Name: Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende la técnica de microaspiración de células únicas para separar subpoblaciones virales de baja abundancia usando Vermamoeba vermiformis. Este método permite aislar nuevos virus gigantes como Usurpatvirus LCD7 con alta precisión.

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Los autores quieren agradecer a Jean-Pierre Baudoin y Olivier Mbarek por sus consejos y a Claire Andréani por su ayuda en correcciones y modificaciones en inglés. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Estado francés gestionada por la Agencia Nacional de Investigación en el marco del programa "Investissements d'avenir (Inversiones para el Futuro)" con la referencia ANR-10-IAHU-03 (Infección Méditerranée) y por Région Alpes Provence Provence Costa Azul y financiación europea FEDER PRIMI.

1. Cultura de amebas
<ol><li>Utilice Vermamoeba vermiformis (strain CDC19) como soporte celular.</li>
	<li>Añadir 30 ml de proteasa-peptona-levadura extracto-glucosa medio (PYG) (Tabla 1) y 3 ml de la ameba ebae a una concentración de 1 x 106 células/ml en un matraz de cultivo celular de 75 cm2.</li>
	<li>Mantener la cultura a 28oC.</li>
	<li>Después de 48 h, cuantifique las amebas usando diapositivas de conteo.</li>
	<li>Para enjuagar, cosechar las células a una concentración de 1 x 106 células/ml y peletizar la amebae por centrifugación a 720 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en el volumen apropiado de medio de hambre para obtener 1 x 106 células/ml(Tabla 1).</li>
</ol>2. Propagación del virus de las poblaciones en Amebae
NOTA: Antes de la dilución, es importante cultivar la muestra de stock para obtener suficiente cultivo fresco, luego proceder a la filtración.
<ol><li>Utilice 1 x 106 de cultivo de ameba en el medio de inanición.</li>
	<li>Inocular la mezcla de virus emitidos a partir de la solución en stock (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 o Faustovirus/Clandestinovirus ST1) después del proceso de cocultivo en el soporte celular a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. NOTA: El MINISTERIO de Tarifas es importante para reducir la abundancia de la población viral principal y el número de células infectadas.</li>
	<li>Incubar a 30oC hasta que se induzquen efectos citopáticos (CPE), como redondeo amoebal o lisis, aproximadamente de 10 a 14 h después de la infección.</li>
	<li>Recoger el medio y filtrar a través de un filtro de 5 m para eliminar los desechos celulares.</li>
</ol>3. Dilución de punto final
<ol><li>Realizar una dilución en serie (10-1 a 10-11) de la muestra viral en el medio de inanición (Tabla 1).</li>
	<li>Inocular 2 ml de 1 x 106 Vermamoeba vermiformis contenida en cada plato de Petri con 100 ml de la mezcla de inóculo.</li>
	<li>Colocar los platos de Petri en una bolsa de plástico sellable a 30 oC.</li>
	<li>Comience a observar los platos de Petri con microscopía óptica invertida a 6 h de postinfección y compruebe la morfología celular cada 4 a 8 h.</li>
	<li>En la aparición del efecto citopático caracterizado por células de redondeo, comenzar el proceso de microaspiración de células únicas.</li>
</ol>4. Microaspiración de células únicas
<ol><li>
Prepare al anfitrión. NOTA: Esta preparación está hecha para la liberación de células individuales infectadas a un soporte celular nuevo.<ol>
<li>Tratar las amebas en el cultivo con un agente antimicrobiano que contenga 10 g/ml de vancomicina, 10 g/ml de imipenem, 20 g/ml de ciprofloxacino, 20 g/ml de doxiciclina y 20 g/ml de voriconazol. Esta mezcla se utiliza para evitar la contaminación bacteriana y fúngica. NOTA: El procedimiento tiene lugar en un banco fuera de la estación de seguridad microbiológica. Añadir 2 ml de amebas concentradas a 1 x 106 células/ml cada una en 15 platos de Petri. Para la adherencia a la ameba, incubar el cultivo a 30 oC durante 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione la placa Petri utilizada para la microaspiración a partir de la dilución límite de acuerdo con los siguientes criterios: 1) ausencia de contaminación visible por agentes fúngicos y bacterianos, 2) evidencia de efecto citopático de amebas debido a los virus, y 3) pregolíforla y la fase de redondeo de las amebas (para evitar la aspiración de partículas virales).</li>
	<li>
Configure una estación de trabajo con los siguientes materiales (consulte la figura 1A,B): Micromanipulador, que permite el posicionamiento microcapilar; Dispositivo de presión de control manual, utilizado para aspirar y liberar las células en el microcapilar; Microscopio invertido; Módulos de motor Plug and Play; Cámara; Módulo informático para visualizar la manipulación y tomar fotografías.</li>
	<li>Elija un microcapilar (véase el cuadro 1C). NOTA: El tamaño de las células, la deformación y adhesión de sus membranas a las superficies, y la motilidad celular pueden afectar el progreso suave de la micro-aspiración. El diámetro microcapilar se puede elegir y adaptar con precisión a tipos de células específicas en función de sus tamaños y métodos de aspiración. Se utilizó un microcapilar de 20 m de diámetro interior para aspirar una ameba de redondeo (diámetro de 10 m). Esto permite el mantenimiento de una posición interna y una fácil liberación de la célula.</li>
	<li>
Monte el sistema.
	<ol>
<li>Fije el ángulo de funcionamiento del sistema de agarre en el módulo motorizado a 45o.</li>
		<li>Realice una instalación doble, primero en el sistema de agarre, y luego en el microcapilar.</li>
		<li>Concéntrese en las células después de correr unas gotas de aceite a través del microcapilar. NOTA: El aceite mineral con compatibilidad biológica es suministrado por el dispositivo.</li>
		<li>Montaje completo siguiendo las recomendaciones del fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Clonar celdas (consulte la figura 2A, B). NOTA: Este procedimiento es similar al descrito por Fr-hlich y K-nig31.<ol>
<li>Coloque el plato Petri que contiene 2 ml de amebas infectadas bajo el microscopio.</li>
		<li>Concéntrese primero en las células y luego en el microcapilar inmerso en el cultivo.</li>
		<li>Escoge una sola célula redondeada y acerca el microcapilar al micromanipulador.</li>
		<li>Ejercer una aspiración suave con control de presión manual en la célula, llevándola dentro del microcapilar. Retire la célula única de la primera muestra y suéltela en el soporte celular, luego incubarla a 30 oC.</li>
		<li>Realizar observaciones diarias con un microscopio óptico invertido para observar la apariencia de las células y monitorear la aparición del efecto citopático.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Detección de PCR
NOTA: Después del paso 4, un cribado sistemático por PCR es crucial para confirmar la separación. Tanto en Usurpativirus/Faustovirus como en Clandestinovirus/Faustovirus, el diseño y la aplicación de los sistemas específicos de imprimación y sonda se realizaron utilizando Primer-BLAST en línea32 (Tabla 2).
<ol><li>Extraer ADN de una parte de las muestras de cultivo positivo (es decir, donde se observa un efecto citopático), utilizando un sistema de extracción automatizado de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Utilice imprimaciones adecuadamente diseñadas. NOTA: Aquí diseñamos imprimaciones para amplificar los genes centrales anotados como RpB2 (Faustovirus), proteína cápside principal LCD7 (Usurpatvirus) y proteína cápside menor (Clandestinovirus)</li>
	<li>
Realice pcR estándar utilizando un termociclador.
	<ol>
<li>Llevar a cabo reacciones de PCR de 20 ml con 50 m de cadaimprimación (Tabla 2),1x mezcla maestra y agua libre de RNase.</li>
		<li>Activar la polimerasa de ADN Taq durante 5 min a 95 oC, luego seguir con 45 ciclos de desnaturalización de 10 s a 95 oC, recocido de las imprimaciones durante 30 s a 58 oC, y extensión para 30 s a 72 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecuta los productos PCR en un gel de agarosa del 1,5%, mancha con mancha de gel de ADN(Tabla de Materiales)y visualiza con UV.</li>
</ol>6. Producción y purificación de virus
<ol><li>Vuelva a colocar el resto del cultivo de platos Petri en un pequeño matraz.</li>
	<li>Para la producción de virus, preparar 15 matraces de 145 cm2, que contengan 40 ml de Vermamoeba vermiformis en medio de inanición y 5 ml del virus aislado ya transferido de la placa Petri a frascos pequeños.</li>
	<li>Tratar con el mismo antibiótico y mezcla antifúngica utilizado en el paso 4.1.</li>
	<li>Incubar a 30oC. Observe todos los días con microscopía óptica invertida.</li>
	<li>Después de la infección completa, piscina todos los matraces. Utilice un filtro de 0,45 m para eliminar los residuos.</li>
	<li>Ultracentrifuge todos los sobrenatantes a 50.000 x g durante 45 min.</li>
	<li>Después de la centrifugación, retire el sobrenadante de cada tubo por aspiración y resuspenda el pellet en 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS).</li>
	<li>Purificar el virus producido con 25% sacarosa (27,5 g de sacarosa en 100 ml de PBS, esterilizada por filtración).</li>
	<li>Centrífuga 8 ml de sacarosa y 2 ml de la suspensión viral a 80.000 x g durante 30 min. Resuspender el pellet viral en 1 ml de PBS. Almacenar a -80 oC.</li>
</ol>7. Microscopía electrónica de tinción y transmisión negativa
NOTA: Bou Khalil et al. publicaron previamente este protocolo27.
<ol><li>Deposite 5 sl del sobrenadante de lisis en la rejilla de descarga de resplandor. Dejar actuar durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente. NOTA: La descarga de brillo nos permite obtener una rejilla hidrófila por aplicación de plasma.</li>
	<li>Seque la rejilla cuidadosamente y deposite una pequeña gota de 1% de molibdato de amonio en ella durante 10 s. Deje que la rejilla se seque durante 5 min.</li>
	<li>Proceda a observaciones de microscopía electrónica a 200 keV.</li>
</ol>8. Caracterización del Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7
<ol><li>Caracterizar las poblaciones puras de Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7 utilizando la secuenciación del genoma, el montaje del genoma, los análisis bioinformáticos y el estudio de su ciclo replicativo como lo hemos hecho para otros virus10,20, 29.</li>
</ol>

<ol><li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li>
<li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Giant+Virus+in+Amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033(2003).</li>
<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum%2C+a+new+30%2C000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285(2018).</li>
<li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166(2018).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus%2C+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus%2C+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300(2016).</li>
<li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372(2018).</li>
<li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li>
<li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76(2016).</li>
<li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medusavirus%2C+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430(2019).</li>
<li>Abrahão, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749(2018).</li>
<li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faustovirus%2C+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li>
<li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaumoebavirus%2C+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278(2016).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orpheovirus+IHUMI-LCC2%3A+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779(2018).</li>
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</ol>

Todos los autores no tienen nada que revelar.

La duración del manejo de la microaspiración de una sola célula y su buen funcionamiento depende del operador. Los diferentes pasos del experimento requieren precisión. El uso de los componentes de micromanipulación de la estación de trabajo debe estar bajo control constante observando el proceso de microaspiración y la liberación de la célula. El seguimiento por observación microscópica es necesario para la captura y transferencia de una célula. Un operador experimentado puede tomar de 1 a 2 h para aislar 10 células y v...

Los virus nucleocitoplasmáticos de ADN grande (NCLDV) son extremadamente diversos, definidos por cuatro familias que infectan los eucariotas1. Los primeros virus descritos con genomas superiores a 300 kbps fueron Phydcodnaviridae, incluido el virus de la Clorella de paramecículo bursario 1 PBCV12. El aislamiento y la primera descripción de Mimivirus, mostraron que el tamaño de los virus se duplicó tanto en tamaño de la partícula (450 nm) como en la longitud del genoma (1,2 Mb)3. Desde entonces, se han descrito muchos virus gigantes, generalmente aislados mediante un procedimiento de cocultura de ameba. Varios virus gigantes con diferentes morfologías y contenidos genéticos pueden ser aislados de células sp. de Acanthamoeba, incluyendo Marsellavirus, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, y recientemente Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Paralelamente, el aislamiento de Vermamoeba vermiformis permitió el aislamiento y la descripción de los virus gigantes Faustovirus, Kaumoebavirus y Orfeovirus18,19,20. Otros virus gigantes fueron aislados con sus protistas huéspedes, como Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina 23 y Bodo saltans 22 , Chrysochromulina ericina23y Bodo saltans 24. Todos estos aislamientos fueron el resultado de un número cada vez mayor de equipos que trabajan en el aislamiento y la introducción de actualizaciones de estrategia de alto rendimiento25,26,27,28, como el mejora del sistema de cocultura con el uso de citometría de flujo.
En 2016, utilizamos una estrategia que asocia baña cocultivo y citometría de flujo para aislar virus gigantes27. Esta estrategia fue desarrollada para aumentar el número de muestras inoculadas, para diversificar protistas utilizados como soportes celulares, y para detectar rápidamente la lisis del soporte celular. El sistema se actualizó añadiendo un paso suplementario para evitar la identificación preliminar de la biología molecular y la detección rápida de una población viral desconocida como en el caso de Pacmanvirus29. La citometría de flujo de acoplamiento a la clasificación celular permitió la separación de una mezcla de Mimivirus y Cedratvirus A1130. Sin embargo, más tarde encontramos las limitaciones de la separación y detección de estas subpoblaciones virales por citometría de flujo. Después de la secuenciación, cuando ensamblamos los genomas de Faustovirus ST125 y Faustovirus LCD7 (datos no publicados), sorprendentemente encontramos en cada conjunto dos genomas suplementarios de dos virus novedosos no identificados en bases de datos públicas del genoma. Sin embargo, ni la citometría de flujo ni la microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostraron que las amebas estaban infectadas por dos virus diferentes, Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7. Diseñamos sistemas de PCR específicos para amplificar los marcadores Defaustovirus, Usurpativirus y Clandestinovirus, respectivamente, en función de sus genomas; nuestro propósito era tener sistemas basados en PCR que permitieran verificar la pureza de los virus separados. Sin embargo, la dilución de punto final y la citometría de flujo no pudieron separarlos. El aislamiento de esta única población viral fue difícil porque no se han caracterizado ni la morfología ni los elementos replicativos de las poblaciones de Clandestinovirus y Usurpativirus. Detectamos sólo una población viral por citometría de flujo debido a la superposición de las dos poblaciones (probada después de la separación efectiva). Tratamos de separarlos usando una sola partícula de clasificación en placas de 96 pocillos, pero no observamos ningún efecto citopático, y no detectamos Clandestinovirus ni Usurpativirus por amplificación de PCR. Por último, fue sólo la combinación de dilución de punto final seguida de una sola microaspiración de amebas lo que permitió la separación de estos dos virus gigantes de baja abundancia de Faustovirus. Este método de separación es el objeto de este artículo.

<table><tbody><tr><td>Agarosa Estándar</td><td>Euromedex</td><td>Unkown</td><td>PCR estándar</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 Master Mix Applied</td><td>Biosystems</td><td>4398876</td><td>PCR estándar</td></tr><tr><td>CellTram 4r Aceite</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Control de las células durante el proceso de microaspiración</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular Corning 150 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430825</td><td>Cultivo</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular Corning 25 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td></td><td>CLS430639 Cultivo</td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular Corning 75 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430641</td><td>Culture</td></tr><tr><td>Cámara DFC 425C</td><td>LEICA</td><td>Unkown</td><td>Observación/Monitoreo</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Eclipse TE2000-S</td><td>Nikon</td><td>Unkown</td><td>Observación/Monitoreo</td></tr><tr><td>EZ1 advanced XL</td><td>Quiagen</td><td>9001874</td><td>extracción de ADN</td></tr><tr><td>Glasstic Slide 10 con rejillas de recuento</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td>Recuento de células</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6331000017</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>Microcapilar 20 &; m</td><td>Eppendorf</td><td>5175 107.004</td><td>Microaspiración y liberación de células</td></tr><tr><td>Micromanipulador InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>631-0210</td><td>Posicionamiento microcapilar</td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9920</td><td>PCR estándar</td></tr><tr><td>Optima XPN Ultracentrífuga</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>A94469</td><td>Purificación de virus</td></tr><tr><td>Placa de Petri 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Cultivo/observación</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa estériles 5 &micro; m</td><td>Sigma-aldrich</td><td>SLSV025LS</td><td>Filtración</td></tr><tr><td>SYBR verde Tipo I</td><td>Invitrogen</td><td>desconocido</td><td>Sondas moleculares fluorescentes/citometría de flujo</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>PCR estándar; Tinción de gel de ADN</td></tr><tr><td>Tecnai G20</td><td>FEI</td><td>Unkown</td><td>Microscopía electrónica</td></tr><tr><td>Tipo 70 Ti Rotor de titanio de ángulo fijo</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>337922</td><td>Purificación</td></tr><tr><td>de virus Tubo ultratransparente, 25 x 89 mm2</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>344058</td><td>Purificación de virus</td></tr></tbody></table>

microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Durante el proceso de cocultura de la ameba, más de un virus puede aislarse en un solo pozo. Hemos resuelto previamente este problema por dilución de punto final y/o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) aplicada a la población viral. Sin embargo, cuando los virus de la mezcla tienen propiedades morfológicas similares y uno de los virus se multiplica lentamente, se descubre la presencia de dos virus en la etapa de montaje del genoma y los virus no se pueden separar para una caracterización posterior. Para resolver este problema, desarrollamos un procedimiento de microaspiración de una sola célula que permite la separación y clonación de virus altamente similares. En el presente trabajo, presentamos cómo esta estrategia alternativa nos permitió separar las pequeñas subpoblaciones virales de Clandestinovirus ST1 y Usurpativirus LCD7, virus gigantes que crecen lentamente y no conducen a la lisis amebal en comparación con el lítico y el crecimiento rápido Faustovirus. El control de pureza se evaluó mediante amplificación genética específica y se produjeron virus para su posterior caracterización.

La microaspiración de una sola célula es un proceso de micromanipulación optimizado en este manuscrito(Figura 1). Esta técnica permite la captura de una ameba redondeada e infectada(Figura 2A)y su liberación en una placa novedosa que contiene amebas no infectadas(Figura 2). Es un prototipo funcional que se aplica al sistema de cocultura y ha aislado con éxito virus gigantes no líticos. Este enfoque se utilizó por pr...

Aquí, describimos un método de microaspiración de una sola célula para la separación de las amebas infectadas. Con el fin de separar subpoblaciones virales en Vermamoeba vermiformis infectados por Faustovirus y virus gigantes desconocidos, desarrollamos el protocolo detallado a continuación y demostramos su capacidad para separar dos nuevos virus gigantes de baja abundancia.

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Micro-Aspiración de célula única es un método para complementar las diferentes técnicas utilizadas en el campo de la microbiología en general y en la virología en particular. Podría responder a preguntas clave y resolver problemas encontrados durante el aislamiento de virus gigantes separando un virus de una mezcla viral presentando un virus de baja abundancia, ya que era el caso de los virus de rotación, virus clandisinal, y el virus uzibati de otro, que es Faustovirus, presente en alta abundancia de todos modos. La principal ventaja de este enfoque es el uso de una estrategia indirecta.Consiste en separar y clonar el huésped infectado para obtener una separación viral. Por lo tanto, este método monitorea los diferentes pasos desde la captura hasta la liberación de células y confirma el proceso de clasificación mediante la observación microscópica. Finalmente, la biología molecular se utiliza para confirmar la clasificación y la microscopía electrónica para observar las partículas virales separadas.Este enfoque resolverá el principal problema de la separación de virus. Es una perspectiva para clonar ameba o clonar protistas en general. La persona que está tratando de utilizar esta técnica por primera vez debe ser rigurosa y precisa al controlar la presión.El control visual es esencial para confirmar la captura y la liberación de una sola celda. Utilice Vermamoeba Vermiformis, cepa CDC 19, como soporte celular. Añadir 30 mililitros de PYG medio y tres mililitros de la ameba a una concentración de una por diez a las sextas células por mililitro en un matraz de cultivo celular de 75 centímetros cuadrados.Mantener el cultivo a 28 grados centígrados en una incubadora. Después de 48 horas, transfiera 10 mililitros del cultivo celular de la ameba a un tobogán de conteo y colóquelo bajo un microscopio para cuantificar la ameba. Para enjuagar, cosechar 30 mililitros del cultivo celular en un tubo y peletizar la ameba por centrifugación a 720 veces G durante 10 minutos.Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en el volumen adecuado de medio de inanición para obtener la concentración de una por 10 a las sextas células por mililitro. Preparar el soporte celular con la adición de agente antimicrobiano. En un gabinete de bioseguridad, agregue una vez 10 al sexto de la cultura de la ameba en dos mililitros de medio de hambre.A continuación, inocular 100 mililitros de la solución de stock que contiene la mezcla de virus en el soporte de cultivo celular de amebae en una multiplicidad de infección de 0,01. Incubar el soporte de cultivo celular de amebas infectadas. Añadir 30 grados Celsius durante 10 a 14 horas o hasta que se induzcan efectos citopáticos como el redondeo de amebales o la lelisis.A continuación, utilice una jeringa para recoger el medio y filtrar a través de un filtro de cinco micras para eliminar los desechos celulares. Realizar una dilución de cereales de la muestra viral en medio de inanición en diferentes pozos. Inocular dos mililitros de uno por 10 hasta el sexto Vermamoba Vermaformis contenidos en cada plato Petri con 100 mililitros de la mezcla de inóculo.A continuación, coloque los platos de Petri en una bolsa de plástico sellable a 30 grados centígrados. A las seis horas después de la infección, observe los platos de Petri con microscopía óptica invertida y compruebe la morfología celular cada cuatro a ocho horas. El tratamiento antimicrobiano es para el soporte celular.Seleccionar entre los platos petri los que no existen de cualquier contaminación visual por agentes fúngicos y bacterianos y con evidencia de efecto citopático de las amebas debido a los virus y con pre-lysis y fase de redondeo de la amebae para evitar la aspiración de partículas virales. Configure una estación de trabajo con micromantenidor, dispositivo de presión de control manual, microscopio invertido, módulos Plug and Play Motor, cámara y módulo de computadora. Elija un micro capilar de 20 micras de diámetro interior para permitir el mantenimiento de una posición interna y una fácil liberación de la célula.Fije el ángulo de funcionamiento del sistema de agarre en el módulo motorizado a 45 grados. Realizar una doble instalación, primero en el sistema de agarre y luego en el micro capilar. Concéntrate en las células.Para clonar células, coloque el plato Petri que contiene dos mililitros de amebas infectadas bajo el microscopio. Concéntrese primero en las células y luego en el micro capilar sumergido en el cultivo. Recoger una célula única redondeada y acercar el micro capilar al micromaniprulador.Ejercer aspiración suave con control de presión manual en la célula que lo toma dentro del micro capilar Retire la célula única de la primera muestra y suéltela en el soporte de cultivo celular de la amebae. Luego incubarlo a 30 grados centígrados. Controle cuidadosamente la presión para poder aspirar una sola célula y controlar su aspiración mediante la observación de la liberación de una sola célula.Realizar observaciones diarias con un microscopio óptico invertido para observar la apariencia de las células y monitorear la aparición del efecto citopático. Ahora opera un sistema automatizado de extracción para extraer ADN de parte de las muestras de cultivo positivo donde se observa un efecto citopático. Diseñe imprimaciones para amplificar genes pobres anotados como RBP2 para Faustovirus, proteína cápsida principal para Usurpatvirus y proteína capsid menor para Clandestinovirus.Realice la PCR estándar utilizando un termociclador según el manuscrito. Realice 20 microlilitros de reacciones PCR con 50 micromolares de cada imprimación, 1X Master Mix y agua libre ribonucleasa. Ejecute los productos PCR con mancha de gel de ADN en un gel de 1,5% de agarosa a la tensión de 135 voltios y visualice con UV. Este protocolo optimiza un proceso de micromanipulación con micro aspiración de una sola célula.Esta técnica permite la captura de una ameba redondeada e infectada y su liberación en una placa novedosa que contiene amebas no infectadas. Este enfoque aisló con éxito un nuevo virus gigante de baja abundancia llamado Userpatvirus LCD7. Su Userpatvirus sólo se observó en el clon siete con presencia de ADN Userpatvirus LCD7 y ausencia de ADN de Faustovirus.La microscopía electrónica reveló la aparición del Clandestinovirus ST1, que tiene una morfología icosadral típica sin fibrillas, así como Usurpatvirus LCD7 con una capsida icosahedral de unos 250 nanómetros. La baja citometría confirma la superposición de poblaciones de Faustovirus y Nauvoirus. Una vez dominado, este procedimiento se puede hacer fácilmente.Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es la necesidad de un ritual mínimo de observaciones sobre el tamaño de las entidades con el buen manejo del competente de la estación de trabajo y la comprobación de cualquier problema de contaminación. Este enfoque se puede utilizar como una técnica de clasificación sobre la base de la morfología celular. Actualmente se utiliza en nuestro laboratorio para la clonación de ameba específica.Un punto crítico de esta técnica es mantener la integridad celular. De hecho, podemos tener algunos problemas con la no observación de la célula o liberación. Esto se debe principalmente a la desintegración de la célula en el micro capilar.Este método podría ser una alternativa eficaz cuando la telemetría de defectos y la ordenación de hechos no están disponibles y cuando se alcanzan limitaciones técnicas específicas. No olvide que en algunos casos la célula no se libera del micro capilar. Esto se debe en parte a las características de la ameba y su capacidad de adaptación y luego de la membrana celular.

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Investigación

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Biology

Biología

Genómica de virus individuales (SVG) es un método para aislar y amplificar los genomas de los viriones individuales. Suspensiones virales de un conjunto mixto se ordenan mediante citometría de flujo en un portaobjetos de microscopio con pozos discretas que contienen agarosa, capturando así el virión y la reducción del genoma cizallamiento durante el procesado posterior. Amplificación del genoma completo se logra mediante la amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) resultante en el...

Aislamiento y Análisis del Genoma de viriones individuales utilizando &quot;Genómica solo virus &#39;

La unión de viriones a una superficie es un requisito para la obtención de imágenes de viriones individuales mediante imágenes de fluorescencia de súper resolución o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aquí se demuestra un método de preparación de la muestra para la adhesión controlada de viriones a las superficies de vidrio adecuado para su uso en AFM y super-resolución de imágenes de fluorescencia.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Describimos aquí los últimos avances en aislamiento viral para la caracterización de nuevos genotipos de Faustovirus, un nuevo linaje de virus gigantes relacionado con asfarvirus. Este protocolo se puede aplicar al aislamiento de alto rendimiento de virus, especialmente virus gigantes que infectan amebas.

Una estrategia rápida para el aislamiento de nuevos Faustoviruses de muestras ambientales Uso<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

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Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia &gt; 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

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Descrito es una metodología para cuantificar la expresión de 96 genes y 18 proteínas de la superficie de células ex vivo, lo que permite la identificación de diferencialmente expresan genes y proteínas en células virus-infectadas en comparación con las células no infectadas. Aplicamos el enfoque de estudio CD4 infectados por SIV+ T las células aisladas de macaques del macaco de la India.

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Este protocolo describe un método basado en la clasificación celular para la purificación y la cultura de las neuronas GABAérgicas fluorescentes o glutamatérgicas de la neocorteza y el hipocampo de ratones o ratas postnatales.

Cultura celular primaria de las neuronas purificadas GABAérgicas o glutamatérgicas establecidas a través de la clasificación celular activada por fluorescencia

Este protocolo proporciona un método de aislamiento rápido y específico del tamaño para pequeñas vesículas extracelulares al optimizar el tamaño de la boquilla de pulverización de aire, la presión del fluido de la vaina, la presión del flujo de muestra, el voltaje, la ganancia y los parámetros del umbral de activación.

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Las vesículas extracelulares son muy prometedoras para las aplicaciones biomédicas, pero los métodos de aislamiento actuales requieren mucho tiempo y no son prácticos para el uso clínico. En este estudio, presentamos un dispositivo microfluídico que permite el aislamiento directo de vesículas extracelulares de grandes volúmenes de biofluidos de forma continua y con pasos mínimos.

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Aquí, describimos un inmunoensayo fluorescente multiplex recientemente desarrollado que utiliza un sistema citométrico de flujo de doble reportero para detectar simultáneamente dos epítopos únicos de proteína de pico en partículas virales intactas del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que habían sido capturadas por microesferas magnéticas acopladas a la enzima convertidora de angiotensina-2.

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Establecer una clasificación exitosa para el aislamiento de vesículas extracelulares

Aprende la técnica de microaspiración de células únicas para separar subpoblaciones virales de baja abundancia usando Vermamoeba vermiformis. Este método permite aislar nuevos virus gigantes como Usurpatvirus LCD7 con alta precisión.

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes (Video) | JoVE Journal

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

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