Preparación media para el cultivo de microorganismos bajo condiciones estrictamente anaeróbicas/anóxicos

A diferencia de los organismos aeróbicos, los microorganismos estrictamente anaeróbicos requieren la ausencia de oxígeno. Como el oxígeno es omnipresente en el aire, retener las condiciones libres de oxígeno durante el cultivo es un requisito previo para el cultivo anaeróbico. La técnica aplicada representa un método simple y económico para proporcionar condiciones anóximosas para cultivar una población microbiana mixta en el cultivo líquido.

Esta técnica también se puede aplicar para el cultivo de cultivos puros. Sin embargo, para microorganismos altamente sensibles al oxígeno, este procedimiento podría no ser aplicable. Comience por pesar los ingredientes medianos en un matraz apropiado y disolverlos con medio volumen de agua destilada.

A continuación, añada mililitro de indicador REDOX, seguido de vitaminas en la solución de oligoelementos. Ajuste el pH de acuerdo con los requisitos del organismo y lleve el volumen final a 1 litro con agua destilada. El color del indicador REDOX depende del pH y puede requerir algún tiempo para ajustarse.

Llene los matraces séricos de 120 mililitros con 50 mililitros de medio, luego incubarlos en un baño de agua de 100 grados Celsius durante 20 a 30 minutos, para reducir la solubilidad del oxígeno en la fase líquida. Enjuague el espacio de la cabeza con nitrógeno. Tenga cuidado con la ventilación adecuada de la habitación cuando trabaje con nitrógeno.

Cierre los matraces con septa de goma butilo y fije las tapas de aluminio. A continuación, añada 0,1 mililitros de agente reductor a cada matraz, para reducir aún más el potencial de REDOX. Y autoclave los matraces durante 20 minutos a 121 grados Celsius.

Al aplicar este protocolo, se debe utilizar un autoclave certificado para la esterilización de recipientes cerrados. De lo contrario, la sobrepresión derivada del aumento de la temperatura podría hacer que los matraces séricos exploten. Para preparar el inóculo del digestor anaeróbico, añadir 400 mililitros de agua destilada a un matraz y llevarlo a ebullición.

Enfríe hasta aproximadamente 30 grados centígrados mientras se vacía permanentemente el espacio de la cabeza con nitrógeno. Añadir aproximadamente 100 gramos de lodos, derivados de un digestor anaeróbico, asegurándose de registra la masa exacta del lodo para la determinación de la dilución. Intercambie el espacio de la cabeza del matraz con nitrógeno y ciérrelo con un tabique de goma de butilo.

Agitar el matraz durante 30 minutos a 120 RPM. Deje que las partículas de lodo más grandes sedimente, luego use una jeringa y una cánula para eliminar 5 mililitros de inóculo e inyéctelo en un matraz sérico previamente preparado. Incubar el matraz sérico inoculado a una temperatura adecuada para el experimento, asegurándose de drenar la sobrepresión causada por el aumento de temperatura, aproximadamente 15 a 30 minutos después de comenzar la incubación.

Para evaluar la producción y composición de biogás durante el tiempo de incubación, registre la presión atmosférica actual y prepare un manómetro para evaluar la presión dentro del matraz. Agitar los matraces y retirar 1 mililitro de gas espacio para la cabeza con la jeringa y la cánula. Mida la concentración de hidrógeno, oxígeno, metano y dióxido de carbono utilizando cromatografía de gases.

Utilice 1 mililitro de líquido del matraz para controlar las concentraciones de todos los ácidos grasos altos, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y drenar los matraces sobre la presión después de devolverlo a la temperatura adecuada. Este protocolo se utilizó para crear biorreactores en miniatura que realizan digestiones anaeróbicas. Triptófano, tirosina, fenilalanina, extracto de carne, y caseína se añadieron en 3 concentraciones diferentes, y la producción de metano fue monitoreada durante un período de incubación de 28 días.

Los metanogenos se visualizaban irradiando la coenzima F420, que es un portador de electrones en la metanogénesis, y exhibe una fluorescencia azul-verde con un máximo de absorción a 420 nanómetros. Simultáneamente con el análisis de gases, se analizaron muestras de ácidos grasos volátiles y concentraciones de ácido fenilo durante el período de incubación. Los métodos biológicos moleculares dirigidos a la abundancia de microorganismos específicos y/o la composición de la comunidad microbiana, en un determinado punto del experimento, se pueden aplicar utilizando el procedimiento descrito.