Name: Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende a detectar péptidos que se unen a FGFR2 mediante una biblioteca de pantalla de fago. Este protocolo eficiente permite evaluar la afinidad in vitro y el efecto antiproliferativo en células.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (No. 2016201604030039).

1. Preparación de reactivos
<ol><li>LB (caldo de lisogenia) medio: Disolver 1 g de triptona, 0,5 g de extracto de levadura y 0,5 g de NaCl en 100 ml de H2O. Autoclave y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Material de tetraciclina: Preparar 20 mg/ml en 1:1 etanol:H2O. Almacenar a -20 oC, y vórtice antes de usar.</li>
	<li>Solución IPTG/X-gal: Mezcla 0,5 g de IPTG (isopropilo-D-1-tiogalactopyranoside) y 0,4 g de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-D-galactoside) en 10 mL de DMF (dimetil formamida). La solución se puede almacenar a -20 oC durante un año en la oscuridad.</li>
	<li>Placas LB + Tetraciclina (Tet): Dissuve 1 g de bacto-triptolona, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g de NaCl y 1,5 g de agar en 100 ml de H2O. Autoclave y enfriar a < 70 oC. Añadir 100 l de la culatina y verter las placas. Almacene las placas a 4 oC en la oscuridad.</li>
	<li>Placas LB + IPTG/X-gal: Disolver 1 g de bacto-triptolona, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g de NaCl y 1,5 g de agar en 100 ml de H2O. Autoclave y enfriar a < 70oC. Añadir 100 l de la solución IPTG/X-gal y verter las placas. Almacene las placas a 4 oC en la oscuridad.</li>
	<li>Tampón de glicina-HCI (0,2 M): Disolver 1,5014 g de glicina y 100 mg de BSA (albúmina sérica bovina) en 100 ml de H2O y ajustar el pH a 2,2 con HCl. Filtrar la solución utilizando un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Tampón Tris-HCl (1 M): Disolver 12,11 g de Tris (tris(hidroximetil)aminometano) en 100 ml de H2O y ajustar el pH a 9,1 con HCl. Autoclave y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Tampón de recubrimiento (0,1 M): Disolver 1,68 g de NaHCO3 en 200 ml de H2O y ajustar el pH a 8,6 con NaOH. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>Buffer de bloqueo: Prepare 0.1 M NaHCO3 (pH 8.6) con 5 mg/ml de BSA. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.</li>
	<li>TBS: Preparar 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) con 150 mM NaCl. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>0,05%, 0,1% o 0,5% TBST: Preparar TBS con 0,05%, 0,1% o 0,5% (v/v) Tween-20. Filtrar con un filtro de 0,22 m y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>PEG/NaCl: Preparar 20% (p/v) polietilenglicol-8000 con 2,5 M NaCl. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Solución TE: Mezclar 1 mL de 1 M Tris-HCl (pH8.0) y 2 mL de 50 mM EDTA (pH 8.0) y ajustar el volumen a 100 mL con H2O. Autoclave y almacenar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Tampón de yoduro: Disolver 30 g de NaI en 50 ml de TE, pH 8.0. Almacene la solución a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Agar superior: Disolver 1 g de triptona, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g de NaCl y 0,7 g de agarina en 100 ml de H2O. Autoclave y dispensar en alícuotas de 15 ml. Conservar a temperatura ambiente para su uso.</li>
</ol>2. Primera ronda de bioparpanning: Cribado de clones de fagos que se unen al dominio extracelular de FGFR2
NOTA: Utilice puntas de pipeta resistentes a aerosoles y guantes de uso para todos los protocolos con el fin de minimizar la contaminación con bacteriófagos ambientales.
<ol><li>Preparar una solución FGFR2 de 10 g/mL (Pureza > 97%; ver Tabla de materiales)en tampón de recubrimiento. Añadir 1 ml de la solución preparada a un plato de 35 cm2 y agitar repetidamente hasta que la superficie esté completamente húmeda. Incubar durante la noche a 4oC con agitación. NOTA: Para evitar la selección de aglutinantes objetivo de señuelo, la proteína diana debe estar altamente purificada.</li>
	<li>Inocular 5 ml de LB + Tet medio con Escherichia coli (E. coli) ER2738 durante 5-10 horas a 37oC con temblor. Las células ER2738 amplificadas se utilizarán para la valoración en el paso 3.3.</li>
	<li>Vierta la solución de recubrimiento del plato (el exceso de solución debe ser eliminado) y agregue la solución de bloqueo. Incubar a 4oC durante al menos 1 h.</li>
	<li>Deseche la solución de bloqueo y lave 6 veces rápidamente con TBST (TBS + 0,05% (v/v] Tween-20). Evite secar el plato.</li>
	<li>Reconstituir la biblioteca de fagos originales en 1 mL de TBST [concentración final de 1011 unidades formadoras de placas (PFU)], añadir al plato recubierto, y mecer suavemente durante 2 h en una coctelera a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y lave el plato 10x con TBST (TBS + 0.05% (v/v) Tween-20), como se realiza en el paso 2.4. NOTA: Los fagos no unidos deben retirarse a fondo mediante un lavado vigoroso.</li>
	<li>Eluir el fago atado añadiendo 1 ml de tampón de glicina-HCl de 0,2 M (pH 2.2) al plato y meciéndose suavemente durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera el eluido en un tubo de microfúgelo esterilizado y neutralícelo con 100 ml de Tris-HCl de 1 M, pH 9.1. NOTA: En el paso 2.6, retire el fago no unido tanto como sea posible lavando el plato 10 veces vigorosamente. Este es un paso crucial. El fago eludado se puede almacenar a 4 oC durante una semana. Sin embargo, es mejor seguir adelante con el siguiente paso tan pronto como sea posible.</li>
</ol>3. Determinación de los fagos eludados
<ol><li>Placas precalentadas LB + IPTG/X-gal durante al menos 1 h a 37 oC antes de su uso.</li>
	<li>Preparar 100 l de diluciones en serie de 10 veces (es decir, 101, 102, 103 y 104) del eluido del paso 2.8 en LB. Use puntas con cartuchos de filtro para evitar la contaminación.</li>
	<li>Deje que la referencia cultural del paso 2.2 alcance la fase de registro medio (OD600 a 0,5). Dispensar 200 ml del cultivo en tubos de microfúge esterilizados, uno para cada dilución de eluido.</li>
	<li>Para iniciar la infección, añada 10 ml de cada dilución desde el paso 3.2 a los tubos de microfuga individuales que contengan el cultivo de E. coli ER2738 del paso 3.3. Vórtice rápidamente e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Recubrir 90 l de la mezcla a partir del paso 3.4 en las placas LB +IPTG/X-gal con varillas de recubrimiento.</li>
	<li>Opcionalmente, derretir el agar superior en un microondas, dispensar 3 ml en tubos de cultivo estériles, uno para cada dilución eluido, y mantener los tubos a 45 oC. Transfiera la mezcla del paso 3.4 a tubos de cultivo que contengan agar superior a 45 oC. Mezcle rápidamente e inmediatamente vierta el cultivo en una placa LB/IPTG/X-gal precalentada. Incline y gire suavemente la placa para extender el agar superior uniformemente.</li>
	<li>Después de 5 min, invierta e incubar las placas durante la noche a 37oC.</li>
	<li>Cuente las placas en placas con aproximadamente 100 placas. Multiplique cada número por el factor de dilución de esa placa para obtener el plato de fago en PFU por 10 oL.</li>
	<li>Inocular otros 5 ml de lb + tet medio con E. coli ER2738 a 37 oC durante la noche con temblor para amplificación de fagos. NOTA: Utilice el cultivo de ER2738 en la fase de registro medio (OD600 a 0,5) para el rumbo del fago. Si la mayoría de las placas son blancas en placas X-gal/IPTG, significa que la piscina de fago sin ha sido contaminada con bacteriófagos silvestres. Si se produce contaminación, es necesario comenzar de nuevo con los pasos de panoramización de la solución de phage stock no contaminada.</li>
</ol>4. Amplificación del fago
<ol><li>Diluir (1:100) el cultivo nocturno del paso 3.8 en 20 ml de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Añadir el eluido no amplificado e incubar con agitación vigorosa durante 4,5 h a 37oC.</li>
	<li>Transfiera el cultivo a un tubo centrífugo y centrífuga durante 10 min a 12.000 x g a 4 oC. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, vuelva a centrifugar y deseche el pellet.</li>
	<li>Transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo nuevo y agréguelo 1/6 volumen de 20% PEG/2.5 M NaCl. Deje que el fago se precipite a 4oC durante la noche. NOTA: Mezcle bien el sobrenadante de cultivo con PEG/2.5 M NaCl.</li>
	<li>Centrifugar el fago precipitado a 12.000 x g durante 15 min a 4oC. Deseche el sobrenadante, vuelva a centrifugar y retire el sobrenadante residual con una pipeta.</li>
	<li>Resuspenda el pellet en 1 ml de TBS y transfiera el sobrenadante a un tubo de microfófugo. Centrífuga a 12.000 x g durante 5 min a 4oC.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfófugo fresco y precipite de nuevo añadiendo 1/6 de volumen de 20% PEG/2.5 M NaCl. Incubar sobre hielo durante 15-60 min. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4oC. Deseche el sobrenadante, vuelva a girar y retire el sobrenadante residual con una pipeta.</li>
	<li>Resuspenda el pellet en 200 ml de TBS y centrífuga durante un minuto adicional para eliminar las impurezas. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microfófugo fresco para obtener el eluido amplificado.</li>
	<li>Ayune el fago amplificado como se describe en la sección 3. NOTA: La dilución del eluido amplificado es mayor en comparación con el eluido no amplificado; por lo general se sugieren diluciones en serie de 108–1011.</li>
</ol>5. Segunda ronda de bioparpanning
<ol><li>Repita las secciones 2 a 4.</li>
	<li>Titer la segunda ronda del eluido amplificado en placas LB + IPTG/X-gal como se describe en la sección 3. NOTA: Reduzca la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 a 5 g/ml. Utilice el fago amplificado del paso 4.7 como entrada y mantenga el rumbo igual que en la primera ronda (1011 PFU). Acortar el tiempo de incubación del fago y el plato recubierto de FGFR2 a 1 h y aumentar la concentración de tween a 0,1% (v/v) en los pasos de lavado.</li>
</ol>6. Tercera ronda de bioparpanning
<ol><li>Repita los pasos 2.1-2.6.</li>
	<li>Eluir el fago atado añadiendo 1 mL de solución de bFGF de 20 M (un ligando para FGFR2) al plato y meciéndose suavemente durante 60 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1-3.7. NOTA: Reduzca la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 a 2,5 g/ml. Utilice la segunda ronda de fago amplificado de la sección 5 como entrada y mantenga el rumbo igual que en la primera ronda (1011 PFU). Acortar el tiempo de incubación del fago y el plato recubierto de FGFR2 a 30 min y aumentar la concentración de Tween a 0.5% (v/v) en los pasos de lavado.</li>
</ol>7. Adquisición de ADN de placa para secuenciación
<ol><li>Amplificación de la placa<ol>
<li>Diluir (1:100) un cultivo nocturno de ER2738 en LB. Dispensar 1 ml de cultivo diluido en un tubo de 2 ml, uno para cada clon a caracterizar.</li>
		<li>Utilice una punta de pipeta para elegir una placa de color azul bien separada de una placa de titer de la sección 6 y transferir la transferencia al tubo que contiene el cultivo diluido. Escoge un total de 15 placas. NOTA: Las placas deben tener < 1-3 días de edad, almacenarse a 4 oC y tener < 100 placas.</li>
		<li>Incubar los tubos con agitación vigorosa durante 4,5 h a 37oC.</li>
		<li>Transfiera los cultivos a tubos centrífugos y centrífuga a 12.000 x g durante 30 s. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y la centrífuga de nuevo.</li>
		<li>Con una pipeta, transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo nuevo. Etiquete esto como el material de fago amplificado. NOTA: Diluir el fago amplificado con un volumen igual de glicerol 100% estéril y almacenar a -80 oC para su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extracción de ADN de placa<ol>
<li>Transfiera 500 l del fago amplificado a un tubo de microfúctil fresco y agregue un volumen de 1/6 de 20% PEG/2.5 M NaCl. Invertir para mezclar y dejar reposar durante 10-20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4oC y luego verter el sobrenadante. NOTA: Es posible que el pellet de phage no sea visible.</li>
		<li>Centrífuga otra vez. Retire con cuidado cualquier sobrenadante restante.</li>
		<li>Resuspenda el pellet a fondo en 100 ml del tampón de yoduro tocando vigorosamente el tubo.</li>
		<li>Añadir 250 s de 100% de etanol e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4oC y retirar el sobrenadante. Lavar el pellet con 0,5 ml de etanol al 70%, centrifugar rápidamente de nuevo, eliminar el sobrenadante y secar brevemente el pellet.</li>
		<li>Resuspenda el pellet en 30 s de tampón TE y utilícelo para la secuenciación. NOTA: Enfriar previamente el 70% de etanol a -20 oC antes del paso 7.2.6. El pellet de fago debe ser completamente resuspendido en el tampón de yoduro antes de la adición de etanol.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Identificación de la secuencia de péptidos
<ol><li>Utilice la imprimación de secuenciación -96 gIII (5o-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3o) para la secuenciación.</li>
	<li>Analizar las secuencias de péptidos que se muestran en el fago en función de los resultados de secuenciación del ADN.</li>
	<li>Sintetizar pequeños péptidos y analizar mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masas para confirmar su pureza (98%).</li>
</ol>9. Detectar la afinidad del pequeño péptido obtenido y la proteína extracelular de FGFR2 por ITC
<ol><li>Desgasa agua estéril usando un instrumento ultrasónico. Disuelva el pequeño péptido y la proteína extracelular FGFR2 en agua estéril. Centrifugar estas muestras para eliminar el precipitado residual.</li>
	<li>Realice los experimentos de valoración de ITC a 25 oC. Valorar 40 m de péptido pequeño en la célula con 1,5 m de proteína FGFR2 de la jeringa, con una velocidad de agitación de 750 rpm. Añadir la proteína FGFR2 en alícuotas de 2 l (para un total de 19 inyecciones) a intervalos de 5 minutos.</li>
	<li>Analice los datos de ITC mediante un modelo de enlace de un solo sitio. NOTA: El agua estéril debe desgasificarse y todas las muestras deben ser centrifugadas para eliminar las burbujas de aire y las impurezas residuales. El experimento debe llevarse a cabo a una temperatura constante de 25 oC.</li>
</ol>10. Verificar la actividad biológica del pequeño péptido obtenido utilizando un ensayo de proliferación celular
<ol><li>Células de semilla BALB/c 3T3 (3,0 x 103 células/pozo, 100 ol) en una placa de 96 pocillos con medio de águila modificado (DMM) de Dulbecco con suero bovino fetal (FBS) del 10% durante la noche a 37 oC y 5% de CO2.</li>
	<li>Sustituya el sobrenadante por DMEM fresco por un 0,5% de FBS y moce de hambre las células durante 12 h.</li>
	<li>Hacer diluciones en serie del péptido pequeño (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, y 100 m) con DMEM fresco complementado con 0.5% FBS (6 pozos duplicados / concentración). Retire el sobrenadante de la placa de 96 pocillos y agregue 100 ml de la solución de péptido pequeño por poca. Incubar durante 48 h a 37oC y 5% CO2.</li>
	<li>Reemplace el sobrenadante por una solución de DMEM fresca que contenga una solución de 10% Cell Counting Kit (CCK)-8 e incubar durante 2 h.</li>
	<li>Mida la absorbancia de cada pocal a 450 nm con un lector de microplacas y analice la viabilidad celular.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses financieros.

Una biblioteca combinatorial de fagos es una herramienta poderosa y eficaz para el cribado de alto rendimiento de péptidos novedosos que pueden unir moléculas diana y regular su función13. Actualmente, las bibliotecas de péptidos de pantalla de fago tienen una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar para seleccionar péptidos bioactivos unidos a proteínas receptoras23, objetivos no proteicos24,25...

Los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) desempeñan un papel clave en la proliferación celular, la cicatrización de heridas y la angiogénesis in vivo1. Activación aberrante de señalización FGFR observada en una variedad de tumores2,3,4,5 incluye amplificación de genes, mutaciones genéticas, aberraciones cromosómicas, y secreción excesiva de ligando6 . Muchos inhibidores dirigidos a los FFRBR han demostrado efectos terapéuticos prometedores en ensayos clínicos y se clasifican principalmente en tres tipos: (1) inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas, que se unen al dominio intracelular de FGFR, (2) antagonistas dirigidos a los segmento extracelular, y (3) ligando según el FGF6. Aunque varios de los inhibidores de la quinasa de moléculas pequeñas tienen buenos efectos terapéuticos tanto in vitro como in vivo7, la mayoría de ellos tienen mala especificidad objetivo y muestran efectos adversos como la hipertensión8. La mayoría de los antagonistas son anticuerpos monoclonales9,10 y polipéptidos11. Los péptidos tienen ventajas sobre moléculas pequeñas debido a su especificidad y efectos secundarios más bajos. También conservan la permeabilidad celular y no se acumulan en órganos específicos en comparación con los fármacos proteicos12. Por lo tanto, los péptidos pequeños dirigidos son agentes terapéuticos eficaces y prospectivos.
La tecnología de visualización Phage es una herramienta fácil pero poderosa para identificar pequeños péptidos que pueden unirse a una moléculadada 13,14,15. Utilizamos una biblioteca de péptidos de exhibición de fago que se basa en un simple fago M13 con más de 109 secuencias de péptidos diferentes que se muestran en la cola para la unión a la molécula objetivo (ver Tabla de Materiales)16. Debido a la alta afinidad de los fagos hacia la molécula dada, los fagos no unidos se pueden lavar, y sólo se conservan los fagos estrechamente unidos con los péptidos cortos deseados. Las dianas moleculares dadas pueden ser proteínas inmovilizadas17,18, carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos19,20. Se informó de un caso emocionante en el que se seleccionaron péptidos específicos de órganos in vivo utilizando la tecnología de visualización defagos 21. Las ventajas de la tecnología de visualización de fago sin embargo incluyen alto rendimiento, facilidad de operación, bajo costo y una amplia gama de aplicaciones22.
En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado de cribado de pequeños péptidos que se unen a la proteína inmovilizada (FGFR2) utilizando una biblioteca de visualización de fagos. La eficacia de la tecnología también se examina midiendo la afinidad del péptido obtenido hacia FGFR2 por Calorimetría de valoración isotérmica (ITC), y la actividad biológica mediante un ensayo de proliferación celular. El método puede extenderse para el cribado de pequeños péptidos que se unen a carbohidratos, células cultivadas, o incluso materiales inorgánicos.

<table><tbody><tr><td>0,22 y mu; m Filtro</td><td>Merck Millipore</td><td>MPGP002A1</td><td></td></tr><tr><td>35 cm2 Plato pequeño</td><td>Thermo</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>Guangzhou fábrica de reactivos químicos</td><td>64-17-5-96</td><td></td></tr> <tr><td>gIII cebador</td><td></td><td></td> secuencial <td>Síntesis de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Nest</td><td>701001-2</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Beyotime</td><td>ST004D</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Triptona</td><td>Oxoid</td><td>L0037</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 3T3 celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-&shy; 6587</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Biodragon</td><td>BD-M10110</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8</td><td>kit DOJINDO</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>sh30243.01</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Newprobe</td><td>PB10247</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 Protein</td><td>Sino Biological Inc.</td><td>10014-HNAE</td><td>Pureza >95%</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898-1KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Beyotime</td><td>ST097</td><td></td></tr><tr><td>ITC200 system</td><td>MicroCal Omega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Guangzhou fábrica de reactivos químicos</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>NaI</td><td>Bidepharm</td><td></td><td></td>BD40879</tr><tr>Fábrica de reactivos químicos<td>NaOH</td><td>Guangzhou</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>PEG &ndash; 8000</td><td>Sigma</td><td>P2139-250</td><td></td></tr><tr><td>Ph.D.-7 kit de biblioteca de péptidos de visualización de fagos</td><td>New England BioLabs</td><td>E8100S</td><td>Que contiene la biblioteca de fagos Ph.D.-7, cepa huésped E. coli ER2738 y fago de control M13KE</td></tr><tr><td>Proteínas de dominio extracelular FGFR2 recombinantes Sino</td><td>Biological Inc.</td><td>10824-H08H</td><td>Pureza > 97%</td></tr><tr><td>Síntesis de</td><td></td><td></td> péptidos <td>pequeños de GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)</td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>S-SHS-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>SLF-T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Beyotime</td><td>ST912</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library

La familia humana Detensíto de Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGFR) está compuesta por cuatro miembros, a saber, FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4, que participan en diversas actividades biológicas, incluyendo la proliferación celular, supervivencia, migración y diferenciación. Se han identificado varias aberraciones en la vía de señalización FGFR, debido a mutaciones o eventos de amplificación de genes, en varios tipos de cáncer. Por lo tanto, investigaciones recientes se han centrado en el desarrollo de estrategias que implican la focalización terapéutica de FFRRs. Inhibidores actuales de FGFR en varias etapas del desarrollo preclínico y clínico incluyen inhibidores de moléculas pequeñas de tirosina quinasas o anticuerpos monoclonales, con sólo unos pocos inhibidores a base de péptidos en la tubería. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza la tecnología de visualización de fagos para detectar pequeños péptidos como antagonistas de FGFR2. Brevemente, se incubaba una biblioteca de péptidos expuestos con fago sin fago en una placa recubierta de FGFR2. Posteriormente, TBST (TBS + 0.1% [v/v] Tween-20 se laupagó el fago no unido y eluyó con un tampón de 0,2 M de glicina-HCl (pH 2.2). El fago eludado se amplificabó aún más y se utilizó como entrada para la siguiente ronda de biopanning. Después de tres rondas de bioparlante, las secuencias de péptidos de clones individuales de fago fueron identificadas por secuenciación del ADN. Finalmente, los péptidos examinados fueron sintetizados y analizados para la afinidad y la actividad biológica.

Obtención de un pequeño péptido de alta afinidad dirigido a FGFR2.
Para detectar fagos dirigidos a FGFR2, se utilizó una biblioteca Ph.D.-7 en este estudio. En la Figura 1se muestra una representación esquemática del flujo de trabajo. En este proceso, el número de entrada de fago (PFU) se mantuvo sin cambios, mientras que la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 se redujo gradualmente. Los resultados del phage titer sugirieron que el...

En este documento, presentamos un protocolo detallado para la detección de pequeños péptidos que se unen a FGFR2 utilizando una biblioteca de péptidos de visualización de fagos. Analizamos más a fondo la afinidad de los péptidos seleccionados hacia FGFR2 in vitro y su capacidad para suprimir la proliferación celular.

Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

The human Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) family comprises four members, namely, FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4, that are involved in various ...

En comparación con otros métodos, este protocolo es más fácil de encontrar nuevos antagonistas, agonisteres y moduladores alotéricos cuantitativa y cualitativamente sin conocer la estructura hidro-dilución y la formación de la proteína diana. Este protocolo es altamente eficiente, fácil de manejar, económico y disponible comercialmente. Combinando este método de cribado de alto rendimiento con el análisis ITC, los pequeños péptidos funcionales se pueden obtener cuantitativa y cualitativamente.Demostrando el procedimiento serán Ying Zhao y Qiang Wang, estudiantes graduados de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución de FGFR2 en tampón de recubrimiento a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Añadir un mililitro de la solución a un plato de 35 centímetros cuadrados y girar repetidamente hasta que la superficie esté completamente húmeda.Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con temblores. Al día siguiente, vierta la solución de recubrimiento y agregue la solución de bloqueo preparada. Incubar a cuatro grados centígrados durante al menos una hora, luego desechar la solución de bloqueo y lavar rápidamente la placa seis veces con TBST mientras se asegura de que el plato no se seque.Reconstituir la biblioteca de fagos original en un mililitro de TBST y añadir esto al plato recubierto. Mece suavemente el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante dos horas. Después de esto, deseche el sobrenadante y lave el plato 10 veces con TBST.Eluda el fago ligado añadiendo un mililitro de 0,2 molar glicina HCL al plato y balanceándose suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el eluyente a un tubo de microcentrífuga esterilizado y neutralícelo con 100 microlitros de un Molar Tris-HCL a pH 9.1. En primer lugar, precalienta las placas PREPARADAs LB e IPTG X-Gal a 37 grados Celsius durante al menos una hora antes de su uso.Usando puntas de pipeta con cartuchos de filtro, prepare 100 microlitros de diluciones diez veces del eluyente en LB. Después de que el cultivo de E.coli preparado alcance la fase de registro medio, dispensar 200 microlitros del cultivo en tubos de microcentrífuga esterilizado uno para cada dilución eluente. Para iniciar la infección, añadir 50 microlitros de cada dilución a los tubos que contienen el cultivo de E.coli. Vortex rápidamente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, utilice varillas de recubrimiento para recubrir las placas LB e IPTG X-GAL con 90 microlitros de esta mezcla. Después de cinco minutos, invierta las placas e incubarlas durante la noche a 37 grados centígrados. Cuente las placas cuando aparezcan.Para empezar, diluir el cultivo nocturno en 20 mililitros de LB en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros. Añadir el eluyente no amplificado e incubar a 37 grados Celsius con agitación vigorosa durante 4-1/2 horas. A continuación, centrifugar la cultura a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Centrifugar de nuevo utilizando las mismas condiciones y deseche el pellet. Transfiera el 80% superior del sobrenadante a un tubo fresco y agréguelo a 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico.Deje que el fago se precipite durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar el fago precipitado a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones.Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en un mililitro de TBS y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos.Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco y precipite de nuevo añadiendo 1/6o volumen de 20% polietilenglicol y 2,5 molar de cloruro sódico. Incubar sobre hielo durante 15 a 60 minutos. A continuación, centrifugar a 12.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante y la centrífuga de nuevo utilizando las mismas condiciones. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante residual. Resuspender el pellet en 200 microlitros de TBS y centrífuga durante un minuto adicional para eliminar las impurezas.A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco para obtener el eluyente amplificado. En este estudio, el número de aportes de fagos se mantiene sin cambios, mientras que la concentración de recubrimiento de la proteína FGFR2 se reduce gradualmente. Los resultados del título de fagos sugieren que el número de fagos recuperados aumenta gradualmente y que después de tres rondas, hay un aumento de 65 veces en comparación con el de la primera ronda.A continuación, se lleva a cabo un experimento de ITC para medir la afinidad del péptido pequeño con FGFR2. Los resultados indican que el péptido SP1 tiene una alta afinidad hacia FGFR2. Estos datos demuestran la eficacia del protocolo de cribado.Para investigar la actividad biológica del péptido SP1, se realiza un ensayo de proliferación de fibroblastos utilizando un kit CCK-8. BALB/C3T3 se incuban con el péptido SP1 a diferentes concentraciones. Los resultados sugieren que el péptido SP1 suprime el crecimiento de las células.La contaminación por fagos de tipo salvaje tiene que evitarse aquí. Asegúrese de utilizar puntas de pipeta resistentes a aerosoles. Mientras que el crecimiento mediante la obtención de amplificación de fagos.Este procedimiento también se puede utilizar en la detección de pequeños péptidos que se unen a los carbohidratos, células de cultivo y tejidos. Esos péptidos pueden ser más amplificados sobre el diagnóstico y

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Investigación

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Bioengineering

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Una biblioteca de fagos se utilizó para identificar las secuencias de péptidos de que el hueso blanco. El objetivo fue investigar el efecto de estos péptidos en la diferenciación de células mesenquimales y para determinar su efecto sobre la regeneración ósea.

Péptidos de la Biblioteca de Phage Display modular la expresión génica en las células mesenquimales y potenciar la osteogénesis en defectos óseos unicorticales

Se describe un método con acompañamiento visual para conducir, las selecciones de rendimiento altos escalables de bibliotecas de anticuerpos sintéticos combinatorios fagos contra cientos de antígenos simultáneamente. El uso de este enfoque paralelo, hemos aislado fragmentos de anticuerpos que exhiben alta afinidad y especificidad para diversos antígenos que son funcionales en inmunoensayos estándar.

Escalable de alto rendimiento seleccion de bibliotecas de anticuerpos sintéticos fagos

El cribado de matrices de péptidos es un ensayo de alto rendimiento para identificar los sitios de interacción proteína-proteína. Esto permite mapear múltiples interacciones de una proteína diana y puede servir como método para identificar sitios para inhibidores que se dirigen a una proteína. Aquí describimos un protocolo para el cribado y análisis de matrices de péptidos.

La identificación de sitios de interacción proteína-proteína utilizando péptido arrays

Proporcionamos un método para cribar simultáneamente una biblioteca de fragmentos de anticuerpos para determinar la afinidad de unión y la solubilidad citoplasmática utilizando la vía de translocación de arginina gemela de Escherichia coli, que tiene un mecanismo de control de calidad inherente para el plegamiento de proteínas intracelulares, para mostrar los fragmentos de anticuerpos en la membrana interna.

Visualización interior de la membrana bacteriana para la selección de una biblioteca de fragmentos de anticuerpos

Bibliotecas de exhibición bacteriana Biopanning es una técnica probada para el descubrimiento de los reactivos de la afinidad del péptido, una alternativa robusta a los anticuerpos. El método de ordenación semi automatizado en este documento ha aerodinamizado biopanning para disminuir la ocurrencia de falsos positivos. Aquí ilustramos el proceso de pensamiento y técnicas aplicadas en evaluar a los candidatos y la minimización de análisis aguas abajo.

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Aquí presentamos un método para seleccionar nuevas variantes de la E. coli biotin-protein ligase BirA que biotinyla un péptido objetivo específico. El protocolo describe la construcción de un plásmido para la visualización bacteriana del péptido objetivo, la generación de una biblioteca BirA, la selección y caracterización de variantes BirA.

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Este estudio tenía como objetivo presentar una estrategia para identificar las interacciones entre fármacos y péptidos. La estrategia consiste en la biopanning de péptidos cortos que reconocen fármacos basados en un biosensor de micropeso de cristal de cuarzo (QCM), seguido de análisis bioinformática para evaluar cuantitativamente la información obtenida para el reconocimiento de fármacos y la anotación de los sitios de unión a fármacos sobre proteínas.

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Se describen técnicas para generar una biblioteca de péptidos cortos que pueden activar los mastocitos a través del receptor MRGPRX2. Las técnicas asociadas son fáciles, económicas y se pueden extender a otros receptores celulares.

Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas

La ubiquitinación es una proteína crítica de modificación post-traduccional, cuya desregulación se ha implicado en numerosas enfermedades humanas. Este protocolo detalla cómo se puede utilizar la visualización de fagos para aislar nuevas variantes de ubiquitina que pueden unirse y modular la actividad de las ligasas E3 que controlan la especificidad, la eficiencia y los patrones de ubiquitinación.

Uso de la pantalla de fagos para desarrollar moduladores de variantes de ubiquitina para ligasas E3

Aprende a detectar péptidos que se unen a FGFR2 mediante una biblioteca de pantalla de fago. Este protocolo eficiente permite evaluar la afinidad in vitro y el efecto antiproliferativo en células.

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Detección e identificación de pequeños péptidos dirigidos al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos2 utilizando una biblioteca de péptidos de pantalla de fago

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