura 2: Aparato de alimentación artificial estándar. El alimentador de vidrio contiene r-liq_diet que se está alimentando a los mosquitos hembra anopheles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig03v3.jpg"> Figura 3: Mosquitos Anopheles después de la alimentación artificial. De izquierda a derecha: una hembra completamente engordada a la que se le ofreció r-liq_diet, hembra no engordada a la que se le ofreció r-liq_diet, macho, y completamente engordada hembra que se le ofreció sangre de ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig03largev3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig04.jpg"> Figura 4: Los huevos de Anopheles pusieron 48 h después de la alimentación de las hembras con la r-liq_diet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig4alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig05.jpg"> Figura 5: Etapas de larvas L2 que se desarrollaron a partir de los huevos y se recogieron en papel de filtro y se colocaron en bandejas que contienen agua destilada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig06.jpg"> Figura 6: Ala derecha de una generación F1 de un mosquito hembra Anopheles coluzzii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig07v3.jpg"> Figura 7: Protocolo esquemático de pruebas de dieta artificial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig07largev3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig08v3.jpg"> Figura 8: Tasas de alimentación de los mosquitos hembra alimentados ya sea las dietas artificiales o la sangre. Los asteriscos indican diferencias significativas entre los mosquitos alimentados con las dietas r-líquida e i-líquida y el grupo de control alimentado con sangre. Prueba exacta de Fisher de dos lados: ****P a 0,0001 (riesgo relativo: 0,4828, 95% nivel de confianza [CL]: 0,3776 a 0,6194) para la dieta r líquida frente a la sangre, *P a 0,0335 (riesgo relativo: 1,379, 95% CL: 1.044 a 1.836) para la sangre isus-líquido. Azul: sin alimentar; rojo: alimentado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig08largev3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig09v3.jpg"> Figura 9: Efecto de la comida sangrienta formulada en la mortalidad y la proporción hombre/mujer de los mosquitos Coluzzii F1 Anopheles. Se realizaron tres experimentos independientes, cada uno con 30 mosquitos por dieta. Una prueba t no emparejada no mostró diferencias significativas entre el grupo alimentado con sangre y el grupo alimentado con liq_diet r (los valoresP variaron de 0.5047 a 0.8491). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig09largev3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60144/60144fig10v3.jpg"> Figura 10: Longitud del ala. La distancia desde la incisión axial hasta la vena R4+5 excluyendo la seta de flecos se utilizó para determinar la longitud del ala. El tamaño se evaluó para 5 hembras y 5 machos de cada grupo dietético (media de SEM). Los valores se representan como la media de sem liq_diet. rojo: sangre vertebrada. Prueba t no emparejada; ala izquierda femenina: t a 1.300, df a 8, P a 0,2298; Ala izquierda macho: t a 2.400, df a 8, P a 0,0432; ala derecha femenina: t a 1.300, df a 8, P a 0,2298; ala derecha macho: t a 2.277, df a 7, P a 0,0569. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60144/60144fig10largev3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componentes</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>*Trifosfato de adenosina</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>*Bovino Suero Albúmina</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td>*Colesterol</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de calcio anhidro</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de colina</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pantotenato D-calcio (vitamina B5)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glucosa anhidra</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nitrato férrico no hidrato</td>
			<td>0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acido fólico</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicina</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>I-inositol</td>
			<td>0.007</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-arginina monohidrocloruro</td>
			<td>0.084</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dihidrocloruro de L-cistina</td>
			<td>0.063</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>0.584</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-histidina monohidrocloruro monohidrato</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-isoleucina</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-leucina</td>
			<td>0.105</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monohidrocloruro de L-lisina</td>
			<td>0.146</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-metionina</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-fenilalanina</td>
			<td>0.066</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-serina</td>
			<td>0.042</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-threonine</td>
			<td>0.095</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-triptófano</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-tirosina disodium sal dihidrato</td>
			<td>0.104</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-valina</td>
			<td>0.094</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfato de magnesio anhidro</td>
			<td>0.098</td>
		</tr>
<tr>
<td>Niacinamida (nicotinamida)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rojo fenol</td>
			<td>0.015</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de potasio</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Monohidrocloruro de piridoxina</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sal sódica con ácido piruvico</td>
			<td>0.011</td>
		</tr>
<tr>
<td>Riboflavina (vitamina B2)</td>
			<td>0.0004</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bicarbonato de sodio</td>
			<td>3.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro de sodio</td>
			<td>6.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato sódico anhidro monobásico</td>
			<td>0.109</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amonohidrocloruro de tiamina (vitamina B1)</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*Sólo en r-liq_diet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: La composición de la dieta i-líquida y la dieta r-líquida.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Número total de huevo (SEM)</td>
			<td>Huevos/hembra (SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sangre</td>
			<td>733 x 330</td>
			<td>24 x 11</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>763 x 164</td>
			<td>25 x 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>i-liq_diet</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Lotes de huevos producidos por hembras Anopheles coluzzii. Se realizaron tres experimentos independientes para cada dieta experimental utilizando 30 mosquitos hembra en cada uno.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Hembras (días - SEM)</td>
			<td>Hombres (días - SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sangre</td>
			<td>24,5 a 6,8</td>
			<td>18,5 x 6,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>r-liq_diet</td>
			<td>22,5 a 8,1</td>
			<td>11,9 x 6,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Esperanza de vida de los mosquitos F1 Anopheles. La longevidad de los mosquitos F1 de F0 alimentados artificialmente se evaluó registrando las fechas de nacimiento y muerte de cada mosquito provenientes del mismo grupo dietético (15 hembras y 15 machos fueron seguidos). Los resultados se representan como la vida media del mosquito por grupo de dieta.

Se presenta un protocolo para la formulación de una dieta artificial libre de sangre para alimentar a los mosquitos Anopheles en cautiverio. Esta dieta tiene un rendimiento similar al de la sangre vertebrada y desencadena la oogénesis y la maduración del óvulo y produce una progenie adulta viable.

Una dieta sin sangre para criar mosquitos anofelinas

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Parásitos del paludismo, como los que cumplen los mosquitos, desempeñan un papel importante en la propagación de la enfermedad. Hasta ahora, ha sido imposible criar mosquitos de malaria sin sangre. Y para superar esta limitación, nuestro protocolo describe una dieta de sucedáneo en sangre que es capaz de apoyar la cría de mosquitos en la insectoría.El uso de la dieta libre de sangre es muy ventajoso sobre la sangre. Una dieta libre de sangre no tiene las limitaciones éticas como el uso de sangre humana, o animales experimentales. Reemplazar animales en experimentación es parte de nuestra política de tres R.Reemplazar, reducir, refinar. El uso de sangre reduce los costos, y la logística asociada con la recolección, almacenamiento y mantenimiento de sangre roja. El uso de dietas artificiales puede facilitar las pruebas de moléculas anti plasmodio.Hasta ahora, hemos probado nuestras dietas utilizando diferentes especies de anopheles. En todas ellas, la dieta estaba bien engordada por las hembras y permitía la producción y puesta de huevos. Creemos que esta dieta tiene un uso potencial para la cría de otras especies de mosquitos.En realidad, ahora lo estamos probando para detectar aedes, un vector de muchas enfermedades como el dengue, el virus zika o la fiebre amarilla. Mantener anopheles coluzzii yaonde colar los mosquitos en una habitación a 26 grados Celsius, 75% de humedad, y bajo un ciclo de oscuridad clara de 12 horas a 12 horas. Los mosquitos de la casa que utilizan las condiciones estándar de insectos en una sola jaula para garantizar el apareamiento.Use una pipeta de plástico para recoger las pupas de mosquitos en un recipiente de agua pequeño. Coloque el recipiente dentro de una jaula de mosquitos para permitir que los mosquitos adultos surjan y se aparejan. Proporcionar 10%solución de alimentación de glucosa en la jaula.Tres días después de la aparición, utilice un aspirador para recoger el número necesario de hembras de la jaula de almacenamiento en una taza de papel. Para distinguir, las hembras son más grandes y los machos tienen una probóscide más ancha y emplumada. Un día antes de los senderos de alimentación, retire la solución de alimentación de 10%glucosa.Al día siguiente, preparar dietas líquidas artificiales en condiciones estériles en el gabinete de flujo laminar según el manuscrito. Agregue todos los ingredientes a un tubo de plástico. Mezcle todos los ingredientes a fondo y filtre con un microfiltro de 0,45 micras.Llene una jeringa estéril de 1 mililitro equipada con una aguja de media pulgada de calibre 27 con 100 microlitros de una miligramo por mililitro de heparina. Luego, anestesia de seis a ocho semanas de edad CD una hembra ratones con ketamina y xilazina utilizando la vía intra peritoneal. Evalúe si el ratón muestra alguna reacción muscular y respuesta a diferentes estímulos físicos.Realice la punción cardíaca. Luego recoge la sangre del ratón en un micro tube y mantén la sangre a 37 grados Celsius en un baño de agua. A continuación, recoger aproximadamente 30 mosquitos hembra de la jaula de almacenamiento utilizando un aspirador.Transfiera los mosquitos hembra a vasos de papel de 500 mililitros y cúbralos con una fina malla de mosquitera para que no puedan escapar. Estirar la membrana del parafilm a través de la boca del alimentador de vidrio para contener la comida. Aplique un aparato de alimentación artificial de campana de vidrio conectado a tubos de plástico en la parte superior de cada taza.Proporcionar un flujo de agua constante a la tubería cilíndrica y alimentador para que la temperatura interior se mantenga en aproximadamente 37,5 grados Celsius. Aplique un mililitro de dieta líquida precalentada a 37 grados centígrados o sangre fresca de ratón en un alimentador de vidrio. Alimente a los mosquitos durante 60 minutos en la oscuridad en 26 grados centígrados.Después de la alimentación artificial, anestesia el frío de los mosquitos a 20 grados centígrados durante 30 segundos. A continuación, coloque los mosquitos en un plato de Petri refrigerado. Registre el número de mosquitos hembra completamente engordados.Separe a 30 hembras completamente engordadas y colóquelas en una nueva jaula. Ahora, coloque un papel de filtro humidificado en la parte inferior de cada jaula. Mantenga a los mosquitos a 26 grados centígrados, 75% de humedad y menos de un ciclo oscuro claro de 12 horas a 12 horas con un 10% de ad libitum de glucosa.A las 96 horas y 120 horas después de la alimentación, cuente los huevos con la ayuda de una lupa de mano. Inundar el papel de filtro con agua destilada para recoger los huevos en bandejas llenas de agua destilada. Alimentar las larvas diariamente con aproximadamente 13 miligramos de alimentos de pescado molido por bandeja.Retire las pupas y larvas muertas con una pipeta de plástico diariamente. Cuando todas las pupas se hayan convertido en adultos, cuente el número de machos y hembras adultos, registre las fechas de eclosión y muerte, y calcule las tasas de mortalidad. Para comprobar la longevidad, recoge 15 machos adultos y 15 hembras adultas de la generación F1 de cada grupo de dieta en una taza de papel.Alimente a los adultos con 10% de solución de glucosa ad libitum. Usa pinzas o un cepillo para eliminar a los adultos muertos todos los días. Mantener los mosquitos a la misma temperatura, humedad, condiciones de ciclo de luz y régimen de alimentación de azúcar.Registre las fechas de defunción y calcule la longevidad. Para medir la longitud de las alas, anestesia en frío a los mosquitos machos y hembras adultos de F1 de cada grupo de dieta a 20 grados centígrados durante 90 segundos. Bajo un estereoscopio, agarre suavemente el tórax de cada mosquito con fórceps y colóquelos hacia arriba.Recoger ambas alas usando un bisturí, y colocarlas en un portaobjetos limpio del microscopio que contenga una gota seca de medio de montaje para su posterior medición utilizando un ocular graduado. Mida la longitud del ala con un estereoscopio utilizando un micrómetro. En este estudio, se comparó el rendimiento de los mosquitos anopheles femeninos alimentados con la rica comida artificial formulada y los mosquitos alimentados con la dieta líquida inicial, o una comida de sangre fresca.El número de mosquitos hembra engordados alimentados con harina artificial rica al 89% fue significativamente mayor que el número de mujeres engordadas alimentadas con sangre al 56%La generación F1 de mosquitos alimentados con la sangre o la comida artificial rica tenía tasas comparables de mortalidad y supervivencia. La variabilidad fue mayor en la sangre alimentada con mosquitos en relación con los mosquitos alimentados con la rica comida artificial. En términos de tamaño corporal adulto, los mosquitos F1 anopheles alimentados con rica comida artificial estaban dentro del rango esperado, y era similar a los mosquitos insectíes alimentados con sangre.En mi opinión, es muy importante montar los alimentadores correctamente con el parafilm parafilm para evitar su ruptura. Si la membrana no está bien unida al alimentador de vidrio, puede perder la comida y probablemente perder algunos de los mosquitos, ya que pueden ser cubiertos por la comida y morir. Nos gustaría realizar un ensayo de atracción de doble elección, por ejemplo, utilizando un olfatometidor para que realmente podamos evaluar si nuestras hembras se sienten más atraídas por la dieta artificial o por la sangre.Además, ahora estamos liofilizando la dieta artificial y estudiando su estabilidad entre diferentes temperaturas durante mucho tiempo. Además de las mejoras obvias en la estabilidad y el almacenamiento en las que hemos estado trabajando, se debe investigar el uso a largo plazo de la dieta sobre la aptitud y la fisiología de los mosquitos. Creo que producir los anófelos sin sangre facilitará la investigación y la implementación inmensamente de vectores de herramientas de control que dependen de un gran número de mosquitos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una vez que un gen es identificado como potencialmente resistente a los virus del dengue, que debe ser evaluado por su papel en la prevención de las infecciones virales en el mosquito. Este protocolo se ilustra cómo la extensión de infecciones de dengue de los mosquitos pueden ser analizados. Las técnicas para el cultivo de los virus en la cultura, la alimentación de los mosquitos membrana de sangre humana, y analizando los títulos virales en el intestino del mosquito se ha demostrado.

Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

Este video muestra las técnicas generales utilizadas para criar Anopheles gambiae en el laboratorio. Los métodos para el cuidado de los mosquitos de laboratorio se ha demostrado en todas las etapas del ciclo de vida del organismo a partir de larvas a pupas a los adultos se alimentan de sangre.

Protocolo para la cría de los mosquitos (A. gambiae)

Para lograr la supresión de la población de Aedes aegypti utilizando el sistema RIDL® (Liberación de Insectos Portadores de un Letal Dominante), es necesario liberar un gran número de mosquitos machos. Esto requiere el uso de técnicas y tecnología de cría masiva para proporcionar sistemas confiables para obtener el máximo número de mosquitos machos de alta calidad.

Producción masiva de Aedes aegypti genéticamente modificados para liberaciones de campo en Brasil

Fuente: Liu, X., et al. Un ensayo de alimentación oral bacteriana con mosquitos tratados con antibióticos. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el agotamiento de la microbiota intestinal nativa en los mosquitos utilizando una solución que contiene sacarosa. A esto le sigue una recolonización controlada con una suspensión bacteriana administrada a través de un sistema de alimentación por membrana para establecer una población bacteriana definida en el intestino del mosquito.

Establecimiento de una población bacteriana intestinal definida en mosquitos adultos

Este video muestra un ensayo de alimentación sanguínea para evaluar la mortalidad y la fecundidad de compuestos de prueba con nuevos modos de acción sobre mosquitos hembra. Esta técnica ayuda a detectar nuevas clases de insecticidas para matar la población resistente de mosquitos y controlar la propagación de enfermedades.

Ensayo de alimentación de mosquitos: un método para evaluar los efectos de los compuestos de prueba sobre la mortalidad y la fecundidad de mosquitos hembra adultos

Los análisis de RNA-Seq son cada vez más importantes para identificar los fundamentos moleculares de los rasgos adaptativos en organismos no modelo. Aquí, se describe un protocolo para identificar genes expresados diferencialmente entre mosquitos Aedes albopictus en diapausa y no diapausa, desde la cría de mosquitos, hasta la secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos de datos de RNA-Seq.

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático, Aedes albopictus

Se desarrolla un protocolo para examinar los efectos de un fármaco epigenético DZNep en el desarrollo, la fecundidad y la supervivencia de los mosquitos.  Aquí describimos los procedimientos para la exposición acuosa de DZNep a mosquitos inmaduros y una exposición sanguínea de DZNep a mosquitos adultos, además de medir la inhibición de la hidrolasa SAH.

Los ensayos toxicológicos para efectos de prueba de un epigenética de Drogas sobre el Desarrollo, Fecundidad y Sobrevivencia de los mosquitos de malaria

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia están siendo liberados en las poblaciones naturales para suprimir la transmisión de arbovirus. Se describen métodos para posterior Ae. aegypti con Wolbachia infecciones en el laboratorio para los experimentos y la liberación del campo, tomar precauciones para reducir al mínimo la selección y adaptación de laboratorio.

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

El protocolo presentado puede determinar la competencia vectorial de las poblaciones de mosquitos Aedes aegypti para un virus determinado, como el Zika, en un entorno de contención.

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

El objetivo de este protocolo es entregar comidas de sangre artificiales y derivadas de animales a los mosquitos Aedes aegypti a través de un alimentador de membrana artificial y cuantificar con precisión el volumen de comida ingerida.

Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti

La administración oral de dsRNA producido por bacterias, un método de administración para la interferencia de ARN (RNAi) que se usa rutinariamente en Caenorhabditis elegans, se aplicó con éxito aquí a mosquitos adultos. Nuestro método permite estudios robustos de genética inversa y estudios de vectores que bloquean la transmisión sin el uso de inyección.

Administración efectiva de ARN oral de interferencia (ARNi) a mosquitos adultos Anopheles gambiae

Aprende a criar mosquitos Anopheles sin sangre mediante una dieta artificial que sustituye la alimentación sanguínea. Este método ético facilita la investigación sobre malaria y mejora la producción de vectores en insectarios.

Una dieta sin sangre para criar mosquitos anofelinas

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