Name: Generación de gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer en un acelerador de evolución microfluídica para la observación en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a generar gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer usando un acelerador de evolución microfluídico. Esta tecnología permite estudios cuantitativos de dinámica celular en tiempo real para desarrollo preclínico.

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Este trabajo fue apoyado por NSF PHY-1659940.

1. Fabricación de dispositivo microfluídico
<ol><li>Genere el patrón microfluídico deseado utilizando un software de diseño (consulte Materiales suplementarios).</li>
	<li>Fabrica la fotomáscara. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.<ol>
<li>Utilizando un escritor láser, escriba el patrón en una placa de vidrio de soda y cal recubierta con 100 nm de Cr y 500 nm de fotorresistente AZ1518.</li>
		<li>Desarrolle el fotorresistente con el desarrollador AZ300MIF durante 60 s.</li>
		<li>Etch lejos del cromo sin protección contra el fotorresistente usando Cr-7 Chromium Etchant.</li>
		<li>Desmonte el fotorresistente residual con una stripper fotorresistente a 70 oC durante 45 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Patrón del fotorresistente. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.<ol>
<li>Capa de giro HMDS en oblea de silicio a 4000 rpm durante 40 s.</li>
		<li>Fotorresistente de capa de giro AZ4330 en oblea de silicio a 4000 rpm durante 40 s.</li>
		<li>Hornee suavemente la oblea de silicio a 95oC durante 60 s.</li>
		<li>Utilice el alineador de máscara para exponer UV a la oblea de silicio.</li>
		<li>Desarrolle el fotorresistente con el desarrollador AZ300MIF durante 4 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realice el grabado DRIE. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.<ol>
<li>Seca la oblea modelada con el fotorresistente utilizando un sistema de grabado de iones reactivos profundos de silicio (DRIE) para una profundidad de 100 m.</li>
		<li>Retire el fotorresista con acetona y plasma con un etcher de plasma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Oxidación y silanización de obleas. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.<ol>
<li>Realizar la oxidación térmica en la oblea de silicio grabado en un horno a 1100 oC durante 1 h.</li>
		<li>Espere a que la oblea de silicio se enfríe, y luego coloque la oblea en un desecador con unas gotas de tricloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctil-silano (PFOTS) goteado en un pequeño recipiente cerca de la oblea.</li>
		<li>Bombee la presión del desecador a 0,5 atm a temperatura ambiente durante 60 min. El molde de oblea de silicio debe volverse hidrófobo después de una silanización adecuada, que se puede probar añadiendo varias gotas de agua a la oblea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Litografía suave. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.<ol>
<li>Mezclar prepolímero y reticulador (del kit de polimetilsiloxano (PDMS)) en una proporción de peso de 10:1.</li>
		<li>Vierta el PDMS mixto para crear una película de 10 mm de altura sobre el molde de oblea de silicio silanizado.</li>
		<li>Desgasifique el sistema de obleas de silicio PDMS resultante en un desecador durante 30 min a 1 h.</li>
		<li>Incubar la oblea de silicio PDMS en una incubadora de 70 oC durante la noche para curar el PDMS.</li>
		<li>Una vez que el PDMS esté curado, pele la película PDMS de la oblea de silicio con cuidado.</li>
		<li>Usando agujas de biopsia, perforar agujeros pasante en los puertos de entrada en función de la ubicación del patrón en el PDMS y emplear un punzón circular para cortar virutas de 27 mm de diámetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vinculación de capas PDMS.<ol>
<li>Curar térmicamente dos pilas de cilindros PDMS de 27 mm (sin patrón), que se convertirán en la capa de depósito y la capa de tapado del dispositivo.</li>
		<li>Corte dos círculos de 7 mm alrededor de las entradas en la capa del depósito y utilice una aguja de biopsia para perforar agujeros a través de los puertos de entrada en la capa de tapado.</li>
		<li>Enlace tres pilas de PDMS (pila de patrones, capa de depósito, capa de tapado) con tratamiento de plasma de oxígeno.</li>
		<li>Con la aguja de biopsia, perforar los orificios en las salidas y el puerto central del dispositivo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de medios y líneas celulares
<ol><li>Prepare medios para el cultivo de líneas celulares PC3, incluyendo PC3-EMT y PC3-EPI: mezclar el medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1x antibiótico-antimicótico. Generar líneas de celda como se describió anteriormente14. NOTA: Las líneas celulares PC3 se mantienen en los medios anteriores en incubadoras humidificadas a 37 oC con un 5% deCO2. Células divididas y subcultura cada 3 días, antes de que alcancen el 100% de confluencia.</li>
	<li>Líneas celulares transfectos con marcadores fluorescentes etiquetados citoflásmicos para una mejor visualización, como se describió anteriormente12,de modo que PC3-EMT expresa GFP citoplasmático y PC3-EPI expresa mCherry citoplasmático. Tenga en cuenta que la tecnología también es compatible con cualquier célula etiquetada fluorescente, así como con imágenes de campo brillante de células sin etiquetar.</li>
</ol>3. Configuración experimental
<ol><li>Fabricación de soporte de placa metálica<ol>
<li>Fabricar un soporte de placa que sea suficiente para contener platos de cultivo permeables al gas simultáneos para experimentos paralelos mediante mecanizado o impresión 3D. El archivo CAD 3D ("placa de 3 pocillos. FCStd") se puede encontrar en GitHub como referencia (https://github.com/kechihl/3-well-plate).</li>
		<li>Desenrosque los componentes del soporte(Figura 2)con un destornillador. Desinfectar los componentes a través de la exposición UV durante al menos 1 h y dejar en un ambiente estéril. NOTA: El soporte está diseñado para proporcionar condiciones sustanciales para el equilibrio térmico y composiciones de gas ideales, con entradas de canal de gas que permiten el flujo de aire. Más detalles se pueden encontrar en nuestro trabajo anterior12.</li>
		<li>Preparar hasta tres platos de cultivo permeables al gas, de los cuales la membrana de cultivo celular es relativamente flexible.</li>
	</ol></li>
	<li>Sembrado de líneas celulares<ol>
<li>24 horas antes del inicio del experimento, cosechar células PC3-EPI y PC3-EMT por trippsinización durante 5 min. Añadir medios de cultivo precalentados, luego centrifugar a 150 x g durante 3 min y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Cuente las células de cada PC3-EPI y PC3-EMT utilizando un hemocitómetro y aísle un total de 2,5 x 104 de cada tipo de celda para cada plato de cultivo permeable al gas.</li>
		<li>Mezclar y resuspender los dos tipos de células en 2 ml de medios de cultivo y sembrar las células en cada uno de los platos de cultivo permeables al gas.</li>
		<li>Deje todo el soporte de la placa en la incubadora durante la noche para que las células se adhieran.</li>
		<li>Desinfectar los dispositivos PDMS a través de la exposición UV durante al menos 1 h y dejar en un entorno estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuración de la unidad de control térmico y del sistema de suministro de gas<ol>
<li>Como se muestra en la Figura 3,configure un sistema de suministro de gas que consta de unidades de control de CO2 y O2, una bomba de gas, una cámara de mezcla de gas, un humidificador o burbujeador, y tres juegos separados de válvulas de gas y manómetros. Más detalles se pueden encontrar en nuestro trabajo anterior12.</li>
		<li>Configure las unidades de control CO2 y O2 de forma que ajusten la velocidad de mezcla del gas de los tanques CO2 y N2 y la fuente O2. Alternativamente, cualquier sistema de suministro de gas que proporcione gas bajo condición de normoxia funcionaría.</li>
		<li>Asegúrese de que el gas que se combina en la cámara de mezcla y humidificado por un burbujeador de tal manera que la humedad relativa se incrementa hasta un 85% (como se lee desde un monitor de humedad relativa) y que el gas conduce a tres válvulas de gas independientes con manómetros para controlar y supervisar el caudal de gas en el soporte de la placa.</li>
		<li>Coloque todo el soporte de la placa en una unidad de control térmico de incubación en el escenario con subunidades de calentamiento separadas para la tapa y la placa inferior, con todas las unidades fijas a 37 oC. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.</li>
	</ol></li>
	<li>Instalación de dispositivo microfluídico. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.<ol>
<li>Identifique que los componentes detallados del soporte de placa de 3 pocillos están en orden, como en la Figura 2. Cada uno de los tres pozos son idénticos e independientes, con un par de canales de gas para cada poca. Cada pozo posee un soporte para platos de cultivo permeable a gas, un porta virutas PDMS, un soporte de ventana de vidrio y un par de ventanas de vidrio de 35 mm. Estos componentes se pueden montar con los tornillos ajustados. NOTA: Las ventanas de vidrio garantizan que haya un espacio térmicamente aislado entre la membrana de cultivo permeable al gas y el pozo de tal manera que no se produzca condensación de agua debido a las diferencias de temperatura en la interfaz. Tenga en cuenta que los 3 pozos son independientes, y 3 experimentos se pueden hacer por separado.</li>
		<li>Medio de cultivo precálido a 37oC y desgasificación en cámara de vacío durante 20 min.</li>
		<li>Tratar los chips PDMS utilizando un sistema de plasma de oxígeno para 30 s con el fin de mantener la hidrofilicidad.</li>
		<li>Configure el sistema de jeringas. Cargue dos jeringas lentamente con medios de crecimiento y otras dos jeringas con el reactivo de interés deseado (medios, medios con fármaco, etc.). Conecte cada jeringa individual a un tubo de 50 cm (0,020" x 0,060 oD) por una aguja dispensadora de 23 G en un pasador de acero hueco. Inserte un pasador de acero hueco en el otro extremo del tubo.</li>
		<li>Póntelo en el tubo e inserte el pasador de acero en cada chip PDMS a través de la capa de tapado. Rellene la capa de depósito y moje el patrón de capa de patrón PDMS con medios. La capa del depósito funciona como una trampa de burbujas en chip para evitar que las burbujas de aire entren en el patrón microfluídico.</li>
		<li>Cargue una jeringa de 1 ml con medios de cultivo. Conecte la jeringa a un tubo de 5 cm (0,020" x 0,060 oD) por una aguja dispensadora de 23 G en un pasador de acero hueco. Inserte un pasador de acero hueco en el otro extremo del tubo y ceba el tubo.</li>
		<li>Inserte el pasador de acero hueco en el orificio central de la viruta, donde se pueden extraer medios excesivos del chip más adelante durante el proceso de sellado de la viruta.</li>
		<li>Como cada dispositivo PDMS requiere cuatro jeringas de 10 ml cargadas en una bomba de jeringa, cargue dos jeringas de 10 ml por chip en la cubierta delantera. Coloque las otras dos jeringas en la cubierta de retirada del sistema de jeringas.</li>
		<li>Coloque el chip directamente encima de las membranas de cultivo permeables al gas (con las células ya adheridas a las membranas). Para evitar atrapar microburbujas en el patrón microfluídico, dispensar 1 ml de medios precalentados y desgasificados en el plato de cultivo permeable al gas de 35 mm antes del montaje, y luego asegurarse de que el chip se acerca a la superficie líquida con un ángulo de inclinación de 15 grados.</li>
		<li>Sujete el plato de cultivo permeable al gas y el pozo en el soporte de plato de cultivo permeable al gas para cada chip, con el soporte de chip PDMS empujando el dispositivo PDMS hacia abajo.</li>
		<li>Pegue una hoja de un sellador encima del dispositivo PDMS y sujete con el soporte de chip PDMS para evitar que el chip se seque.</li>
		<li>Establezca el caudal de medios alrededor de la matriz en 20 l/h.</li>
		<li>Fije toda la placa en la incubadora en el escenario en la etapa motorizada de un microscopio invertido. Conecte el sistema de suministro de gas a los canales de gas y presurizar la membrana de cultivo permeable al gas contra el chip PDMS instalado para garantizar el sellado del dispositivo. Mantenga la presión del manómetro a 0,2 psi (1,4 x 104 Pa).</li>
		<li>Extraiga lentamente los medios excesivos en el chip utilizando la jeringa de 1 ml del orificio central. Observe el chip debajo del microscopio mientras extrae el medio y luego deje de extraerlo cuando el chip esté sellado. El sellado de virutas debe ser obvio ya que una parte de las células sería aplastada por las microestructuras.</li>
		<li>Conecte la unidad de sensor de temperatura de la incubadora en el escenario a la placa de 3 pocillos y establézla a 37 oC.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imágenes de lapso de tiempo de una sola célula
<ol><li>Configure el software de imágenes utilizando un microscopio invertido para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Tenga en cuenta que se requiere un microscopio fluorescente invertido con etapa x-y totalmente motorizada, perilla de enfoque, obturador y cubos de filtro para un experimento de EA.</li>
	<li>Configure el software para adquirir imágenes a través de dos canales con un aumento de 10x para cada chip con costura automática de imágenes después de una ronda de enfoque automático. Tenga en cuenta que los sistemas de corrección automática como Perfect Focus no garantizan una calidad de imagen satisfactoria. Es más recomendable generar una superficie de enfoque personalizada para la adquisición de imágenes a largo plazo basada en el enfoque automático o el enfoque manual a través del chip.</li>
	<li>Tome imágenes cada hora y deje el experimento en ejecución en la escala de tiempo de las semanas. Supervise la calidad de la imagen a diario y actualice la superficie de enfoque si es necesario.</li>
	<li>Preparar el chip PDMS y el plato de cultivo permeable al gas para el posterior análisis inmunofluorescente, como se describió anteriormente13.</li>
</ol>5. Procesamiento y análisis de imágenes
<ol><li>Procesamiento post-experimental<ol>
<li>Convierta imágenes en formato TIFF para el procesamiento de imágenes y mediciones utilizando Fiji/ImageJ.</li>
		<li>Comprima archivos TIFF para facilitar el procesamiento de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis Fiji/ImageJ<ol>
<li>Para identificar celdas, realice la resta de fondo y el análisis de partículas para identificar puntos brillantes fluorescentes para la detección de ubicación de celdas y el recuento automático de celdas.</li>
		<li>Utilice plugins (Seguimiento Manual, Chemotaxis, Herramienta de Migración, Trackmate) para analizar la motilidad celular y la migración.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

El cultivo celular convencional se desarrolló hace casi un siglo y sigue siendo el modelo preclínico más utilizado en la investigación biomédica, a pesar de su probada capacidad limitada para predecir los resultados clínicos en el cáncer17. Los modelos animales ofrecen la mayor relevancia fisiológica y una similitud genética razonable con los seres humanos, pero durante mucho tiempo se ha reconocido que tienen limitaciones significativas en la predicción de los resultados humanos...

El cáncer ha sido cada vez más reconocido como un ecosistema complejo que depende no sólo de la continua desregulación de las poblaciones de células mutadas, sino también de las interacciones vitales entre las células cancerosas y el microambiente huésped. En este sentido, el cáncer evoluciona en un paisaje adaptativo manifestado por una combinación de factores, incluyendo un microambiente tumoral heterogéneo y una conversación cruzada con una variedad de células huésped, todas las cuales contribuyen a presiones selectivas para cambios epigenéticos1,2,3. En el contexto de tumores sólidos, la distribución desigual de quimioterapia y otros gradientes de recursos contribuye a su heterogeneidad molecular y puede desempeñar un papel en el desarrollo de la resistencia a los fármacos, el aumento de la angiogénesis a un tumor subpoblaciones, e incluso metástasis4,5,6. Los estudios convencionales de cultivo de células 2D in vitro, aunque poseen una capacidad experimental conveniente y a gran escala, proporcionan condiciones de campo medio, uniformes y fijas, a menudo carentes del control ambiental espacial y temporal preciso necesario para emular la dinámica tumoral in vivo. Por lo tanto, es necesario que los modelos ex vivo más representativos reproduzcan el microambiente tumoral antes de los modelos animales en el gasoducto de desarrollo de fármacos con el fin de una mejor predicción de la progresión del cáncer, así como respuestas a los fármacos dentro del estrés dinámico Paisajes. Se han propuesto microfluidos para cerrar la brecha entre los estudios de cultivo celular 2D y estudios en animales in vivo más complejos que pueden no ser capaces de soportar estudios cuantitativos controlables7,8,9.
Un sistema in vitro ideal para caracterizar la dinámica celular del cáncer debe poseer la capacidad de generar un microambiente heterogéneo para imitar las respuestas celulares adaptativas que pueden tener lugar en un tumor, así como permitir la observación de estas dinámicas en un resolución de una sola célula. En este artículo, describimos una plataforma de cultivo celular microfluídico, un dispositivo basado en PDMS llamado "Evolution Accelerator" (EA), que permite estudios in vitro paralelos de la dinámica celular del cáncer a resolución celular con la adquisición de datos en tiempo real semanas, manteniendo establemente gradientes de estrés en todo el paisaje cultural. El diseño de esta plataforma se basa en nuestro trabajo anterior, en el que la dinámica evolutiva de los organismos en una metapoblación se puede acelerar10,11. Específicamente, en un grupo de poblaciones separadas espacialmente que interactúan a algún nivel, cuando se exponen a un paisaje de estrés heterogéneo, las especies más adecuadas pueden dominar en una población local más rápido en comparación con la de una gran población uniforme. Las especies ventajosas emigran a los microhábitats vecinos en busca de recursos y espacio, y eventualmente dominan a toda la población. Como se muestra en la Figura 1, el patrón del chip microfluídico EA se compone de (i) un par de canales de serpentina que proporcionan una circulación de medios fresca y construyen condiciones límite fijas para la difusión química, y (ii) la región de cultivo celular hexagonal que consta de 109 cámaras hexagonales interconectadas y 24 cámaras semihexagonales en el centro, que se asemejan a una estructura de panal. El chip tiene una profundidad de 100 m. Los canales de medios y la región de cultivo celular están conectados con pequeñas hendiduras (alrededor de 15 m de ancho), que evitan el flujo directo de medios y la tensión de cizallamiento resultante en toda el área de cultivo celular, pero aún así permiten que los productos químicos se difundan a través de pequeñas rendijas e intercambien nutrientes, residuos metabólicos, etc. La generación de gradientes químicos se demuestra en la Figura 1B,donde un canal de medios contiene 0,1 mM de fluoresceína mientras que el otro canal está libre de fluoresceína. Las células se cultivan en una membrana permeable al gas, encapsulada por las microestructuras a través de la presión de retroceso positiva en la membrana contra el chip. Los componentes del soporte del dispositivo se ilustran en la Figura 2,y la configuración experimental se ilustra en la Figura 3,donde el cultivo se mantiene en un microscopio invertido a 37 oC, con una humedad relativa superior al 85% y acondicionado bajo composición de gas normoxia.
Este sistema proporciona una observación detallada de las interacciones celulares localizadas a través de canales fluorescentes y de campo brillante y permite ensayos aguas abajo resueltas espacialmente como inmunofluorescencia, mancha occidental o espectrometría de masas. Hemos demostrado anteriormente como una prueba de principio de este modelo microfluídico de cáncer en chip sobre el cocultivo a largo plazo de las células de cáncer de próstata PC3 epitelialymal12, así como la aparición del gigante poliploide de resistencia a los fármacos células cancerosas utilizando la línea celular epitelial PC313. Si bien presentamos la aplicación de esta plataforma para entender la dinámica espaciotemporal de las células epiteliales de cáncer de próstata PC3 y mesenquimales bajo un gradiente de estrés de docetaxel, el sistema microfluídico se puede aplicar fácilmente a cualquier combinación de líneas celulares y gradientes de recursos (es decir, drogas, nutrientes, oxígeno).

<table><tbody><tr><td>10 mL BD Jeringas con punta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>1x anti-anti</td></tr><tr><td>AZ 300 MIF</td><td>Merck KGaA</td><td>18441123163</td><td>Fotorresistente revelador</td></tr><tr><td>AZ1518</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ1518</td><td>Fotorresistente</td></tr><tr><td>AZ4330</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ4330</td><td>Fotorresistente</td></tr><tr><td>Cr Grabador</td><td>de cromo Sigma-Aldrich</td><td>651826</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66+ laserwriter</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>DWL66+</td><td>Fotomáscara de escritura</td></tr><tr><td>Hexametildisilazano (HMDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379212</td><td>Para la mejora de la adherencia fotorresistente</td></tr><tr><td>Pasadores de acero huecos</td><td>Nuevo Inglaterra Tubo Pequeño</td><td>NE-1300-01</td><td>&nbsp;. 025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard</td></tr><tr><td>ibidi Sistema de calefacción, placas multipocillos, K-Frame</td><td>ibidi</td><td>10929</td><td>Incubadora de escenario&nbsp;</td></tr><tr><td>Luer-Lok 23 G aguja dosificadora</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A684</td><td>Para conectar jeringas y tubos</td></tr><tr><td>Placa Lumox 35</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.331</td><td>Placa de cultivo celular permeable al gas</td></tr><tr><td>Microposit Remover 1165</td><td>Dow Electronic Materials Microposit</td><td>Remover 1165</td><td>Decapante fotorresistente Sellador</td></tr> adhesivo <tr><td>Microseal B Adhesivo</td><td>Bio-Rad Laboratories MSB1001</td><td></td><td>Adhesivo </td></tr><tr><td>junta tórica del sellador (para el sellado de placas Lumox)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K114</td><td>Dash No. 27; 1-5/16" de diámetro interno x 1-7/16" de diámetro exterior; Junta tórica Duro 70</td></tr><tr><td>(para el sellado de ventanas de vidrio inferior)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K74</td><td>Dash No. 20; 7/8" de diámetro interno x 1" de diámetro exterior; Duro 70</td></tr><tr><td>Plasma-Preen Sistema de limpieza/grabado por plasma</td><td>Plasmatic Systems, Inc</td><td>Plasma-Preen</td><td>Sistema de plasma de oxígeno</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Samco RIE800iPB DRIE</td><td>Samco RIE800iPB</td><td></td><td>Sistema de grabado de iones reactivos</td></tr><tr><td>profundos Alineador de mascarillas Suss MA6 Alineador de mascarillas</td><td>SUSS MicroTec</td><td>MA6</td>&<td>nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastómero de silicona</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>PDMS elastómero</td></tr><tr><td>TePla M4L grabador de plasma</td><td>PVA TePla</td><td>M4L</td><td>Grabador de plasma</td></tr><tr><td>Tricloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctil-silano (PFOTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Para silanización de obleas de silicio</td></tr><tr><td>Tubo de microdiámetro Tygon (0.020" x 0.060"OD)</td><td>Tubos Cole-Parmer</td><td>EW-06419-01</td><td> para la entrega de medios</td></tr></tbody></table>

generación de gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer en un acelerador de evolución microfluídica para la observación en tiempo real

Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation

El cultivo celular convencional sigue siendo el modelo preclínico más utilizado, a pesar de su probada capacidad limitada para predecir los resultados clínicos en el cáncer. Se han propuesto modelos microfluídicos contra el cáncer en chip para cerrar la brecha entre los cultivos 2D convencionales demasiado simplificados y los modelos animales más complicados, que tienen una capacidad limitada para producir resultados cuantitativos fiables y reproducibles. Aquí, presentamos un modelo microfluídico de cáncer en chip que reproduce los componentes clave de un microambiente tumoral complejo de una manera integral, pero es lo suficientemente simple como para proporcionar descripciones cuantitativas robustas de la dinámica del cáncer. Este modelo microfluídico de cáncer en chip, el "Acelerador de la Evolución", descompone una gran población de células cancerosas en una matriz interconectada de microambientes tumorales mientras genera un paisaje heterogéneo de estrés quimioterapéutico. La progresión y la dinámica evolutiva del cáncer en respuesta al gradiente de drogas se pueden monitorear durante semanas en tiempo real, y numerosos experimentos aguas abajo se pueden realizar de forma complementaria a las imágenes de lapso de tiempo tomadas a lo largo de los experimentos.

Validación del crecimiento celular óptimo en la viruta Uno de los principales objetivos de la plataforma de experimentos es reproducir componentes e interacciones clave en un microambiente tumoral complejo de una manera integral, pero lo suficientemente simple como para proporcionar datos cuantitativos, fiables y reproducibles. Este objetivo sólo puede lograrse si tenemos un control total de los factores ambientales físicos y bioquímicos. Debemos excluir los factores n...

Presentamos un modelo microfluídico de cáncer en chip, la tecnología "Evolution Accelerator", que proporciona una plataforma controlable para estudios cuantitativos a largo plazo en tiempo real de la dinámica del cáncer dentro de condiciones ambientales bien definidas en la sola célula Nivel. Se espera que esta tecnología funcione como modelo in vitro para la investigación fundamental o el desarrollo de fármacos preclínicos.

Generación de gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer en un acelerador de evolución microfluídica para la observación en tiempo real

Conventional cell culture remains the most frequently used preclinical model, despite its proven limited ability to predict clinical results in cancer. ...

Este modelo de cáncer microfluídico en chip que llamamos acelerador de evolución, proporciona una plataforma controlable para estudios cuantitativos a largo plazo y en tiempo real de la dinámica del cáncer dentro de condiciones ambientales bien definidas a un nivel de célula única. La tecnología nos permite sondear la dinámica evolutiva del cáncer bajo un paisaje de estrés similar a un tumor. Proporcionar información que incluye morfología, población, motilidad y migración a lo largo del tiempo a nivel celular.Con la capacidad de controlar y monitorear el comportamiento de las poblaciones de tumores mixtos bajo gradientes de estrés bien controlados, nuestra tecnología puede presentar un modelo más relevante fisiológicamente para el desarrollo de fármacos preclínicos. El método de envasado de sellado a presión presentado también se puede implementar en otros sistemas microfluídicos que requieren un ajuste sofisticado de la composición del gas ambiental, así como la capacidad de experimento aguas abajo. Las claves para realizar con éxito un experimento a largo plazo es asegurar un entorno estable física y bioquímicamente.Los factores, como la temperatura, la humedad y la composición

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un protocolo para la microfabricación del dispositivo de generación de gradiente de microfluidos que puede generar gradientes espaciales y temporales bien definidos microambiente. En este enfoque, el dispositivo de microfluidos gradiente de generación se pueden utilizar para estudiar la migración celular dirigida, la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la metástasis del cáncer.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

Se presenta el procedimiento para la fabricación y el funcionamiento de un dispositivo de microfluidos que recrea heterogéneos microambientes...

Dispositivo de microfluidos para volver a crear un microambiente tumoral<em&gt; In Vitro</em

Describimos un ensayo de sensibilidad a fármacos de alto rendimiento para células primarias de mieloma múltiple. Consiste en una reconstrucción del microambiente de la médula ósea (incluyendo matriz extracelular y estroma) en placas de pocillos múltiples, y un método no invasivo para la cuantificación longitudinal de la viabilidad celular.

Un Sistema organotípicos de alto rendimiento para la Caracterización de la sensibilidad a los fármacos de las células del mieloma múltiple primaria

El control de los gradientes químicos y de oxígeno es esencial para los cultivos celulares. En este artículo se presenta un dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato (PDMS-PC) capaz de generar de forma fiable combinaciones de gradientes químicos y de oxígeno para estudios de migración celular, que puede utilizarse prácticamente en laboratorios biológicos sin necesidad de instrumentación sofisticada.

Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Presentamos un sistema microfluídico para estudios de alto rendimiento en maquinaria de vida compleja, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. El chip microfluídico permite el análisis de las condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

La hipoxia es un sello distintivo del microambiente tumoral y desempeña un papel crucial en la progresión del cáncer. Este artículo describe el proceso de la fabricación de un cáncer-en-una-viruta hipóxico basado en tecnología de célula-impresión 3D para recapitular una patología hipoxia-relacionada del cáncer.

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip Para Recapitular la Progresión Patológica Del Cáncer Sólido

Aprenda a generar gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer usando un acelerador de evolución microfluídico. Esta tecnología permite estudios cuantitativos de dinámica celular en tiempo real para desarrollo preclínico.

Generación de gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer en un acelerador de evolución microfluídica para la observación en tiempo real (Video) | JoVE Journal

Generación de gradientes de drogas heterogéneas en poblaciones de cáncer en un acelerador de evolución microfluídica para la observación en tiempo real

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