Name: Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende a inducir la diferenciación de las líneas celulares epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4 mediante factores de crecimiento específicos. Este método permite estudiar la relación entre diferenciación y transformación neoplásica en modelos tridimensionales.

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La línea celular HC11 fue proporcionada amablemente por el Dr. D. Medina (Houston, TX). Los autores están agradecidos al Dr. Andrew Craig de queen's University por muchos reactivos y valiosas sugerencias. Las células EpH4 fueron un regalo del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick proporcionó una excelente asistencia técnica para estudios de cultivo 3D.
La asistencia financiera del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), la Fundación Canadiense contra el Cáncer de Mama (CBCF, Capítulo de Ontario), la Alianza Canadiense para la Investigación del Cáncer de Mama , se reconocen con gratitud los Centros de Excelencia de Ontario, el Kingston de Acción contra el Cáncer de Mama (BCAK) y el fondo de legado Clare Nelson a través de subvenciones a LR. BE recibió apoyo de CIHR, CBCF, BCAK y Cancer Research Society Inc. PTG cuenta con el apoyo de una Cátedra de Investigación de Canadá, la Fundación Canadiense para la Innovación, el CIHR, el NSERC y la Sociedad Canadiense del Cáncer. MN fue apoyado por una estudiante del Programa de Entrenamiento Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer de NCIC, un Premio de Posgrado (QGA), y un Premio Dean de la Universidad de Queen. MG fue apoyada por becas postdoctorales del Programa de Cáncer de Mama del Ejército de los Estados Unidos, el Ministerio de Investigación e Innovación de la Provincia de Ontario y el Comité Asesor de Investigación de la Universidad de Queen. VH contó con el apoyo de una beca de doctorado CBCF y una beca postdoctoral del Programa de Capacitación de la Fundación Terry Fox en Investigación Transdisciplinaria del Cáncer en asociación con la CIHR. Hanad Adan fue el receptor de una beca de verano NSERC. La licenciatura fue apoyada por un premio de posgrado de la Universidad de la Reina.

1. Placado de células HC11
<ol><li>En una campana de flujo laminar utilizando técnicas estériles, prepare un frasco con 50 ml de medio celular HC11: RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS), insulina de 5 g/ml y EGF de 10 ng/ml (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Placa de aproximadamente 400.000 celdas por plato Petri de 3 cm: Pasar dos platos Petri de 10 cm, 50% confluentes en veinte platos de 3 cm en medio HC11. Las células deben estar bien esparcidas, pero se debe evitar el secado.<ol>
<li>Aspirar el medio en un matraz utilizando una bomba de vacío.</li>
		<li>Añadir 250 l de tripsina (ver Tabla de Materiales)por placa de 10 cm. Gire y golpee la placa desde los lados mientras la mantiene horizontal para extender la trippsina y desalojar las células unidas</li>
		<li>Observar bajo fase de la microscopía de contraste con un objetivo 4x para asegurarse de que las células han comenzado a separarse de los bordes antes de pipetear.</li>
		<li>Aspirar aproximadamente 1,5 ml de medio HC11 en una pipeta Pasteur estéril de 9 pulgadas y chorro verticalmente contra las células. Gire la placa Petri mientras se revuelve para desalojar todas las células. Debe trabajar rápido para evitar el secado de las células.</li>
		<li>Transfiera todas las células al frasco con el medio HC11 y gire.</li>
		<li>Pipeta 2 ml de suspensión celular en cada plato Petri de 3 cm. Mece los platos Petri transversalmente para esparcirse uniformemente. Coloque las células en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al día siguiente, o cuando las células son de 90-100% confluentes, aspirar el medio, y reemplazarlo con medio con FBS e insulina pero carente de EGF.</li>
</ol>2. Inducción de diferenciación, monitoreo y cuantificación de células HC11
<ol><li>Después de cultivar las células en medio carentes de EGF durante 24 h, añadir el medio de diferenciación (medio HIP) a diez placas de 3 cm: RPMI-1640 suplementada con 10% FBS, 1 g/ml Hydrocortisona (ver Tabla de Materiales),5 g/ml Insulina y 5 g/ml Prolactin (ver Tabla de Materiales)durante un máximo de 10 días.</li>
	<li>Mantenga las otras diez placas de 3 cm como controles: Cambie a un medio con un 10% de FBS y 5 g/ml de insulina que falten EGF y HIP.</li>
	<li>Cambie el medio cada 2-3 días a células y controles tratados con HIP. Pipetear el medio cuidadosamente para asegurarse de que las células no se separan.</li>
	<li>Para monitorear la diferenciación (es decir, la formación de "domes"), observar las células bajo microscopía de contraste de fase(Figura 1A,panel izquierdo). Si las células están expresando proteína de fluorescencia verde (GFP), observe bajo microscopía de fluorescencia (excitación 485/20; emisión a 530/25; aumento 240x; objetivo 20x)(Figura 1A, panel derecho).</li>
	<li>Para cuantificar el grado de diferenciación, extraiga las proteínas de una placa Petri cada una de las células y controles tratados con HIP, una vez al día durante un total de 10 días y sondee las manchas occidentales para la caseína (ver Tabla de Materiales)(Figura 1B).<ol>
<li>Raspa las células sobre hielo con una solución salina tamponada de fosfato helado de 1,5 ml (PBS) en un tubo centrífugo de plástico de 1,8 ml.</li>
		<li>Pellet las células a 350 x g,1 min, 4 oC.</li>
		<li>Lave rápidamente el pellet 2x con PBS helado. Escurra cualquier residuo.</li>
		<li>Hacer un tampón de lisis: 50 mM HEPES (pH a 7,4), 150 mM De NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 g/ml de aprotina, 10 g/ml de leupeptina16. Añadir 100 l por plato de Petri de 3 cm.</li>
		<li>Aclarar el lisado por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos en frío.</li>
		<li>Determinar la concentración de proteínas (ver Tabla de Materiales)y cargar de 10 a 20 g de proteína de cada muestra en un gel de poliacrilamida-SDS al 10%.</li>
		<li>Electroforesa durante 15 h a 45 V, o a 100 V durante 2–2,5 h.</li>
		<li>Transferencia a una membrana de nitrocelulosa o PVDF utilizando un aparato de transferencia electroblotante (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% en solución salina con búfer de Tris con 0,1% de Tween-20 (TBST).</li>
		<li>Añadir el anticuerpo primario, cabra anti-caseína diluida 1:2,000 o ratón anti-a actina diluida 1:1,000 (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Lavar 3 veces con TBST, 5 min cada vez.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo secundario, el rábano picante peroxidasa (HRP) vinculado burro anti-cabra diluido 1:2,500, o HRP vinculado anticuerpo anti-ratón caballo diluido 1:10,000.</li>
		<li>Lavar 3 veces con TBST, 5 min cada vez.</li>
		<li>Añadir reactivos ECL a la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Plating y crecimiento 3D de células EpH4 en EHS Matrix
NOTA: La matriz es líquida a temperaturas <10 oC y sólida a temperaturas superiores. Conservar a -80oC. Descongelar a 4oC la noche antes de su uso. Enfríe previamente las placas de cultivo de tejido y las puntas de las pipetas a -20 oC antes de manipular y mantenga las puntas de la matriz, las placas y las pipetas en el hielo para evitar que se solidifique.
<ol><li>Cultivar células EpH4 en 2D en medio RPMI-1640 con 10% de FBS y 5 g/ml de insulina (no se requiere EGF).</li>
	<li>Preparar el medio de crecimiento EpH4 complementado con una matriz de 10% (v/v, 3.500 l) o 20% (v/v 2.000 l) en dos tubos cónicos de 50 ml. Mantener en hielo hasta que esté listo para usar.</li>
	<li>Recubrir 10 pocillos (1 cm2 cada uno) de una placa de 24 pocillos con 150 ml de matriz sin diluir. Extienda la matriz con una punta de pipeta. Evite crear burbujas. Toque suavemente los lados de la placa mientras la sostiene horizontalmente para asegurarse de que la matriz se distribuye uniformemente a través de la parte inferior del pozo.</li>
	<li>Incubar la placa de 24 pocillos a 37oC durante 1 h para permitir que la matriz se solidifique.</li>
	<li>Pruebe las células EpH4 como se describió anteriormente para las células HC11 y cuente con un hemocitómetro. Transfiera 5 x 104 células por pozo a un tubo centrífugo cónico estéril de 1,5 ml y gire a 250 x g durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente el medio y colocar el tubo sobre hielo.</li>
	<li>Resuspenda las células en un medio de crecimiento EpH4 de 350 oL complementado con una matriz del 20% utilizando una punta de pipeta de 1 ml mientras mantiene el tubo cónico sobre hielo. Evite las burbujas. Es importante asegurar una suspensión de una sola célula.</li>
	<li>Una vez que la matriz de la capa inferior se haya solidificado (la matriz debe aparecer translúcida y de color más claro en comparación con el recubrimiento inicial de los pozos), agregue los 350 s de suspensión celular a cada pocato recubierto y colóquelo en una incubadora de CO2 a 37 oC para el número 1 h para permitir que la capa de matriz del 20% se solidifique.<ol>
<li>Observe las células microscópicamente bajo contraste de fase con un objetivo 4x. Las celdas individuales deben ser visibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 200 sl de medio EpH4 que contenga una matriz del 10% encima de los 350 s de células suspendidas en una matriz del 20%. Incubar a 37oC.</li>
</ol>4. Inducción de diferenciación de células EpH4 cultivadas en 3D(Figura 2)
NOTA: Además de la diferenciación, las células EpH4 también pueden someterse a tubulogénesis cuando se estimulan con HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) en el cultivo 3D. Los crecimientos tubulares se pueden ver después de 10 días de estimulación de HIP y HGF.
<ol><li>Comenzar la inducción de diferenciación de las células EpH4 1 día después del enchapado en la matriz. Retire con cuidado 150 s l de medio superior que contenga una matriz del 10% de los pozos utilizando una punta de pipeta de plástico. Añadir 200 sL de medio EpH4 que contenga HIP y matriz del 10%.</li>
	<li>Reemplace el medio de matriz-HIP del 10% cada 2 días durante un máximo de 10 días. Cultivar células de control en el mismo medio de matriz 10% sin HIP.</li>
	<li>Supervisar la formación de mamesferas bajo contraste de fase(Figura 3A,panel inferior).</li>
</ol>5. Inducción de tubulogénesis de células EpH4 cultivadas en 3D(Figura 3A y 3C)
<ol><li>Prepare 24 placas de pozo y células EpH4 para el crecimiento en matriz como se detalla en los pasos 3.1–3.9. El día después de enchapar las células en la matriz, retire 150 ml de medio EpH4 que contenga una matriz del 10% de los pozos utilizando una punta de pipeta de plástico. Añadir 200 l de medio EpH4 que contenga una matriz del 10%, HIP y 20 ng/mL HGF (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Reemplace el medio de matriz/HIP/HGF del 10% cada 2 días durante un máximo de 12-14 días.</li>
	<li>Supervise la formación de túbulos microscópicamente utilizando un objetivo de 20x o 40x(Figura 3A,panel derecho).</li>
</ol>6. Cantidad de diferenciación: Western Blotting para la caseína
<ol><li>Pipetear cuidadosamente el medio de matriz-HIP del 10% de los pozos. Enjuague la capa de matriz 20% 2x con 350 s de PBS helado. Los esferoides todavía deben estar presentes en la capa de matriz.</li>
	<li>Añadir entre 700 y 1.000 ml de PBS helado con ácido etilendiaminetetraacético de 1 mM (EDTA) directamente en los pozos. Separe suavemente la capa inferior de la matriz 100% del pozo con una punta de pipeta para recuperar los esferoides presentes en esa capa. Agitar suavemente durante 30 min a 4oC.</li>
	<li>Transfiera cuidadosamente la suspensión esferoide a un tubo cónico. Enjuague los pozos con 500 ol de PBS-EDTA para recuperar los esferoides restantes en los pozos y añadirlos al tubo cónico.</li>
	<li>Roca sobre hielo durante 30 minutos adicionales. Asegúrese de que la matriz se haya disuelto por completo. Si se ven grumos de matriz visibles, agregue más PBS-EDTA o agite más tiempo.</li>
	<li>Centrifugar la solución para peletizar los esferoides a 350 x g durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, licre rofher los esferoides en tampón de lisis helada, y sonda para la caseína, la ciclina D1 y p120RasGAP por la hincha occidental como en el paso 2.5 por encima de16. Como anticuerpos primarios, utilizar la cabra anti-caseína diluido 1:2,000, conejo anticiclina D1 diluido 1:2,000, y ratón anti-p120 diluido 1:2,000. Para los anticuerpos secundarios, utilice anti-cabra de burro vinculado a HRP diluido 1:2,500, HRP vinculado burro anticonejo diluido 1:2,500, y HRP vinculado caballo anti-ratón diluido 1:10,000.</li>
</ol>

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<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+novel+regulatory+role+of+Ezrin+in+promoting+breast+cancer+cell+invasion+and+metastasis%22">A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis</a>. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Las células HC11 son ideales para el estudio de la diferenciación en combinación con la transformación neoplásica. Una ventaja añadida es que las células HC11 son fácilmente infectables con vectores retrovirales basados en Mo-MLV para expresar una variedad de genes. En nuestras manos, las células EpH4 eran más difíciles de infectar con los mismos vectores retrovirales que HC112.
El contacto entre células y el detención del crecimiento son requisitos previos clave para l...

En los tejidos normales o tumores, las células tienen amplias oportunidades de adhesión a sus vecinos en una organización tridimensional, y esto es imitado en el cultivo por el crecimiento celular de alta densidad. La adhesión de célula a célula se media principalmente a través de receptores de cadherina, que definen la arquitectura celular y tisular. Curiosamente, recientemente se demostró que las cadherinas también desempeñan un papel poderoso en la transducción de señales, especialmente en la señalización de supervivencia1. Paradójicamente, algunas de estas señales de adhesión de célula a célula que emanan de las cadreínas se encontraron recientemente compartidas tanto por diferenciación como por neoplasia2. Aquí, describimos métodos de inducción y evaluación de la diferenciación en dos tipos representativos de líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4.
La línea celular epitelial de la mama de ratón HC11 puede proporcionar un modelo útil para el estudio de la diferenciación de células epiteliales. Las células HC11 son una línea celular derivada de COMMA-1D, que se origina en la glándula mamaria de un ratón Balb/c de embarazo medio3. A diferencia de otros clones derivados de COMMA-1D, el clon HC11 no tiene ningún requisito para añadir exógenamente matriz extracelular o cocultivo con otros tipos de células para la inducción in vitro del gen endógeno de caseína por hormonas lactogénicas3. Esta línea celular se ha utilizado ampliamente en estudios de diferenciación porque ha conservado características importantes del epitelio mamario normal: las células HC11 pueden reconstituir parcialmente el epitelio ductal en una almohadilla de grasa mamaria clara4. Por otra parte, se pueden diferenciar en un cultivo bidimensional (2D) cuando se cultivan a la confluencia unida a una superficie de plástico de plato de Petri en presencia de un esteroide como Hydrocortisona o Dexametasona, además de Insulina y Prolactina (medio HIP) carente de factor de crecimiento epidérmico (EGF), un inhibidor de la diferenciación5,6,7. En estas condiciones, las células HC11 producen proteínas lácteas como la caseína y la WAP, que son detectables por la hincha occidental dentro de los 4 días siguientes a la inducción. Al mismo tiempo, una porción de células HC11 forma estructuras rudimentarias mamarias similares a las glándulas denominadas "domes" de una manera estocástica. Las cúpulas son visibles de 4 a 5 días después de la inducción y aumentan gradualmente de tamaño hasta el día 10, concomitantes con un aumento en la producción de caseína8. Curiosamente, las células HC11 poseen mutante p539, y por lo tanto representan un estado preneoplásico. Por esta razón, el modelo HC11 es ideal para estudiar redes de señalización de diferenciación en conjunto con neoplasia en el mismo sistema celular.
Las células EpH4, un derivado de las células IM-2, son una línea celular no tumorigénica originalmente derivada de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c de embarazo medio10. Las células EpH4 forman monocapas epeliales continuas en el cultivo 2D, pero no se diferencian en estructuras glandulares10,11. Sin embargo, después del crecimiento 3D en un material que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón EHS12 (matriz EHS, matriz o Matrigel, ver Tabla de materiales),además de la estimulación con HIP, las células EpH4 pueden recapitular las etapas iniciales de diferenciación de la glándula mamaria. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides (también llamados mamesferas) que exhiben polaridad apical-basal y un lumen hueco, y son capaces de producir las proteínas lácteas-caseína y WAP, similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes lactantes lactantes. Contrariamente a las células HC11, que son indiferenciadas, y algunas expresan marcadores mesenquimales13, las células EpH4 exhiben una morfología puramente luminal14. Las células EpH4 también se han divulgado para producir proteínas de la leche en el cultivo 2D a través de la estimulación con dexametasona, insulina, y prolactina15. Sin embargo, este enfoque impide el estudio de los efectos reglamentarios que imitan el microambiente de la glándula mamaria en el cultivo 3D.

<table><tbody><tr><td>Solución de acrilamida al 30%/Bis</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ciclina D1</td><td>conejo, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-p120</td><td>anticuerpo ratón, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; ratón de anticuerpos de actina</td><td>, tecnología de señalización celular</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-y beta; anticuerpo de caseína</td><td>cabra, Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Solución de ácido bicinconínico</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC Determinación de</td><td>proteínas</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td> Bio <td>Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Determinación de proteínas</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Sustrato</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td> Western <td>Blotting</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML Determinación de</td><td>proteínas</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Tinción</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Tinción</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Medio para células HC11 Suero</td></tr><tr><td>fetal de ternero</td><td>PAA</td><td>A15-751 Medio de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Cabra- Anti Conejo-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de hepatocitos recombinante</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Caballo Anti-Ratón</td><td>Tecnología de señalización celular HRP</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Insulina media</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP Medio</td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>BioGard Campana</td><td></td> de cultivo <td>celular</td></tr><tr><td>Leupeptina</td> Bio <td>Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Matriz tampón de lisis</td></tr><tr><td>(matriz Engelbreth-Holm-Swarm, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Anti-Cabra HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 Reactivo</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>Tinción</td></tr><tr><td>Microscopio confocal multifotónico</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>Nikon cámara digital Nikon</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulosa</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase</td> de tinción <td>Olympus IX70</td><td></td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsufonilo</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolactina</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Medio</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Célula medio de cultivo</td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos-24 pocillos,</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>Aparato</td></tr><tr>de<td>transferencia</td> de cultivos <td>celulares, CBS Scientific Co</td>, <td>EBU-302</td><td>Western Blotting</td></tr>, <tr><td>Tris Acetato</td><td>Bio Shop</td>, <td>TRA222.500</td>, <td>Western Blotting,</td></tr><tr><td>Trypsin</td>, <td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td> Western <td>Blotting</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis de gel verítico</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blotting</td></tr></tbody></table>

diferenciación de células epiteliales de mama de ratón hc11 y eph4

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Las cadherinas desempeñan un papel importante en la regulación de la diferenciación celular, así como la neoplasia. Aquí describimos los orígenes y métodos de la inducción de la diferenciación de dos líneas celulares epiteliales de mama de ratón, HC11 y EpH4, y su uso para estudiar etapas complementarias del desarrollo de la glándula mamaria y la transformación neoplásica.
La línea celular epitelial de la mama del ratón HC11 se originó a partir de la glándula mamaria de un ratón Balb/c embarazada. Se diferencia cuando se cultiva para confluencia unida a una superficie de plástico de la placa Petri en medio que contiene suero de ternero fetal y Hydrocortisona, Insulin y Prolactin (medio HIP). En estas condiciones, las células HC11 producen las proteínas lácteas-caseína y proteína ácida de suero de leche (WAP), similares a las células epiteliales mamarias lactantes lactantes, y forman estructuras rudimentarias similares a las glándulas mamarias llamadas "domes".
La línea celular EpH4 se deriva de células epeliales de la glándula mamaria de ratón inmortalizadas espontáneamente aisladas de un ratón Balb/c embarazada. A diferencia de HC11, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en esferoides (también llamadas mamesferas) cuando se cultivan en condiciones de crecimiento tridimensionales (3D) en medio HIP. Las células son trippsinizadas, suspendidas en una matriz del 20% que consiste en una mezcla de proteínas de matriz extracelular producidas por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), chapadas encima de una capa de matriz concentrada que recubre una placa de plástico Petri o placa multipocilíndor, y se cubren con una capa de 10% de medio HIP que contiene matriz. En estas condiciones, las células EpH4 forman esferoides huecos que exhiben polaridad apical-basal, un lumen hueco, y producen la caseína y el WAP.
Utilizando estas técnicas, nuestros resultados demostraron que la intensidad de la señal de la cadherina/Rac es fundamental para la diferenciación de las células HC11. Mientras que Rac1 es necesario para la diferenciación y bajos niveles de RacV12 activado aumentar la diferenciación, altos niveles de RacV12 bloquean la diferenciación mientras que induce neoplasia. Por el contrario, las células EpH4 representan una etapa anterior en la diferenciación epitelial mamaria, que se inhibe incluso por niveles bajos de RacV12.

Durante mucho tiempo se ha sabido que la diferenciación de células epiteliales y adipocitos requiere confluencia y compromiso de las cadherinas2. Nosotros y otros demostramos que la adhesión de célula a célula y el compromiso de E- o N-cadherin y cadherin-11, como ocurre con la confluencia de células cultivadas, desencadena un aumento dramático en la actividad de las pequeñas GTPases Rac y la proteína de control de división celular 42 (Cdc42), y este proceso conduce a la activación de las citoquin...

Describimos técnicas para la inducción de diferenciación de dos líneas epiteliales mamarias, HC11 y EpH4. Mientras que ambos requieren suero de ternero fetal, insulina y prolactina para producir proteínas de la leche, las células EpH4 pueden diferenciarse completamente en mamesferas en cultivo tridimensional. Estos modelos complementarios son útiles para estudios de transducción de señales de diferenciación y neoplasia.

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Las células HC11 y EpH4 son líneas celulares epiteliales mamarias de ratón que pueden diferenciarse en el cultivo. Al mismo tiempo, estas células pueden ser transformadas por un número de oncogenes. Estas células son ideales para el estudio de la interrelación entre la diferenciación y la transformación neoplásica.Estas técnicas se pueden utilizar en estudios de transducción de señales para descubrir objetivos para la terapia contra el cáncer. Por ejemplo, la pequeña GTPase Rac y otras moléculas pueden desencadenar la transformación de las células epiteliales mamarias cuando se expresan a niveles altos, pero sorprendentemente a niveles bajos, pueden inducir la diferenciación. Otros transductores de señal pueden comportarse de manera similar.Los principios pueden aplicarse a otros tipos de diferenciación, así cuando la confluencia celular juega un papel importante, por ejemplo la diferenciación de adipocitos o miotubos. Alguien que realiza esta técnica por primera vez debe tener en cuenta que el revestimiento de las células HC11 es importante. Esto se debe a que el contacto de celda a célula es importante para la diferenciación.Otro punto a tener en cuenta es que la extracción adecuada de células EpH4 de la matriz es crítica para la cuantificación de proteínas porque cualquier residuo afectará la determinación de proteínas. La demostración visual de este método es útil porque algunos detalles del protocolo son difíciles de describir en papel. Comience preparando una botella de 50 mililitros de medio celular HC11 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Para placar las células, aspirar el medio de cinco platos de Petri de seis centímetros 50% confluentes y lavar las células con aproximadamente 1,8 mililitros de tripina utilizando una pipeta Pasteur estéril de algodón de nueve pulgadas enchufada. Luego agregue 200 microlitros de trippsina por placa y gire la placa para desalojar las células conectadas. Observe la microscopía de contraste de las células bajo fase con un objetivo 4X para asegurarse de que han comenzado a desalojarse.Luego aspirar aproximadamente 1,5 mililitros de hc11 medio con una pipeta Pasteur estéril de nueve pulgadas y chorro verticalmente contra las células mientras gira el plato asegurándose de evitar salpicaduras. Transfiera todas las células al frasco con HC11 medio y arremolina para dispersarse uniformemente en el frasco. Luego aliquot la suspensión celular en 20 tres centímetros Petri platos por pipetear dos mililitros de células por plato.Mece los platos de Petri para esparcir las células e incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, cuando las células sean de 90 a 100% confluentes, aspire el medio y reemplácelo por medio con FBS pero sin EGF. Después de cultivar las células en medio sin EGF durante 24 horas, añadir el medio de diferenciación a 10 platos y cultivar las células durante un máximo de 10 días manteniendo los otros 10 platos como controles.Cambie el medio cada dos o tres días con las células tratadas con HIP y de control. Para monitorear la diferenciación, observe las células con microscopía de contraste de fase. Utilice microscopía de fluorescencia si las células expresan proteína fluorescente verde.Además, cuantificar el grado de diferenciación mediante la extracción de proteínas de las células tratadas y de control de HIP una vez al día y la realización de análisis de Western Blot. Reúna y coloque el medio de crecimiento EpH4, la matriz EHS y dos tubos cónicos de 50 mililitros sobre hielo. Precaer las placas de cultivo de tejido con puntas de pipeta a menos 20 grados Celsius y preparar el medio de crecimiento EpH4 complementado con matriz de 10 o 20% en dos tubos cónicos de 50 mililitros y mantenerlos en hielo hasta que estén listos para usar.Después de recuperar las placas de cultivo de tejido prechilled a menos 20 grados Celsius, cubra 10 pozos de la placa de 24 pozos con 150 microlitros de matriz sin diluir esparciendo la matriz con una pipeta. Evite crear burbujas al esparcir la matriz. A continuación, toque suavemente los lados de la placa e incubar la placa a 37 grados Celsius durante una hora para permitir que la matriz se solidifique.Mientras tanto, prepárese para la diferenciación mediante la trippsina de las células EpH4, así como se describió previamente y asegurando suspensiones de una sola célula después de la resuspensión de las células trippsinas. A continuación, cuente las células en suspensión con un hemocicómetro. Transfiera cinco veces 10 a las cuatro células por pozo a un tubo de centrífuga cónica estéril de 1,5 mililitros y gíselas a 250 veces g durante cinco minutos.Aspirar cuidadosamente el medio sobrenadante y colocar el tubo sobre hielo. Utilice una punta de pipeta de un mililitro para resuspender las células en 350 microlitros del medio de crecimiento EpH4 complementados con matriz de 20%mientras mantiene los tubos en hielo asegurándose de evitar burbujas. Una vez que la capa inferior se haya solidificado, agregue los 350 microlitros de suspensión celular a cada pozo recubierto y colóquelo en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante una hora para permitir que la capa de matriz del 20% se solidifique.Observe las células con microscopía de contraste de fase para asegurarse de que las células individuales son visibles. A continuación, añadir 200 microlitros de EpH4 medio con matriz de 10% en la parte superior e incubar la placa a 37 grados Centígrados. Comience la inducción de diferenciación un día después de encoar las células en la matriz.Retire cuidadosamente 150 microlitros de 10% medio de matriz superior y agregue 200 microlitros de medio EpH4 que contengan HIP y matriz del 10% y para los controles agregue un medio de matriz del 10% sin HIP. Sustituya el medio cada dos días durante un máximo de 10 días de monitorización de la formación de la mamosfera por microscopía de contraste de fase. Para cuantificar la diferenciación, pipetee cuidadosamente el medio HIP de 10%matriz de los pozos y enjuague la capa de matriz del 20% con 350 microlitros de PBS frío.A continuación, agregue de 70 a 100 microlitros de PBS helado con un EDTA mililolar directamente en los pozos y desenganche suavemente la capa inferior de 100% matriz con una punta de pipeta. Agitar suavemente el plato a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Transfiera cuidadosamente la suspensión del esferoide a un tubo cónico y enjuague los pozos con 500 microlitros de PBS EDTA para recuperar los esferoides restantes.Mece el tubo sobre hielo durante 30 minutos adicionales asegurándose de que la matriz se disuelva por completo. Si se ven grumos de matriz visible, agregue más PBS EDTA o agite más tiempo. Centrifugar la solución a 350 veces g para peletizar los esferoides.A continuación, aspirar el sobrenadante,lyse los esferoides, y sondear las células para beta-caseína, ciclina D1, y p120RasGAP por hinchazón occidental. Hay una sorprendente dependencia de la diferenciación sobre la fuerza de la señal Rac en las células HC11. Mientras que el CRAC1 endógeno es necesario para la diferenciación y los bajos niveles de RacV12 activado mutacionalmente causan un aumento en la capacidad de diferenciación, los altos niveles de RacV12 desencadenan un bloque de diferenciación e inducen neoplasia.Cuando se exploraron las propiedades de diferenciación de las células EpH4 en un cultivo de matriz 3D, se encontró que la producción de beta-caseína alcanzó un máximo de ocho a 10 días y la expresión de la ciclina D1 fue máxima a los cuatro a seis días después de la estimulación hip. Para determinar el posicionamiento de las células individuales, se teñiron con DAPI y se tomaron imágenes con microscopía confocal. La muerte celular interna y la formación de lúmenes huecos se observaron en las mamosferas, mientras que la adición de HGF dio lugar a la formación de estructuras tubulares.Alguien que realiza esta técnica por primera vez debe tener en cuenta que el revestimiento de las células HC11 es importante. También la extracción adecuada de las células EpH4 de la matriz es fundamental para la cuantificación de proteínas porque cualquier residuo afectará la determinación de proteínas. Esta técnica se puede utilizar para investigar otros transductores de señal que pueden comportarse de manera similar.Si hay mutaciones del conductor en un cáncer, entonces su inhibición completa no será necesaria ya que los niveles bajos restantes realmente inducirían la diferenciación.

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Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

HC11 diferenciación lactogénica se caracteriza por la formación de estructuras abovedadas conocida como mammospheres. Las estructuras se pueden enumerar por microscopía de contraste de fases para ayudar en la cuantificación de la diferenciación lactogénica.

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Aprende a inducir la diferenciación de las líneas celulares epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4 mediante factores de crecimiento específicos. Este método permite estudiar la relación entre diferenciación y transformación neoplásica en modelos tridimensionales.

Diferenciación de células epiteliales de mama de ratón HC11 y EpH4

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