Name: Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende a aislar leucocitos de leche materna humana para evaluar la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos contra objetivos del VIH. Este método permite estudiar la respuesta inmune en lactantes y comprender la transmisión del virus.

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Agradecemos a la Dra. Susan Zolla-Pazner en el Departamento de Medicina y departamento de microbiología de la Escuela de Medicina de Icahn en Mount Sinai por su revisión manuscrita. El NIH/NICHD proporcionó financiación para este proyecto con el número de subvención R21 HD095772-01A1. Además, R. Powell fue apoyado por fondos del Departamento de Medicina, División de Enfermedades Infecciosas, Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

Cada participante en este estudio fue reclutado y entrevistado de acuerdo con la aprobación de la junta de revisión ética e institucional (IRB) con la orientación y autorización del Programa para la Protección de Los Sujetos Humanos (PPHS) del Monte Sinaí utilizando un protocolo para la obtención de muestras de leche materna.
1. Preparación de la microesfera objetivo
<ol><li>Seleccione un antígeno objetivo relevante. NOTA: En este ejemplo, se utilizó la proteína recombinante V1V2-2F5K, que fue diseñada para imitar el ápice trimé de la envolvente nativa del VIH30.</li>
	<li>Realizar biotinylación utilizando un kit comercial (Tabla de Materiales) de acuerdo con el protocolo del fabricante.<ol>
<li>Calcular el mmol del reactivo de biotina para añadir a la reacción por un exceso molar de 5 veces utilizando la fórmula: biotina mmol x (proteína mg/ml) x (proteína mmol biotina/proteína mg) x (5 mmol biotina/proteína mmol)30,31. A continuación, calcule el l del reactivo de biotina para agregar utilizando la fórmula: biotina de L a biotina mmol x (1.000.000 de L/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>Equilibrar la biotina a temperatura ambiente antes de abrir. Disolver la proteína en 0,5 x 2,0 ml de solución salina con fosfato (PBS) según el cálculo realizado anteriormente.</li>
		<li>Preparar una solución de 10 mM de reactivo de biotina en dimetilsulfóxido (DMSO) y añadir el volumen adecuado de reactivo de biotina de 10 mM a la solución proteica, e incubar la reacción en hielo durante 2 h o a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar el exceso de biotina utilizando concentradores de proteínas (membranas de poliétersulfone [PES], corte de peso molecular de 3 kDa [MWCO], 0,5 ml; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.<ol>
<li>Deposite la muestra en la cámara superior de la columna de centrifugado y agregue PBS hasta 400 l. Tapa, luego inserte esta cámara de muestra en un tubo de recolección. Centrífuga a 12.000 x g a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Deseche el flujo y agregue PBS a 400 l. Repita la centrifugación. Deseche el flujo y agregue PBS a 100 ol. Mida la concentración de proteínas por un espectrofotómetro. NOTA: La proteína se puede alícite y congelar a -80 oC hasta que se utilice.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de la placa de ensayo de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP)
<ol><li>Conjugar proteína biotinilada a 1 m de microesferas ('perlas'; Tabla de Materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.<ol>
<li>Por placa de perlas conjugadas, incubar 6 g de proteína con 12 ml de perlas de stock en 200 ml de albúmina sérica bovina (BSA) albúmina bovina (BSA)-PBS a temperatura ambiente durante 1 h, vórtice suavemente cada 20 minutos.</li>
		<li>Centrifugar a 13.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, el vórtice suavemente y resuspende en 1200 s de 0,1% de BSA-PBS. Repita el giro y lave el paso 2x. Resuspender en 1200 l de 0,1% de BSA-PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 10 l de solución de perlas por pozo en una placa redonda inferior de 96 pocillos. Preparar diluciones de anticuerpos o sueros inmunes de interés en 12 ml de 2% de HBSS HSA al 2%, normalmente a partir de 50 g/ml de anticuerpo o una dilución sérica de 1/100. NOTA: En los datos de la muestra, se utilizó el anticuerpo monoclonal (mAb) 830A.</li>
	<li>Añadir 10 l de anticuerpo/sera valorado a la placa de cuentas e incubar durante 2 h a 37 oC. Añadir 200 s de 2% HSA HBSS a cada pozo y placa centrífuga a 2.000 x g durante 10 min.</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante mediante un rápido vuelco y decantación de líquido de los pozos de la placa en un fregadero para evitar perturbar el pellet de perlas invisible.</li>
</ol>3. Aislamiento de células de leche materna
<ol><li>Obtener leche materna humana de mujeres lactantes saludables, expresada mediante bombas electrónicas o manuales dobles. Aísle las células dentro de los 4 h de expresión, manteniendo la leche a temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando tubos de 50 ml, centrifugar 50 ml de leche a 800 x g durante 15 minutos. Verter cuidadosamente la leche desnatada y la grasa sin alterar el pellet celular. Limpie el interior del tubo con una toallita sin pelusas para eliminar toda la grasa de la pared del tubo.</li>
	<li>Añadir 10 ml de albúmina sérica humana al 2% en la solución salina equilibrada de Hank (2% HbSS HSA [sin Ca2+ o Mg+]). Resuspenda el pellet pipeteando suavemente para evitar la activación celular y la apoptosis. Pasar a un tubo de 15 ml y centrífuga a 450 x g durante 10 min.</li>
	<li>Vierta el sobrenadante y repita el paso 1.3. Luego, resuspenda suavemente las células en 1 x 2 ml de 2% de HBSS HSA del 2% dependiendo del número de celda esperado, y cuente las células por un hemocitómetro o un contador de células automatizado, observando también la viabilidad celular.</li>
</ol>4. Ensayo ADCP
NOTA: Los métodos descritos aquí están adaptados de Ackerman et al.32.
<ol><li>Agregue 50.000 células BM recién aisladas a cada placa de ensayo ADCP bien en 200 s de 2% de HSA-HBSS al 2%. Incubar durante 2 h a 37oC.<ol>
<li>Para los experimentos de control, preincubar células a 37 oC con inhibidor de la actina de 10 g/ml (citochalasina-D), agente de bloqueo fcR de 50 g/ml (FcBlock) o una combinación de ambas antes de su adición a las placas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa de centrífuga a 930 x g durante 10 min. Añadir 200 ml de 2% HbSS HSA y centrifugación repetida. Retire con cuidado el sobrenadante como en el paso 2.7 y repita el lavado.</li>
	<li>Retire cuidadosamente las células de sobrenadant y mancha para su viabilidad utilizando una mancha de viabilidad fijable de 0,5 g/ml (concentración final) 450 por pocal en 50 ml de 2% de HBSS de HSA al 2%. Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Placa centrífuga a 930 x g durante 10 min y retire el sobrenadante como en el paso 2.7. Añadir 200 l de 2% de HBSS HSA 2% y placa centrífuga de nuevo seguido de la eliminación del sobrenadante como en el paso 2.7.</li>
	<li>Después de la mancha de viabilidad, las células de mancha para los marcadores de leucocitos de interés, incluyendo mínimamente una mancha específica de CD45 como CD45 antihumano de ratón PE (clon HI30) a una concentración optimizada (1 g/L en 50 éL de 1% BSA HBSS en los datos de ejemplo). NOTA: Se pueden incluir marcadores de interés específicos del linaje.</li>
	<li>Incubar 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Placa centrífuga a 930 x g durante 10 min y retire el sobrenadante como en el paso 2.7. Añadir 200 s de 1% de HBSS BSA y centrifugación repetida. Retire el sobrenadante. Fijar las células en 200 l de formaldehído al 0,5% en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4 oC. Refrigere en la oscuridad hasta el análisis.</li>
</ol>5. Análisis por citometría de flujo
<ol><li>Realice el gating inicial para eliminar los dobletes en una gráfica y los desechos de dispersión hacia delante (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) (material más pequeño que FSC 5000) (véase la figura 1). Utilice una gráfica de mancha de Viabilidad (V450 en este caso) para eliminar las células muertas (aquellas que son positivas para la mancha de viabilidad).</li>
	<li>Utilice una gráfica SSC frente a CD45 para diferenciar las principales clases de leucocitos (granulocitos, monocitos, linfocitos) como se describe ampliamente33,34. NOTA: Esta clasificación solo es sugerente y se necesitan marcadores específicos de linaje para confirmar el tipo de celda.</li>
	<li>Para todas las células CD45+, o para cada subconjunto de leucocitos de interés, mida la actividad de ADCP haciendo un marcador en las células positivas en un histograma del canal de isotiocianato de fluoresceína (FITC), donde se detectan los granos fluorescentes. NOTA: Los pozos de control negativos en los que no se agregaron cuentas indicarán dónde las celdas positivas de cordón son evidentes en el histograma y, por lo tanto, dónde colocar el marcador de gating.</li>
	<li>Calcular las puntuaciones adCP como (intensidad media de fluorescencia [MFI] de células positivas de perlas) x (% del total de CD45 + células en la población positiva). Utilice el software de gráficos para trazar puntuaciones en cada concentración de Ab/suero y para realizar un análisis de área bajo la curva (AUC). NOTA: El ADCP se considera positivo si el AUC es mayor que 3 veces la desviación estándar del AUC de puntuación ADCP de un mAb de control negativo no específico (en este caso, 3865).</li>
</ol>

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<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La técnica basada en citometría de flujo para medir la actividad de ADCP descrita en este documento se describió por primera vez en 201130 y desde entonces se ha demostrado robusta y citada en más de 80 estudios. El protocolo descrito aquí adapta esta técnica para su uso con células BM primarias por primera vez. Estudios previos de funcionalidad mediada por Fc por células BM se han limitado en gran medida a la medición de ráfagas oxidativas o ensayos de fagocitosis basados en histología utilizando...

La leche materna humana (BM) se compone de células maternas que son >90% viables1. La composición celular se ve fuertemente afectada por la etapa de la lactancia, el estado de salud de la madre y el bebé, y la variación individual, que sigue siendo mal entendido1,2,3,4. Dado que BM contiene 103x 105 leucocitos/ml, se puede estimar que los lactantes amamantados ingien de 105a 108 leucocitos maternos diariamente5. Varios estudios in vivo han demostrado que los leucocitosmaternos proporcionan inmunidad crítica al bebé y son funcionales mucho más allá de estos sitios de ingestión inicial5,6,7 ,9,10,11. Todas las células de origen materno ingeridas por el bebé tienen el potencial de realizar funciones inmunitarias junto a los leucocitos 12 o para compensar los propios leucocitos del bebé12.
La transmisión de madre a hijo (MTCT) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo una crisis en los países con recursos limitados. Dado que las enfermedades diarreicas y respiratorias son responsables de tasas sustanciales de mortalidad entre los lactantes en los países con recursos limitados, y estas enfermedades se reducen significativamente mediante la lactancia materna exclusiva, los beneficios para las madres infectadas por el VIH la lactancia materna supera con creces los riesgos13,14,15. A menos que el acceso al agua potable y a la leche adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna para las madres infectadas por el VIH16. Aproximadamente 100.000 MTCTs a través de BM ocurren anualmente; sin embargo, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por sus madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de BM17,18,19,20,21. Numerosos factores probablemente funcionan en conjunto para prevenir la transmisión. Es importante destacar que los anticuerpos específicos del VIH (Abs) en BM se han correlacionado con la reducción de la MTCT y/o la reducción de la muerte infantil por infección por VIH22,23. Lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de la fracción celular de BM a sus cualidades antivirales.
Muchos Abs facilitan una variedad de actividades antivirales mediadas por la región "constante" de la molécula de inmunoglobulina, el fragmento cristalable (Fc), a través de la interacción con los receptores Fc (FCR) que se encuentran en prácticamente todas las células inmunitarias, prácticamente todas las cuales se encuentran en bm24humano. La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) se ha demostrado como necesaria para el aclaramiento de infecciones virales y se ha estudiado en el caso de la prevención del MTCT del VIH25,26,27, 28 , 29. Dada la escasez de conocimientos sobre la posible contribución de la actividad de ADCP por parte de los fagocitos BM a la prevención del MTCT del VIH, nuestro objetivo era desarrollar un método riguroso para aislar las células de la BM humana con el fin de llevar a cabo un estudio de ADCP mediado por células de BM obtenido en varias etapas de la lactancia.

<table><tbody><tr><td>1 y micro; m Microesferas marcadas con FluoSpheres NeutrAvidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Ratón Anti-Humano CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino MP</td><td>Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning Placa de poliestireno de fondo en V de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Citochalasina D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de biotina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicos Corning</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>352196</tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de viabilidad reparable 450&nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma 252549</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sin calcio, magnesio o fenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Humano BD Fc Block</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana</td><td>MP Biomedicals 2191349</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Limpiaparabrisas para tareas delicadas</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas de poliestireno 10 mL&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores de Proteínas PES, 3K MWCO, 0.5 mL</td><td>Pierce</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de vih

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Incluso en ausencia de medicamentos antirretrovirales, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de la leche materna (BM). A menos que el acceso al agua potable y a la leche maternizada adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna de las madres infectadas por el VIH. Numerosos factores probablemente funcionan en tándem para reducir la transmisión de BM. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de estas células a las cualidades antivirales de BM. Actualmente teníamos como objetivo aislar las células de BM humano con el fin de medir fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), una de las respuestas inmunitarias innatas más esenciales y generalizadas, por los fagocitos BM contra los objetivos del VIH. Las células se aislaron a partir de 5 muestras de BM humanas obtenidas en varias etapas de la lactancia. El aislamiento se llevó a cabo a través de una centrifugación suave seguida de una cuidadosa eliminación de la grasa de la leche y el lavado repetido del pellet celular. Las perlas fluorescentes recubiertas con sobre vih (Env) se utilizaron como dianas para el análisis de ADCP. Las células se teñían con el marcador de superficie CD45 para identificar leucocitos. Se encontró que la actividad del ADCP era significativa por encima de los experimentos de control y reproducible utilizando un anticuerpo 830A específico para el VIH.

La leche se puede mantener a temperatura ambiente o más fría (aunque no congelada); sin embargo, dado que hemos observado una menor viabilidad cuando la leche se ha mantenido muy fría (los datos no se muestran), y que es más sencillo recoger, almacenar brevemente y transportar a temperatura ambiente, se recomienda que las muestras no se refrigeran para reducir variabilidad de muestra a muestra. En la leche obtenida 7-183 días después del parto, la concentración celular determinada por el ...

La leche materna transmite el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), aunque sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque estas células están poco estudiadas. Aquí describimos el aislamiento de los leucocitos de la leche materna y un análisis de su capacidad fagocítica.

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Desarrollamos un método riguroso para aislar las células de la leche materna humana para estudiar la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, o ADCP, mediante fagocitos de leche materna contra los objetivos del VIH. Esta técnica facilita el aislamiento relativamente rápido y fácil de las células de la leche materna para evaluar la capacidad de las poblaciones de leucocitos para realizar ADCP. Demostrando el procedimiento estará Alisa Fox, una técnico de mi laboratorio.Después de seleccionar un antígeno objetivo relevante, utilice un kit comercial para biotinilar la proteína de interés de acuerdo con el protocolo del fabricante. Y deposite la muestra biotinilada en la cámara superior de una columna de espín. Añadir PBS hasta 400 microlitros y tapar la cámara antes de insertar la columna en un tubo de recogida para centrifugación.Después de descartar el flujo a través, agregue PBS a 400 microlitros para una segunda centrifugación. Deseche el flujo a través, agregue PBS a 400 microlitros y mida la concentración de proteínas por un espectrofotómetro para conjugar la proteína biotinilada a microesferas micrómetros. Incubar seis microgramos de proteína con 12 microlitros de cuentas en 200 microlitros de PBS por placa de perlas conjugadas a temperatura ambiente durante dos horas, con vórtice suave cada 20 minutos.Al final de la incubación, pele el pelado de las perlas conjugadas con proteínas por centrifugación y deseche el sobrenadante. Después de un vórtice suave, resuspender la proteína en 1200 microlitros de 0.1%BSA en PBS, y lavar el tubo por centrifugación dos veces más como se acaba de demostrar. Después del último lavado, resuspender el pellet en 1200 microlitros en PBS más BSA.Para configurar las placas de ensayo ADCP, primero prepare 12 diluciones de microlitros de anticuerpos, o el suero inmune de interés, en 2%BSA en PBS en una placa redonda inferior de 96 pozos. Añadir 10 microlitros de perlas conjugadas por pozo a la placa durante una incubación de dos horas a 37 grados Centígrados. Al final de la incubación, añadir 200 microlitros de PBS más BSA.Después de obtener leche materna humana de mujeres sanas lactantes que expresan usando una bomba, dentro de las cuatro horas de expresión separar el contenido de la leche por centrifugación y verter cuidadosamente la leche desnatada y grasa, dejando el pellet celular inalterado. Limpie el interior del tubo con una toallita sin pelusas para eliminar toda la grasa de la pared del tubo y agregue 10 mililitros de PBS más HSA. Resuspender el pellet con pipeteo suave para evitar la activación celular en la apoptosis, y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros para centrifugación.Después de un segundo lavado en PBS más HSA como acabamos de demostrar, resuspender suavemente las células en uno a dos mililitros de PBS fresco más HSA para el conteo. Para un ensayo ADCP, invierta rápidamente la placa ADCP preparada para decantar el sobrenadante después de la centrifugación final y agregue cinco veces 10 en una cuarta célula de leche materna recién aislada en 200 microlitros de PBS más BSA durante una incubación de dos horas a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, centrifugar las células y lavar los pellets dos veces en 200 microlitros de PBS fresco como se demuestra.Después del último lavado, manche las células con 0,5 microgramos por mililitro de vitilidad fijable de 450 por pozo en 50 microlitros de PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Al final de la incubación, pele en pellet las células para dos lavados en PBS fresco como se ha demostrado, y manchar las células para los marcadores de leucocitos de interés durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Al final de la incubación, recoger las células centrifugación, y lavar las células dos veces en 200 microlitros de 1%BSA más PBS por lavado.Después del último lavado, fijar los pellets en 200 microlitros de 0.5%formaldehído por pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Para el análisis citométrico de flujo de las muestras celulares, establezca un citómetro de flujo equipado con un lector de placas de alto rendimiento para retirar 175 microlitros de muestra y recoger 5000 células por pozo. Realice el gating inicial para eliminar los dobletes y los desechos en una dispersión hacia delante frente frente a una gráfica de dispersión lateral.Utilice una gráfica de dispersión lateral frente a la vituosa de viabilidad para eliminar las células muertas. Y utilice una gráfica de dispersión lateral frente a CD45 para diferenciar las principales clases de leucocitos. Para todas las células positivas CD45, o para cada subconjunto de leucocitos de interés, mida la actividad de la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo mediante un marcador en las células positivas del cordón en un histograma del canal de fluoróforo apropiado para las perlas conjugadas.Luego calcule las puntuaciones de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos como la mediana de la intensidad de fluorescencia de las células positivas del cordón por el porcentaje del CD45 total más las células de la población positiva. Aquí, se muestra la estrategia de gating para eliminar dobletes, escombros y células muertas. Entre uno y 12% del total de células vivas son típicamente leucocitos positivos CD45 con la mayor parte de la dispersión lateral baja a intermedia CD45 monocitos bajos que parecen ser precursores, o a células inmaduras, basado en la dispersión lateral versus CD45 gating.Los supuestos granulocitos se definen como células intermedias CD45 de dispersión lateral alta. La medición de la actividad ADCP de las células de leche materna recién aisladas utilizando un anticuerpo monoclonal humano específico del VIH a un mes después del parto revela que el tratamiento con el inhibidor de la actina citocaplasina D y o los anticuerpos de bloqueo del receptor Fc antes de la incubación con perlas acopladas con antígenos unidos a anticuerpos da lugar a la actividad adCP igualada en o por debajo de la observada en presencia de anticuerpos de control. La puntuación ADCP determinada para el total de células positivas CD45 es comúnmente entre 25 a 35 veces por encima de los niveles de fondo, definido mediante un control negativo, anticuerpo monoclonal anti-antórax.Cada muestra de leche materna es única y algunos pellets pueden ser difíciles de ver. Además, las poblaciones de leucocitos, y por lo tanto las puntuaciones ADCP, pueden variar inmensamente de una muestra a una muestra.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos el aislamiento de células B de sangre periférica humana utilizando anticuerpos biotinilados específicos para células no B y microperlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.

Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana

Este video muestra un ensayo para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) por fagocitos de la leche materna. Las microesferas marcadas con fluorescencia conjugadas en un complejo antígeno-anticuerpo se combinan con una suspensión celular aislada de la leche materna para inducir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por los leucocitos fagocíticos. Al marcar las células con anticuerpos contra el antígeno leucocitario común (CD45), se utiliza la citometría de...

Un ensayo in vitro para medir la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos por fagocitos

Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

En este trabajo se describe un protocolo para aislar y estudiar más a fondo los leucocitos infiltrantes de la decidua basalis y la decidua parietalis - la interfaz materno-fetal humana. Este protocolo mantiene la integridad de los marcadores de superficie celular y produce suficientes celdas viables para aplicaciones posteriores, como lo demuestra el análisis de citometría de flujo.

Aislamiento de leucocitos de la interfaz humana Materno-fetal

Se describen técnicas que describen un procedimiento de gradiente para separar exosomas de partículas del virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Este procedimiento se utilizó para aislar exosomas de partículas de VIH en plasma humano de individuos infectados por el VIH. Los exosomas aislados se analizaron para determinar el contenido de citocinas/quimiocinas.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Describimos un método para medir la velocidad de los fagosomas que se mueven hacia el centro celular en células vivas infectadas con o sin el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, utilizando microscopía de fluorescencia confocal de disco giratorio para identificar células infectadas fluorescentes y microscopía de campo claro para detectar fagosomas.

Fagosoma Migración y velocidad medida en vivo primaria macrófagos humanos infectados con VIH-1

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

Describimos un método para procesar el líquido de lavado broncoalveolar y la sangre periférica emparejada de individuos infectados crónicamente por el VIH en terapia antirretroviral para evaluar los reservorios pulmonares del VIH. Estos métodos dan lugar a la adquisición de células T CD4 altamente puras y macrófagos alveolares que posteriormente pueden utilizarse para inmunofenotipado y cuantificaciones de ADN/ARN de VIH por reacción en cadena de polimerasa ultrasensible.

Procesamiento de líquido de lavado broncoalveolar y sangre emparejada para macrófago alveolar y CD4+ inmunofenotipado de células T y evaluación del embalse de VIH

Aquí se presenta un protocolo optimizado para aislar, cultivar, transfectar y diferenciar a los monocitos primarios humanos de individuos infectados por el VIH y controles saludables.

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Este protocolo detalla un método compatible con la automatización de alto rendimiento para aislar células mononucleares de sangre periférica humana para biobancos y otros fines.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica humana de Buffy Coats a través de la separación inmunomagnética de perlas de alto rendimiento

Este protocolo está diseñado para acelerar y permitir el aislamiento efectivo de vesículas extracelulares de la leche materna humana con alta pureza.

Aislamiento rápido de vesículas extracelulares derivadas de la leche materna humana

Aprende a aislar leucocitos de leche materna humana para evaluar la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos contra objetivos del VIH. Este método permite estudiar la respuesta inmune en lactantes y comprender la transmisión del virus.

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

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