Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago
30 de septiembre de 2019
En este documento, presentamos un protocolo detallado para la detección de pequeños péptidos que se unen a FGFR2 utilizando una biblioteca de péptidos de visualización de fagos. Analizamos más a fondo la afinidad de los péptidos seleccionados hacia FGFR2 in vitro y su capacidad para suprimir la proliferación celular.
En comparación con otros métodos, este protocolo es más fácil de encontrar nuevos antagonistas, agonisteres y moduladores alotéricos cuantitativa y cualitativamente sin conocer la estructura hidro-dilución y la formación de la proteína diana. Este protocolo es altamente eficiente, fácil de manejar, económico y disponible comercialmente. Combinando este método de cribado de alto rendimiento con el análisis ITC, los pequeños péptidos funcionales se pueden obtener cuantitativa y cualitativamente.
Demostrando el procedimiento serán Ying Zhao y Qiang Wang, estudiantes graduados de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de FGFR2 en tampón de recubrimiento a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Añadir un mililitro de la solución a un plato de 35 centímetros cuadrados y girar repetidamente hasta que la superficie esté completamente húmeda.
Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con temblores. Al día siguiente, vierta la solución de recubrimiento y agregue la solución de bloqueo preparada. Incubar a cuatro grados centígrados durante al menos una hora, luego desechar la solución de bloqueo y lavar rápidamente la placa seis veces con TBST mientras se asegura de que el plato no se seque.
Reconstituir la biblioteca de fagos original en un mililitro de TBST y añadir esto al plato recubierto. Mece suavemente el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esto, deseche el sobrenadante y lave el plato 10 veces con TBST.
Eluda el fago ligado añadiendo un mililitro de 0,2 molar glicina HCL al plato y balanceándose suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el eluyente a un tubo de microcentrífuga esterilizado y neutralícelo con 100 microlitros de un Molar Tris-HCL a pH 9.1. En primer lugar, precalienta las placas PREPARADAs LB e IPTG X-Gal a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes de su uso.
Usando puntas de pipeta con cartuchos de filtro, prepare 100 microlitros de diluciones diez veces del eluyente en LB. Después de que el cultivo de E.coli preparado alcance la fase de registro medio, dispensar 200 microlitros del cultivo en tubos de microcentrífuga esterilizado uno para cada dilución eluente. Para iniciar la infección, añadir 50 microlitros de cada dilución a los tubos que contienen el cultivo de E.coli. Vortex rápidamente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, utilice varillas de recubrimiento para recubrir las placas LB e IPTG X-GAL con 90 microlitros de esta mezcla. Después de cinco minutos, invierta las placas e incubarlas durante la noche a 37 grados centígrados. Cuente las placas cuando aparezcan.
Para empezar, diluir el cultivo nocturno en 20 mililitros de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros. Añadir el eluyente no amplificado e incubar a 37 grados Celsius con agitación vigorosa durante 4-1/2 horas. A continuación, centrifugar la cultura a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Centrifugar de nuevo utilizando las mismas condiciones y deseche el pellet. Transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo fresco y agréguelo a 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico.
Deje que el fago se precipite durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar el fago precipitado a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones.
Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en un mililitro de TBS y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco y precipite de nuevo añadiendo 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico. Incubar sobre hielo durante 15 a 60 minutos. A continuación, centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en 200 microlitros de TBS y centrífuga durante un minuto adicional para eliminar las impurezas.
A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco para obtener el eluyente amplificado. En este estudio, el número de aportes de fagos se mantiene sin cambios, mientras que la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 se reduce gradualmente. Los resultados del título de fagos sugieren que el número de fagos recuperados aumenta gradualmente y que después de tres rondas, hay un aumento de 65 veces en comparación con el de la primera ronda.
A continuación, se lleva a cabo un experimento de ITC para medir la afinidad del péptido pequeño con FGFR2. Los resultados indican que el péptido SP1 tiene una alta afinidad hacia FGFR2. Estos datos demuestran la eficacia del protocolo de cribado.
Para investigar la actividad biológica del péptido SP1, se realiza un ensayo de proliferación de fibroblastos utilizando un kit CCK-8. BALB/C3T3 se incuban con el péptido SP1 a diferentes concentraciones. Los resultados sugieren que el péptido SP1 suprime el crecimiento de las células.
La contaminación por fagos de tipo salvaje tiene que evitarse aquí. Asegúrese de utilizar puntas de pipeta resistentes a aerosoles. Mientras que el crecimiento mediante la obtención de amplificación de fagos.
Este procedimiento también se puede utilizar en la detección de pequeños péptidos que se unen a los carbohidratos, células de cultivo y tejidos. Esos péptidos pueden ser más amplificados sobre el diagnóstico y
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para la selección de péptidos pequeños que se unen a FGFR2 utilizando una biblioteca de péptidos con exhibición en fagos. El estudio analiza además la afinidad de los péptidos seleccionados hacia FGFR2 in vitro y su capacidad para suprimir la proliferación celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Farmacología
Antecedentes
- FGFR2 es un receptor fundamental implicado en diversos procesos celulares.
- La identificación de péptidos que se unen a FGFR2 puede conducir a nuevas estrategias terapéuticas.
- La tecnología de presentación en fagos es una herramienta potente para el cribado de péptidos.
- Este protocolo tiene como objetivo simplificar la identificación de moduladores de FGFR2.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método eficiente para la selección de péptidos que interactúen con FGFR2.
- Evaluar la afinidad de unión de los péptidos seleccionados.
- Evaluar los efectos biológicos de estos péptidos sobre la proliferación celular.
Métodos Utilizados
- Preparación de FGFR2 en tampón de recubrimiento.
- Uso de una biblioteca de péptidos con exhibición en fagos para cribado.
- Análisis de afinidad in vitro de los péptidos seleccionados.
- Evaluación de la supresión de la proliferación celular.
Resultados principales
- Identificación de varios péptidos con alta afinidad por FGFR2.
- Demostación de la capacidad de los péptidos seleccionados para inhibir la proliferación celular.
- Comparación de la eficiencia de este protocolo con otros métodos.
- Integración exitosa del cribado de alto rendimiento con el análisis por calorimetría isotérmica de titulación (ITC).
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para descubrir moduladores de FGFR2.
- Es eficiente, económico y fácil de usar.
- Este enfoque puede facilitar investigaciones adicionales sobre terapias relacionadas con FGFR2.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La selección mediante presentación en fagos de péptidos que se unen a FGFR2 aborda un desafío crítico inicial en el descubrimiento, al identificar moduladores novedosos para objetivos en oncología y señalización celular. Este protocolo permite la identificación rápida y de alto rendimiento, así como la caracterización cuantitativa de péptidos antagonistas, lo que respalda la confianza predictiva y la reducción de riesgos mecanicistas en la etapa de validación del objetivo. Este enfoque está diseñado para agilizar la selección de carteras y acelerar el avance de candidatos terapéuticos basados en péptidos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de FGFR2 como un objetivo relevante para la enfermedad sin necesidad de conocimiento estructural previo.
- Apoya la validación funcional de antagonistas peptídicos mediante ensayos cuantitativos de afinidad y actividad biológica.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante el aislamiento de interacciones específicas entre péptidos y receptores.
- Mejora la confianza predictiva en las decisiones de desarrollo terapéutico posterior.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona candidatos de péptidos validados para su uso en ensayos funcionales y de unión estandarizados.
- Permite cribados reproducibles y de alto rendimiento con bibliotecas escalables de presentación en fagos.
- Ofrece resultados cuantitativos mediante calorimetría isotérmica (ITC) y ensayos de proliferación celular para la evaluación robusta de compuestos.
- Permite la reutilización de la plataforma de ensayos para otros receptores u objetivos de ligandos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona el descubrimiento de péptidos con vías de señalización de FGFR2 relevantes para enfermedades implicadas en oncología.
- Establece una continuidad desde la selección molecular hasta la validación funcional preclínica.
- Reduce el riesgo de traslación al confirmar la actividad biológica en ensayos celulares.
- Permite el avance ajustado al riesgo de péptidos candidatos hacia modelos preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco líder y la evaluación preclínica de péptidos que modulan FGFR2.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en mecanismos de enfermedades impulsados por FGFR2.
- Tamizaje: Proporciona péptidos candidatos listos para ensayos, con datos cuantitativos y reproducibles de unión.
- Análisis: Ofrece mediciones de afinidad y lecturas funcionales en células para comparar la eficacia de los péptidos.
- Investigación Traducional: Conecta el tamizaje molecular con la validación preclínica en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma escalable y adaptable para el tamizaje de péptidos frente a diversos objetivos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el direccionamiento de FGFR2.
- Valor operativo: Estandariza y agiliza los flujos de trabajo de cribado y validación de péptidos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del proyecto y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos basados en péptidos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en presentación de fagos, química de péptidos y ensayos cuantitativos de unión.
- Necesita acceso a instrumentación de calorimetría isotérmica por titulación (ITC) e infraestructura para ensayos celulares.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la integridad de los datos.
- Adaptable a otros receptores u objetivos de ligandos con modificaciones adecuadas de la biblioteca y del ensayo.
- El control de contaminación y la manipulación precisa son fundamentales para evitar la interferencia de fagos silvestres.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:54
First Round of Biopanning: Screening Phage Clones that Bind to the Extracellular Domain of FGFR2
2:26
Titer Determination of the Eluted Phages
3:28
Phage Amplification
5:38
Results: Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2
6:38
Conclusion
