Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

Micro-Aspiración de célula única es un método para complementar las diferentes técnicas utilizadas en el campo de la microbiología en general y en la virología en particular. Podría responder a preguntas clave y resolver problemas encontrados durante el aislamiento de virus gigantes separando un virus de una mezcla viral presentando un virus de baja abundancia, ya que era el caso de los virus de rotación, virus clandisinal, y el virus uzibati de otro, que es Faustovirus, presente en alta abundancia de todos modos. La principal ventaja de este enfoque es el uso de una estrategia indirecta.

Consiste en separar y clonar el huésped infectado para obtener una separación viral. Por lo tanto, este método monitorea los diferentes pasos desde la captura hasta la liberación de células y confirma el proceso de clasificación mediante la observación microscópica. Finalmente, la biología molecular se utiliza para confirmar la clasificación y la microscopía electrónica para observar las partículas virales separadas.

Este enfoque resolverá el principal problema de la separación de virus. Es una perspectiva para clonar ameba o clonar protistas en general. La persona que está tratando de utilizar esta técnica por primera vez debe ser rigurosa y precisa al controlar la presión.

El control visual es esencial para confirmar la captura y la liberación de una sola celda. Utilice Vermamoeba Vermiformis, cepa CDC 19, como soporte celular. Añadir 30 mililitros de PYG medio y tres mililitros de la ameba a una concentración de una por diez a las sextas células por mililitro en un matraz de cultivo celular de 75 centímetros cuadrados.

Mantener el cultivo a 28 grados centígrados en una incubadora. Después de 48 horas, transfiera 10 mililitros del cultivo celular de la ameba a un tobogán de conteo y colóquelo bajo un microscopio para cuantificar la ameba. Para enjuagar, cosechar 30 mililitros del cultivo celular en un tubo y peletizar la ameba por centrifugación a 720 veces G durante 10 minutos.

Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en el volumen adecuado de medio de inanición para obtener la concentración de una por 10 a las sextas células por mililitro. Preparar el soporte celular con la adición de agente antimicrobiano. En un gabinete de bioseguridad, agregue una vez 10 al sexto de la cultura de la ameba en dos mililitros de medio de hambre.

A continuación, inocular 100 mililitros de la solución de stock que contiene la mezcla de virus en el soporte de cultivo celular de amebae en una multiplicidad de infección de 0,01. Incubar el soporte de cultivo celular de amebas infectadas. Añadir 30 grados Celsius durante 10 a 14 horas o hasta que se induzcan efectos citopáticos como el redondeo de amebales o la lelisis.

A continuación, utilice una jeringa para recoger el medio y filtrar a través de un filtro de cinco micras para eliminar los desechos celulares. Realizar una dilución de cereales de la muestra viral en medio de inanición en diferentes pozos. Inocular dos mililitros de uno por 10 hasta el sexto Vermamoba Vermaformis contenidos en cada plato Petri con 100 mililitros de la mezcla de inóculo.

A continuación, coloque los platos de Petri en una bolsa de plástico sellable a 30 grados centígrados. A las seis horas después de la infección, observe los platos de Petri con microscopía óptica invertida y compruebe la morfología celular cada cuatro a ocho horas. El tratamiento antimicrobiano es para el soporte celular.

Seleccionar entre los platos petri los que no existen de cualquier contaminación visual por agentes fúngicos y bacterianos y con evidencia de efecto citopático de las amebas debido a los virus y con pre-lysis y fase de redondeo de la amebae para evitar la aspiración de partículas virales. Configure una estación de trabajo con micromantenidor, dispositivo de presión de control manual, microscopio invertido, módulos Plug and Play Motor, cámara y módulo de computadora. Elija un micro capilar de 20 micras de diámetro interior para permitir el mantenimiento de una posición interna y una fácil liberación de la célula.

Fije el ángulo de funcionamiento del sistema de agarre en el módulo motorizado a 45 grados. Realizar una doble instalación, primero en el sistema de agarre y luego en el micro capilar. Concéntrate en las células.

Para clonar células, coloque el plato Petri que contiene dos mililitros de amebas infectadas bajo el microscopio. Concéntrese primero en las células y luego en el micro capilar sumergido en el cultivo. Recoger una célula única redondeada y acercar el micro capilar al micromaniprulador.

Ejercer aspiración suave con control de presión manual en la célula que lo toma dentro del micro capilar Retire la célula única de la primera muestra y suéltela en el soporte de cultivo celular de la amebae. Luego incubarlo a 30 grados centígrados. Controle cuidadosamente la presión para poder aspirar una sola célula y controlar su aspiración mediante la observación de la liberación de una sola célula.

Realizar observaciones diarias con un microscopio óptico invertido para observar la apariencia de las células y monitorear la aparición del efecto citopático. Ahora opera un sistema automatizado de extracción para extraer ADN de parte de las muestras de cultivo positivo donde se observa un efecto citopático. Diseñe imprimaciones para amplificar genes pobres anotados como RBP2 para Faustovirus, proteína cápsida principal para Usurpatvirus y proteína capsid menor para Clandestinovirus.

Realice la PCR estándar utilizando un termociclador según el manuscrito. Realice 20 microlilitros de reacciones PCR con 50 micromolares de cada imprimación, 1X Master Mix y agua libre ribonucleasa. Ejecute los productos PCR con mancha de gel de ADN en un gel de 1,5% de agarosa a la tensión de 135 voltios y visualice con UV. Este protocolo optimiza un proceso de micromanipulación con micro aspiración de una sola célula.

Esta técnica permite la captura de una ameba redondeada e infectada y su liberación en una placa novedosa que contiene amebas no infectadas. Este enfoque aisló con éxito un nuevo virus gigante de baja abundancia llamado Userpatvirus LCD7. Su Userpatvirus sólo se observó en el clon siete con presencia de ADN Userpatvirus LCD7 y ausencia de ADN de Faustovirus.

La microscopía electrónica reveló la aparición del Clandestinovirus ST1, que tiene una morfología icosadral típica sin fibrillas, así como Usurpatvirus LCD7 con una capsida icosahedral de unos 250 nanómetros. La baja citometría confirma la superposición de poblaciones de Faustovirus y Nauvoirus. Una vez dominado, este procedimiento se puede hacer fácilmente.

Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es la necesidad de un ritual mínimo de observaciones sobre el tamaño de las entidades con el buen manejo del competente de la estación de trabajo y la comprobación de cualquier problema de contaminación. Este enfoque se puede utilizar como una técnica de clasificación sobre la base de la morfología celular. Actualmente se utiliza en nuestro laboratorio para la clonación de ameba específica.

Un punto crítico de esta técnica es mantener la integridad celular. De hecho, podemos tener algunos problemas con la no observación de la célula o liberación. Esto se debe principalmente a la desintegración de la célula en el micro capilar.

Este método podría ser una alternativa eficaz cuando la telemetría de defectos y la ordenación de hechos no están disponibles y cuando se alcanzan limitaciones técnicas específicas. No olvide que en algunos casos la célula no se libera del micro capilar. Esto se debe en parte a las características de la ameba y su capacidad de adaptación y luego de la membrana celular.