Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico
27 de septiembre de 2019
Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.
Es fundamental combinar eficazmente la eficiencia de la captura con la observación dinámica de imágenes de celdas vivas para comprender el efecto de la interacción celda-célula en los comportamientos de las células. Este tubo puede capturar de manera altamente eficiente varias células individuales en una cámara más grande, y proporcionar una base de cultivos suficiente, para el seguimiento dinámico de múltiples comportamientos de interacción de una sola célula. Comience preparando el dispositivo PDMS.
Coloque un molde de oblea en el plato de pesaje con 100 microlitros de triclorosilano en un desecador y aplique un vacío durante 15 minutos. Detenga el vacío y salinize el molde de obleas en el desecador a 37 grados Celsius durante al menos una hora. Mezcle la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de diez a uno, luego vierta un total de 20 gramos de la mezcla en el molde de obleas en un plato de 15 centímetros.
Coloque el plato de 15 centímetros en un desecador y aplique un aspirador durante un minuto y medio. A continuación, retire el plato del desecador y elimine las burbujas de aire residuales en el PDMS con gas nitrógeno. Curar el PDMS colocando el plato en un horno a 65 grados centígrados durante dos a cuatro horas.
Cuando haya terminado, quite la réplica de PDMS del molde de oblea y golpee una entrada de 1,5 milímetros y una salida de 0,5 milímetros en el PDMS. Limpie la réplica de PDMS y la superficie de la diapositiva con cinta extraíble. Tratar la superficie con plasma de oxígeno.
A continuación, alinee manualmente la réplica de PDMS con la diapositiva y póngalas en contacto entre sí. Deje la diapositiva PDMS en el horno Celsius de 65 grados durante un día. Al día siguiente, sumerja el dispositivo PDMS en un contenedor lleno de PBS.
Colóquelo en el desecador y aplíquelo durante 15 minutos. Mueva el dispositivo a una capucha de cultivo celular y esterilícelo con luz UV durante 30 minutos. Reemplace el búfer del dispositivo PDMS por medio e in incubarlo a cuatro grados centígrados durante un día.
Cuando las células logren entre 70 y 80% de confluencia, retire el medio de cultivo y lávelos suavemente tres veces con cinco mililitros de PBS. Añadir un mililitro de medio DMEM/F-12 que contenga un tinte fluorescente micromolar a las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, e incubarlas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave suavemente las células tres veces con cinco mililitros de PBS estéril, retire el PBS y agregue dos mililitros de 0.25%Trypsin-EDTA.
Incubar las células durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego toque suavemente el plato de cultivo para promover el desprendimiento celular. Añadir cuatro mililitros de medio DMEM/F-12 para dispersar las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, transferir las células a un tubo de 15 mililitros y centrifugarlas a 300 xg durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet celular en un mililitro de DMEM/F-12 medio.
Preparar un mililitro de suspensión celular a una concentración de tres veces diez a quintas células por mililitro y mantenerlo en hielo para evitar la agregación celular. Conecte el tubo de politetrafluoroetileno entre la salida del dispositivo y la bomba de la jeringa. Retire el medio y agregue un microlitro de la suspensión de celda preparada en la entrada del dispositivo PDMS.
A continuación, cargue la suspensión celular en el dispositivo utilizando una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 microlitros por minuto. Agregue un microlitro de medio DMEM/F-12 en la entrada del dispositivo y, a continuación, cargue el medio en el dispositivo con una bomba de jeringa. Cargue 0,3 microlitros de medio DMEM/F12 en el dispositivo con la bomba de jeringa a un caudal de 10 microlitros por minuto.
Después de cargar las células, retire el tubo y selle la entrada y salida con cinta de poliolefina para crear un sistema de cultivo cerrado. Mueva el dispositivo PDMS a un plato de cultivo de 10 centímetros y agregue 10 mililitros de PBS estéril alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio. Transfiera el plato de cultivo a una incubadora para el cultivo de triple célula.
El dispositivo PDMS tiene una estructura de tres capas con un sitio de captura que se conecta a la cámara de referencia cultural y al canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación permite que la celda fluya hacia la posición de captura, lo que hace que la siguiente celda pase a través del canal de derivación al siguiente sitio de captura. El paso de reflujo se utiliza para liberar la celda del sitio de captura y enviarla a la cámara de cultivo.
La eficiencia de captura de celdas de este protocolo se evaluó en tres tipos de células diferentes. Células endoteliales linfáticas humanas, o LECs, células T2.6 de carcinoma de células escamosas orales humanas que expresan ARN de horquilla corto específico de WNT5B y células de control vectorial pLKO-GFP. Las eficiencias de captura de una sola célula de las tres células demostradas fueron aproximadamente del 71% para los LEC, del 74% para las células WNT5B sh4 y del 78% para las células pLKO-GFP.
La eficiencia de captura de tres células individuales fue del 48%Este método se puede utilizar para múltiples co-cultivos de una sola célula de células endoteliales linfáticas y células cancerosas escamosas, y la proliferación y morfología de la célula se puede observar bajo un microscopio. Es importante asegurarse de que las suspensiones de celda preparadas tengan agregados de celda mínimos, ya que los agregados de celda no solo reducen la eficiencia de emparejamiento único, sino que también pueden obstruir los microprocesos. La interacción celda-célula entre celdas individuales desempeña un papel importante en el control de los comportamientos de las células.
Nuestro método puede proporcionar una herramienta eficiente para ayudar a los investigadores a estudiar la interacción célula-célula a un solo nivel celular, lo que puede conducir al descubrimiento de nuevos mecanismos que no se pueden obtener fácilmente de estudios basados en la población.
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Visión general
Este informe describe un método basado en microchips microfluídicos para configurar un experimento de cultivo celular único en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de múltiples células individuales. El método permite el seguimiento dinámico de las interacciones célula-célula para comprender mejor los comportamientos celulares.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Microfluidos
- Cultivo celular
- Interacciones célula-célula
Antecedentes
- Entender los comportamientos celulares es crucial para varios estudios biológicos.
- Las interacciones célula-célula influyen significativamente en las funciones celulares.
- Se necesitan técnicas de observación dinámica para el análisis en tiempo real.
- Los dispositivos microfluídicos pueden mejorar la eficiencia de captura de células individuales.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para el emparejamiento eficiente de células individuales.
- Habilitar el análisis microscópico de interacciones celulares.
- Facilitar el seguimiento dinámico de los comportamientos de células individuales.
Métodos utilizados
- Preparación de un dispositivo PDMS para cultivo celular.
- Uso de triclorosilano para la salinización de moldes de obleas.
- Mezcla de la base de PDMS y el agente de curado para la fabricación del dispositivo.
- Seguimiento dinámico de las interacciones celulares en una cámara más grande.
Resultados principales
- El método permite una alta eficiencia de captura de múltiples células individuales.
- El seguimiento dinámico proporciona información sobre los comportamientos de interacción célula-célula.
- El análisis microscópico revela hallazgos significativos sobre las interacciones celulares.
- La configuración microfluídica mejora el control y la observación experimentales.
Conclusiones
- El método basado en microchips microfluídicos es efectivo para el cultivo de células individuales.
- Permite un análisis detallado de las interacciones y comportamientos celulares.
- Este enfoque puede avanzar la investigación en biología celular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform addresses a key limitation in conventional co-culture systems by enabling deterministic single-cell pairing and real-time tracking of intercellular interactions. By overcoming population averaging effects, it provides mechanistic insights into heterogeneous cell behaviors relevant to cancer biology and stromal-tumor crosstalk. The approach supports early discovery workflows where precise cellular resolution improves target validation and de-risks translational hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution, clarifying pathway-specific interactions between lymphatic endothelial and cancer cells.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating individual cell behaviors obscured in bulk co-culture assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing reproducible single-cell co-culture conditions.
- Operational Value: Enhances assay standardization through deterministic cell capture (~46% efficiency) and minimized reagent consumption via microfluidic confinement.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of oral squamous cell carcinoma-stromal interactions, enabling biomarker-aligned observations of migration and proliferation.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by maintaining phenotypic fidelity under controlled intercellular communication.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing quantitative, single-cell-resolution data that informs lead identification and preclinical decision-making through direct observation of interaction-driven phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time imaging of defined cell pairs under controlled flow conditions.
- Screening: Delivers assay readiness through high-throughput single-cell trapping and stable culture chambers suitable for longitudinal monitoring.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables such as migration tracks, proliferation rates, and morphological changes linked to specific interaction events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human-relevant stromal-tumor interfaces in a scalable, reproducible format.
- Enterprise Reuse: Functions as a platform technology adaptable to multiple cell types, reducing redevelopment costs across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by de-risking mechanistic assumptions through direct single-cell observation.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability via standardized PDMS fabrication and syringe pump–driven loading, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing interaction-specific phenotypic readouts that reduce late-stage biological attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated stromal-tumor communication mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, PDMS handling, and sterile cell culture techniques.
- Depends on access to syringe pumps, vacuum desiccators, plasma treatment systems, and fluorescence microscopy for dynamic tracking.
- Necessitates cross-team standardization of cell preparation protocols to prevent aggregation-induced clogging and ensure consistent capture efficiency.
- Involves adaptation considerations when extending to non-adherent or primary cell types due to differences in size, deformability, and surface adhesion.
- Practical limitations include the need for meticulous surface treatment to prevent biofouling and the constraint of chamber size on long-term culture duration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
PDMS Device Preparation for Multiple Single Cell Capture
2:23
Preparation of a Single-cell Suspension
3:39
Multiple Single-cell Capture & Triple Single-cell Capture
4:48
Results: Single Cell Capture and Cell Co-culture in the Hydrodynamic Shuttling Chip
6:08
Conclusion
