Name: Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 s
Description: Aprenda a medir la actividad de la chitinasa en líquidos biológicos como lavado broncoalveolar o suero. Este método simplifica la cuantificación enzimática para diagnóstico clínico y monitoreo terapéutico eficaz.

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Esta investigación fue apoyada por la American Lung Association y los premios de la American Thoracic Society a LS. Los autores sinceramente quieren agradecer al Dr. Jack Elias y al Dr. Chun Geun Lee por proporcionar cepas de ratón transgénicas.

Todos los procedimientos de animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por la IACUC en la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale.
1. Colección de muestras de ratón
<ol><li>
Anestesia
	<ol>
<li>Anestetizar ratones usando ketamina y xilazina (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recogida de muestras de sangre
	<ol>
<li>Confirme la profundidad de la anestesia por falta de respuesta a un pellizco del dedo del pie.</li>
		<li>Abra quirúrgicamente la cavidad torácica para exponer el corazón.</li>
		<li>Inserte una aguja de 26,5 G en el ventrículo izquierdo y recoja sangre en una jeringa. NOTA: Típicamente, alrededor de 0.5–1 ml de sangre se pueden cosechar de un ratón saludable de 20-25 g.</li>
		<li>Recoger la sangre en tubos heparinizados, para la recolección de plasma, o tubos no heparinizados para la recolección de suero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recolección de líquido de lavado broncoalveolar (BAL)
	<ol>
<li>Para recoger el BAL, haga un corte vertical en el cuello para exponer la tráquea.</li>
		<li>Canúrre la tráquea con un catéter de 22 G y fíjela firmemente con una cuerda para evitar fugas por la nariz del ratón.</li>
		<li>Inyectar lentamente dos alícuotas de solución salina estéril con fosfato (PBS, 0,75 ml cada una) en los pulmones a través de la tráquea y recuperarlas.</li>
		<li>Piscina alícuotas y mantener en hielo para su análisis posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procesamiento de las muestras biológicas.
	<ol>
<li>Muestra de sangre: fresco (plasma) o después de permitir la coagulación durante 4 h (suero), centrífuga a 600 x g durante 10 min. Tome el sobrenadante y congele para almacenarlo o usarlo para experimentar.</li>
		<li>BAL: Centrifugar la muestra a 350 x g durante 5 min. Tome el sobrenadante y congele para almacenarlo o usarlo para experimentar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ensayo de chitinase
NOTA: La ciencia detrás del ensayo es relativamente simple. Un sustrato no fluorescente es cegado por chitinasa enzimáticamente activa para producir un producto fluorescente, que luego se mide como un marcador indirecto de actividad de la chitinasa. Las chitinasas dentro de las muestras descomponen el sustrato 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose presente en el 1x tampón McIlvain. Se libera una molécula fluorescente 4-methylumbelliferyl. Al medir la fluorescencia total de cada pozo, obtenemos una medición precisa de la chitinasa activa en cada muestra. Debido a que la descomposición de la quitina por chitinasa es una reacción hidrolítica, el tampón de parada, una mezcla de 0,3 M de glicina y NaOH (12,0 g/L a pH 10,6), termina la descomposición de la quitina creando un entorno que es demasiado básico para que la enzima funcione.
<ol><li>
Prepare los sustratos, estándares y soluciones.
	<ol>
<li>Preparen el buffer de McIlvain. El tampón de McIlvain se compone de citrato de 0,1 M y fosfato de 0,2 M a un pH de 5,2. Diluir en una proporción de 1:1 para 1x amortiguador McIlvain.</li>
		<li>Disolver 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose y 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetylchitotriose en 1x McIlvain Buffer a una concentración de 500 m cada uno. NOTA: La solución de stock se puede almacenar a -20 oC para usos posteriores; mejor almacenado en alícuotas.</li>
		<li>Disolver estándar, 4-metilumbelliferona, a una concentración de 0,1 mM en tampón de tope (mezcla de 0,3 M de glicina y NaOH (12,0 g/L a pH 10,6)) para crear la solución de stock de curva estándar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cree y pelar la solución de trabajo.
	<ol>
<li>Combine 1 x tampón de McIlvain y sustrato de quitina 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose para crear la solución de trabajo. Por cada 10 muestras, mezcle 100 ml de sustrato con 2,17 ml de 1 l de tampón McIlvain. Consulte la Tabla 1 para obtener cálculos adicionales basados en el tamaño de la muestra. NOTA: Utilice 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetilchitotriose para muestras humanas. Mientras que ambos sustratos pueden ser acuchillados por enzimas humanas o de ratón, se hanasignado para muestras humanas o de ratón basadas en la eficiencia del escote 6.</li>
		<li>Pipetear 95 l de solución de trabajo en cada pocal de una placa de 96 pocillos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agregue muestras de bioespecímenes a la solución de trabajo.
	<ol>
<li>A continuación, añadir 5 l de la muestra de prueba (sangre/BAL/lisato tisado/otro líquido biológico) a cada poca.</li>
		<li>Mezcle la muestra en la solución de trabajo para obtener los resultados más precisos y fiables. NOTA: Las muestras deben ejecutarse en duplicados/triplicados con especial atención a los posibles efectos de borde. Todas las muestras deben precalentarse para minimizar el efecto de borde. Como el ensayo implica una reacción entre las chitinasas en la muestra y el sustrato en la solución de trabajo, es mejor trabajar con relativa rapidez para minimizar la diferencia de tiempo entre el momento en que se chapa la primera muestra y la última muestra. Se recomienda pipeta multicanal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubar a 37oC.
	<ol>
<li>Cubra el plato y agite brevemente (5 s).</li>
		<li>Incubar la placa a 37oC durante 15 min. Esto permite que la reacción enzimática tenga lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare la curva estándar.
	<ol>
<li>Mientras las muestras están incubando, preparar una dilución en serie de 4-metilumbelliferone, un estándar utilizado a menudo en la determinación fluorimétrica de la actividad enzimática.</li>
		<li>Diluir el stock de la solución estándar en tampón de tope a una concentración de 5 m.</li>
		<li>Realice una serie de diluciones como se indica en la Tabla2. Agregue los componentes en la cantidad indicada y mezcle bien. NOTA: La curva estándar ayuda a garantizar que las muestras medidas caigan en el rango lineal de la curva estándar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Detenga la reacción con el búfer de parada.
	<ol>
<li>Añadir 200 l de tampón de parada a cada pozo para detener la reacción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Placa los estándares.
	<ol>
<li>Añadir 300 s de cada estándar por pozo en duplicados en la misma placa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lea la placa con un lector fluorométrico.
	<ol>
<li>Lea la placa a una excitación de 360 nm, y una emisión de 455 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análisis de datos
<ol><li>
Restar los espacios en blanco
	<ol>
<li>Promedio de los valores de las diluciones estándar duplicadas que no tienen 4-metilumbelliferone. Reste este valor de todos los demás valores registrados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tome el promedio de réplicas técnicas y trace los estándares.
	<ol>
<li>Promedio de las dos lecturas para cada concentración y graficar la lectura promedio por concentración. NOTA: La gráfica resultante debe parecer lineal y tener un valor R2 cercano a 1. Si no lo hace, puede ser necesario rehacer las normas y volver a leer la placa para garantizar la calidad del análisis de datos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estandarizar los valores de lectura.
	<ol>
<li>Cree la línea de ajuste más adecuada para los datos de normas trazados. Divida las lecturas de las muestras por la pendiente de la línea de mejor ajuste.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compare los valores del grupo de control y el grupo de variables.
	<ol>
<li>Utilice una prueba t o Un ANOVA, para más de dos grupos, para determinar si la diferencia entre grupos es estadísticamente significativa. Los valores tomarán las unidades nmol/mL-h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

La actividad chitinasa ha surgido como un biomarcador importante para predecir la gravedad de la enfermedad, la progresión de la enfermedad, la eficacia terapéutica y la presencia de patógenos específicos18. Aunque muchas de las teorías de largo postulado sobre el papel de las chitinasis no han sido probadas experimentalmente19, nuevos estudios han proporcionado información importante sobre el papel de las chitinasis y las chitinasas como proteínas en varias enfermedades<su...

La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la tierra después de la celulosa, sirviendo como un componente estructural importante de una variedad de organismos incluyendo el exoesqueleto de insectos, hongos, levaduras y algas; algunos vertebrados también tienen quitina1. Las chitinasas son una familia de enzimas que son capaces de descomponer la quitina y están altamente conservadas a lo largo de la evolución en especies que van desde bacterias hasta mamíferos2,3. Además de las chitinasis, los mamíferos también tienen proteínas similares a las chitinasas que son similares a las chitinasas en su capacidad para unir la quitina pero difieren en que carecen de capacidad enzimática para cortar la quitina4.
Aunque la quitina y las chitinasis han sido estudiadas durante mucho tiempo, con investigaciones que se remontan a principios de 1900, el enfoque principal ha estado en su papel en insectos y otros invertebrados. De hecho, no fue hasta la década de 1960 cuando se encontró que los vertebrados tenían chitinasis en absoluto. Utilizando un ensayo a base de chitobiase, se demostró que las chitinasas se encuentran en el tracto digestivo de una serie de vertebrados, incluyendo lagartos y mirlos, una observación que se presume que se debe al consumo de organismos que contienen quitina como insectos5 .
Los mamíferos tienen dos formas enzimáticamente activas de chitinasa: chitinasa de mamíferoá ácida (AMCase; también conocida como CHIT2 y CHIA) y chitotriosidasa (CHIT1)4. Ambas proteínas son capaces de hidrolizar la quitina. Sin embargo, CHIT1 es más activo en los seres humanos, donde casi toda la actividad chitinasa se deriva de CHIT1. 4 En ratones, tanto Chit1 como AMCase contribuyen casi por igual a la actividad general de la chitinasa6. Por otro lado, las proteínas similares a la chitinasa carecen de actividad de la chitinasa.
Chit1 se secreta principalmente por macrófagos y a menudo se considera como una respuesta inmune a los patógenos que contienen quitina7. La enzima también ha demostrado estar implicada en la maduración de monocitos en los subtipos de macrófagos M1 y M2, incluso sin la presencia de la quitinadesustrato 8. Además, también puede estar involucrado en la maduración de otras células inmunitarias, incluyendo t helper tipo 2 (Th2) células y eosinófilos, como se demostró que era el caso en la infección pulmonar criptocócica9. Estos estudios apuntan a un papel complejo de las chitinasas en el sistema inmunológico.
En los últimos años, se ha encontrado que los niveles de Chit1 sirven como un importante biomarcador de progresión para más de 40 enfermedades humanas diferentes, incluyendo enfermedades de almacenamiento lisosomal, enfermedades infecciosas, enfermedades respiratorias, enfermedades endocrinológicas, enfermedades neurológicas y otras (revisadas10). En muchas de estas enfermedades, los niveles de Chit1 son un fuerte predictor de la gravedad de la enfermedad y la eficacia terapéutica10.
Como las chitinasis se han ganado una reputación como un biomarcador para numerosas condiciones médicas incluyendo la enfermedad de Gaucher, se han desarrollado herramientas y ensayos para facilitar las pruebas de presencia de chitinasa. Los métodos más antiguos incluyen el procedimiento de Schales, un protocolo adaptado de una prueba de glucosa en sangre y el método de ácido dinitrosalicílico 3,5 (DNS). Sin embargo, estos métodos son a menudo sensibles al tiempo y técnicamente difíciles11. El procedimiento para ambas pruebas requiere la reducción de oxidantes inorgánicos, ferricyanida en el caso del procedimiento de los Schales, por ejemplo, produciendo un cambio de color que sólo puede medirse espectrofotométricamente. Además, ambas pruebas implican un paso de calentamiento o ebullición que consume mucho tiempo y es necesario para que el color se desarrolle12,13.
Aquí se describe un ensayo fluorado rápido y simple para determinar los niveles de chitinasa en muestras de mamíferos14,15. Dos de las muestras utilizadas aquí incluyen suero y líquidos de lavado broncoalveolar (BAL); la actividad de la chitinasa también se ha medido en muestras de leche materna y orina, y la técnica se puede realizar en ese tipo de muestras, así como en cualquier otro fluido biológico16,17.

<table><tbody><tr><td>4-metilumbeliferona</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Estándar: comúnmente utilizado en ensayos fluorimétricos para la determinación de la actividad enzimática</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc2</td><td>Sigma</td><td>M9763</td><td>sustrato de quitinasa fluorescente para uso en muestras de ratón</td></tr><tr><td>4MU-GlcNAc3</td><td>Sigma</td><td>M5639</td><td>sustrato de quitinasa fluorescente para uso en muestras humanas</td></tr><tr><td>Ácido cítrico-monohidrato</td><td></td><td></td><td>para uso en McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>Glicina</td><td></td><td></td><td>para uso en Stop Buffer a una concentración de 0,3 M</td></tr><tr><td>Na2HPO4xH2O</td><td></td><td></td><td>para uso en McIlvain Buffer</td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td>para uso en Stop Buffer a una concentración de 12 g/L</td></tr><tr><td>Placa de visión: Placa de 96 pocillos negra no estéril, sin tratar,</td><td>4titude</td><td>4ti-0224</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Las chitinasas son las enzimas que se paran la quitina. Incluso en ausencia de quitina, los mamíferos tienen cantidades significativas de chitinasis presentes en el cuerpo, incluso al inicio. El papel preciso de la chitinasa no se conoce, sin embargo se creía que desempeña un papel importante en la digestión y la defensa del huésped contra los alimentos y patógenos que contienen quitina, respectivamente. El trabajo reciente, incluido el nuestro, ha demostrado un importante papel de las proteínas de chitinasa y las proteínas similares a las chitinasas en la inmunidad al huésped y las enfermedades alérgicas. Es importante destacar que las actividades de la chitinasa sirven como biomarcadores importantes de la gravedad de la enfermedad en una amplia gama de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias de tipo 2 como el asma y la fibrosis pulmonar. Del mismo modo, los pacientes con trastornos genéticos como la enfermedad de Gaucher tienen niveles significativamente elevados de chitinasa, que no sólo se correlacionan con la gravedad de la enfermedad, sino que también sirven como un biomarcador fiable para la eficacia terapéutica. El protocolo descrito aquí describe una manera simple, rápida y directa de medir la actividad de la chitinasa en BAL o muestras séricas de ratones y puede ser ampliamente adaptado a sujetos humanos y otros organismos modelo debido a la naturaleza altamente conservada de las enzimas.

Los resultados mostrados aquí provienen de un estudio que mide la actividad de la chitinasa en muestras de suero y BAL de tipo silvestre (C57BL/6) y ratones transgénicos Chit1 (sobre fondo C57BL/6) que sobreexpresan el gen Chit1 en un promotor de doxiciclina. Nuestros datos muestran que tanto las muestras de suero como de BAL tienen una actividad de chitinasa detectable en la línea de base 698,2 a 189,9 nmol/mL-h y 485,7 a 114 nmol/ml-h, respectivamente. La sobreexpresión del gen Chit1 utilizando doxiciclina en el agua p...

Aquí se presenta un método sencillo para medir la actividad de la chitinasa en fluidos biológicos como el lavado broncoalveolar o el suero.

Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Este método permite una forma más eficaz de cuantificar la actividad de la chitinasa en muestras biológicas. Se ha demostrado que la actividad chitinasa sirve como un buen marcador para el diagnóstico y la eficacia terapéutica en numerosas condiciones y enfermedades. Los métodos anteriores para la medición de la actividad de la chitinasa eran a menudo lentos y difíciles de realizar, ambos problemas que han sido resueltos por el ensayo que se muestra aquí.Esta técnica ayudará a cumplir las posibles chitinasas tienen como marcador diagnóstico y terapéutico al facilitar la medición de la actividad de la chitinasa;por ejemplo, se puede utilizar para controlar el tratamiento de la enfermedad de Gaucher porque se ha demostrado que la actividad chitinasa disminuye durante el tratamiento eficaz. Comience preparando sustratos, estándares y soluciones para el ensayo. Prepare 1 tampón de McIlvain de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y utilícelo para diluir sustratos de quitina a 500 micromolares cada uno.Disolver 4-methylumbelliferone, el estándar, a una concentración de 0,1 milimolar en tampón de parada para crear una solución de stock de curva estándar. Por cada 10 muestras, mezcle 2,17 mililitros de 1x tampón de McIlvain con 100 microlitros del sustrato de quitina para crear una solución de trabajo, luego pipetee 95 microlitros de la solución de trabajo en cada pozo de una placa de 96 pozos. Agregue cinco microlitros de la muestra de prueba a cada pozo y mezcle en la solución de trabajo.Cubra el plato y agítelo durante cinco segundos, luego incuba la placa a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que la reacción enzimática tenga lugar. Mientras tanto, diluir la solución de stock de 4-methylumbelliferone para hacer una solución estándar de trabajo de cinco micromolares y crear una curva estándar mediante la preparación de una serie de diluciones según el manuscrito. Comience con la concentración de cinco micromolares y mezcle bien cada dilución.Después de la incubación, añadir 200 microlitros de tampón de parada a cada pocóltil para detener la reacción. Añadir duplicados de 300 microlitros de cada estándar a la misma placa, luego leer la placa en una excitación de 360 nanómetros y una emisión de 455 nanómetros. Este protocolo se utilizó con éxito para medir la actividad de la cintinasa en el lavado broncoalveolar y el líquido sérico de tipo salvaje y chitotriosidasa sobre-expresar ratones transgénicos.El ensayo confirma que la sobreexpresión del gen CHIT-1 en ratones da lugar a un aumento de la actividad de la chitinasa. Se utilizó una curva estándar para determinar la chitinasa basándose en la fluorescencia de las muestras. Lo más importante a recordar al intentar el protocolo por primera vez es agregar las muestras de la forma más rápida y eficiente posible mientras se mezcla a fondo.Cuando comience, puede ser beneficioso hacer menos muestras por carrera para garantizar la precisión en las mediciones, debido a un período de incubación más corto.

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Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se describe un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección de hongos en la actividad...

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Este video muestra un ensayo para detectar enzimas efectivas en la degradación de polisacáridos complejos en biomasa vegetal utilizando biomasa cromogénica insoluble o ICB. Las enzimas hidrolizan ICB para liberar oligosacáridos solubles ligados a colorantes, y la actividad enzimática se evalúa mediante un análisis colorimétrico del producto de la reacción.

Cribado de enzimas basadas en biomasa cromogénica insoluble: un ensayo para evaluar la actividad de degradación de las enzimas degradadoras de biomasa vegetal

Este video muestra la medición in vitro de la actividad enzimática para la α-galactosidasa A y la α-glucosidasa ácida en muestras utilizando sustratos sintéticos de 4-Methylumbelliferilo.

Medición in vitro de la actividad de la enzima α-galactosidasa A y α-glucosidasa ácida

Aquí, presentamos protocolos para cribar y caracterizar rápidamente la actividad antimicrobiana de las enzimas. El ensayo de difusión de microportaobjetos y el ensayo de liberación de colorante utilizan sustratos bacterianos objetivo para la evaluación cualitativa y cuantitativa de la actividad enzimática.

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Se describe un ensayo de alto rendimiento para el cribado enzimático. Este kit de ensayo multiplexado y listo para usar se compone de sustratos Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) preseleccionados y sustratos C insolubles complejos C hromogenicB iomass (ICB). Las enzimas diana son endoenzimas degradadoras de polisacáridos y proteasas.

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Describimos un protocolo básico para cuantificar la actividad de la ATPasa in vitro. Este protocolo se puede optimizar en función del nivel de actividad y los requisitos de una ATPasa purificada determinada.

Medición<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividad ATPasa para enzimática Caracterización

Aquí, describimos un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina de histonas modificadas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ADN se utiliza posteriormente para PCR cuantitativa para interrogar la abundancia y localización de modificaciones post-traduccionales de las histonas por todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Describimos un método modificado basado en agar diseñado para cuantificar los efectos antifúngicos de los productos derivados de plantas. Las contribuciones volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica se pueden evaluar a través de este protocolo. Además, la eficacia contra hongos se puede medir en etapas clave del desarrollo en una sola configuración experimental.

Medición de la actividad antifúngica volátil y no volátil de los productos biocontrol

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Cuantificación de la actividad antifúngica de péptidos contra Candida albicans

En este trabajo se presentan métodos ecotoxicológicos estandarizados para la evaluación de biomarcadores en especies de anuros neotropicales. Específicamente, este artículo detalla varias metodologías a diferentes escalas de evaluación ecotoxicológica, como los niveles genético, celular-histológico, bioquímico, morfológico e individual.

Metodologías ecotoxicológicas para evaluar biomarcadores a diferentes escalas en anuros neotropicales

Aprenda a medir la actividad de la chitinasa en líquidos biológicos como lavado broncoalveolar o suero. Este método simplifica la cuantificación enzimática para diagnóstico clínico y monitoreo terapéutico eficaz.

Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas

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