Name: Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a establecer coculturas deterministas de células únicas con un chip microfluídico. Este método permite el seguimiento dinámico de interacciones celulares para estudiar comportamientos en biología celular.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (105-2628-E-400-001-MY2), y el Programa de Doctorado en Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, national Chung Hsing University e National Health Research Institutes.

1. Fabricación de un molde de oblea por litografía suave
NOTA: Los datos del patrón de máscara están disponibles en nuestra publicación anterior14.
<ol><li>Deshidratar una oblea de silicio de 4 pulgadas en un horno de 120 oC durante 15 min.</li>
	<li>Capa de giro 4 g de SU-8 2 fotorresistente negativo sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas a 1.000 rpm durante 30 s para crear una capa de 5 m de espesor (capa #1).</li>
	<li>La capa de horneado suave #1 en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min y luego transfiera la capa #1 a una placa de cocción de 95 oC durante 3 minutos.</li>
	<li>Enfríe la capa #1 a temperatura ambiente, colóquela en el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee con la capa #1 fotomáscara cromada (capa de sitio de captura).</li>
	<li>Exponga la capa #1 con luz UV de 365 nm a una dosis de 150 mJ/cm2.</li>
	<li>Retire la capa #1 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min. Transfiera la capa #1 a una placa de cocción de 95 oC durante 1 min.</li>
	<li>Capa fría #1 a temperatura ambiente. Sumergir en una solución de acetato de éter monometil propilenglicol para lavar el fotorresistente sin recruzar durante 2 min. Seque suavemente con gas nitrógeno para revelar una capa #1 marca de alineación.</li>
	<li>Cubrir la capa #1 la marca de alineación por una cinta adhesiva, capa de espín 4 g de SU-8 10 fotorresistente negativo en la capa #1 a 1.230 rpm durante 30 s para crear una capa de 25 m de espesor #2.</li>
	<li>Retire la cinta, la capa de horneado suave #2 en una placa de cocción de 65 oC durante 3 minutos y, a continuación, transfiera la capa #2 a una placa de cocción de 95 oC durante 7 minutos.</li>
	<li>Enfríe la capa #2 a la temperatura ambiente, coloque la capa #2 sobre el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee la capa #2 fotomáscara cromada (capa de canal de derivación) con la capa #1 la marca de alineación.</li>
	<li>Exponga la capa #2 con luz UV de 365 nm a una dosis de 200 mJ/cm2.</li>
	<li>Retire la capa #2 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 1 min y transfiera la capa #2 a una placa de cocción de 95 oC durante 3 minutos.</li>
	<li>Enfríe la capa #2 a temperatura ambiente y cubra la capa #1 la marca de alineación por cinta adhesiva. Capa de giro 4 g de fotorresistente negativo SU-8 2050 sobre la capa #2 a 1.630 rpm durante 30 s para crear una capa de 100 m de espesor #3.</li>
	<li>Retire la cinta, la capa de horneado suave #3 en una placa de cocción de 65 oC durante 5 minutos y, a continuación, transfiera la capa #3 a una placa de cocción de 95 oC durante 20 minutos.</li>
	<li>Enfríe la capa #3 a la temperatura ambiente, coloque la capa #3 sobre el soporte del alineador de máscara semiautomático y alinee la capa #3 fotomáscara cromada (capa de cámara de cultivo) con la capa #1 la marca de alineación.</li>
	<li>Exponga la capa #3 con luz UV de 365 nm a una dosis de 240 mJ/cm2.</li>
	<li>Retire la capa #3 del alineador y después de hornear en una placa de cocción de 65 oC durante 5 minutos #3.</li>
	<li>Capa fresca #3 a temperatura ambiente. Sumergir en una solución de acetato de acetato de monometil de propilenglicol para lavar el fotorresistente sin recruzar durante 10 minutos, y secar suavemente con gas nitrógeno.</li>
</ol>2. Preparación del dispositivo PDMS para la captura de varias células individuales
<ol><li>Colocar el molde de oblea y la placa de pesaje que contiene 100 ml de triclorosilano en un desecador (solo para la silanización) y aplicar un vacío (-85 kPa) durante 15 minutos. NOTA: Silanize la superficie de la oblea con triclorosilano para crear propiedades de superficie hidrófobas antes de la fundición PDMS para que pueda ser pelada sin esfuerzo desde el molde PDMS de oblea.</li>
	<li>Detenga la aspiradora y, a continuación, silanize el molde de oblea en el desecador (sólo para la silanización) a 37 oC durante al menos 1 h.</li>
	<li>Combine la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de 10:1. Vierta un total de 20 g de PDMS mezclados en el molde de obleas en un plato de 15 cm.</li>
	<li>Coloque el plato de 15 cm en un desecador y aplique vacío (-85 kPa) durante 1,5 min. A continuación, retire el plato de 15 cm del desecador. Mantener durante 20 minutos a temperatura ambiente. Por último, elimine las burbujas de aire residuales en PDMS con gas nitrógeno.</li>
	<li>Colocar el plato de 15 cm en un horno a 65oC durante 2-4 h para curar PDMS.</li>
	<li>Retire la réplica PDMS del molde de oblea y, a continuación, golpee una entrada de 1,5 mm y una salida de 0,5 mm en el PDMS utilizando un diámetro interior de 1,5 mm y un punzonador de diámetro interior de 0,5 mm(figura 1C).</li>
	<li>Limpie la réplica de PDMS y la superficie de la corredera con cinta extraíble y, a continuación, trate la superficie con plasma de oxígeno (100 W durante 14 s).</li>
	<li>Alinee manualmente las réplicas de PDMS con la diapositiva y póngalas en contacto entre sí.</li>
	<li>Coloque la diapositiva PDMS en un horno de 65 oC durante 1 día. NOTA: Se logra la unión permanente entre la diapositiva y la réplica de PDMS para formar el dispositivo.</li>
	<li>Sumerja el dispositivo PDMS en un recipiente lleno de solución salina tamponada de fosfato y colóquelo en un desecador. A continuación, aplique vacío (-85 kPa) durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire.</li>
	<li>Coloque el dispositivo PDMS en una campana de cultivo celular y esterilice el dispositivo con luz UV (longitud de onda de luz: 254 nm) durante 30 min.</li>
	<li>Sustituya el búfer del dispositivo PDMS por un medio (medio basal DMEM-F12 que contenga un 1% de antibióticos y un 10% de suero bovino fetal) e incubar el dispositivo PDMS a 4oC durante 1 día. Esto evita que las celdas se adhieran a la superficie de PDMS.</li>
</ol>3. Preparación de una suspensión de una sola célula
NOTA: Los tipos de células incluyen células endoteliales linfáticas humanas (LEC), células humanas OSCC TW2.6 que expresan el ARNS específico de WNT5B (WNT5B sh4) y el control vectorial (pLKO-GFP) que se obtuvieron de nuestro estudio anterior15. Consulte nuestra publicación anterior para conocer los pasos detallados del cultivo.
<ol><li>Retire el medio de cultivo cuando las células alcancen un 70-80% de confluencia. Luego lave suavemente las células con 5 ml de PBS estéril tres veces.</li>
	<li>Añadir 1 ml de medio DMEM-F12 que contenga 1 tinte fluorescente M en células WNT5B sh4 y pLKO-GFP (utilice el medio MV2 para LEC) y luego incubar las células durante 30 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Los LEC se tiñieron con el diacetato de clorometilfluoresceína verde (CMFDA) Tinte, las células WNT5B sh4 se teñieron con azul 7-amino-4-clorometilcoumarina (CMAC) Las células de tinte y pLKO-GFP se tejieron con tinte fluorescente Dil rojo.</li>
	<li>Lave suavemente las células con 5 ml de PBS estéril tres veces.</li>
	<li>Retire el PBS y agregue 2 mL de 0.25% Trypsin-EDTA (0.05% Trypsin-EDTA para LECs).</li>
	<li>Incubar las células durante 4 minutos a temperatura ambiente y luego toque suavemente el plato de cultivo de tejido para promover el desprendimiento de células.</li>
	<li>Añadir 4 ml de dMEM-F12 medio para dispersar las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP (para leC sutilizan 3 ml de medio MV2 y 1 ml de solución neutralizadora de trippsina). A continuación, transfiera las células a un tubo de 15 ml y centrífuga a 300 x g durante 3 minutos.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de medio DMEM-F12 suavemente. Cuente el número de celdas vivas en un hemocofómetro utilizando el método de exclusión estándar Trypan Blue16. Prepare 1 ml de suspensión celular a 3 x 105 células/ml de concentración en medio DMEM-F12, y luego mantenga las células en hielo para evitar la agregación celular. NOTA: Para mejorar la eficiencia de captura de una sola célula, se requiere una preparación cuidadosa de la suspensión de una sola célula con una sola disociación.</li>
</ol>4. Captura múltiple de una sola célula y triple cultivo de una sola célula
<ol><li>Conecte un tubo de politetrafluoroethene (PTFE) entre la salida del dispositivo y la bomba de la jeringa. Retire el medio y agregue 1 l de suspensión celular a una concentración de 3 x 105 celdas/ml en la entrada del dispositivo PDMS.</li>
	<li>Cargue la suspensión de la célula en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 l/min(figura 2A). La dirección del flujo es desde la entrada hasta la salida. NOTA: Cargue inmediatamente después de agregar la suspensión celular en la entrada para evitar la sedimentación celular.</li>
	<li>Añadir 1 l de medio DMEM-F12 a la entrada del dispositivo PDMS después del paso 4.2.Cargue el medio DMEM-F12 en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 l/min(figura 2B). La dirección del flujo fluyó de la entrada a la salida.</li>
	<li>Cargar 0,3 l de medio DMEM-F12 en el dispositivo mediante una bomba de jeringa a un caudal de 10 l/min(figura 2C). La dirección del flujo fluyó desde la salida hasta la entrada.</li>
	<li>Repita los pasos 4.1 a 4.4 para cargar otros tipos de celda en el dispositivo.</li>
	<li>Después de completar la captura celular, utilice un microscopio con lente 4x para crear imágenes de cada cámara de cultivo. NOTA: Las emisiones de fluorescencia de las células se utilizaron para identificar y contar el número de células individuales en cada cámara de cultivo.</li>
	<li>Retire el tubo de PTFE y selle la entrada y la salida con cinta de poliolefina para crear un sistema de cultivo cerrado.</li>
	<li>Mueva el dispositivo PDMS a una placa de cultivo de 10 cm y agregue 10 ml de PBS estéril alrededor del dispositivo PDMS para evitar la evaporación del medio del dispositivo.</li>
	<li>Transfiera el plato de cultivo a una incubadora (37oC, 5% CO2 y 95% de humedad) para un cultivo triple de una sola célula.</li>
	<li>Observar y fotografiar microscópicamente el crecimiento celular cada 12 h.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Las interacciones intercelulares de varias células en el microambiente tumoral juegan un papel importante en la progresión del tumor17. Para comprender el mecanismo de las interacciones célula-célula, los sistemas de cocultivo se utilizan como un método analítico común. Sin embargo, múltiples tipos de células y la heterogeneidad de las propias células han llevado a complejidad experimental y dificultades analíticas.
El chip de cierre hidrodinámico permite la carga de mú...

Se necesita una captura eficiente de diferentes tipos de celdas individuales y proporcionar suficiente espacio de cultivo para experimentos de cocultivo de una sola célula de varios tipos de celdas individuales1. Limitar la dilución es el método más utilizado para preparar las células individuales para tales experimentos, debido al bajo costo del equipo requerido. Sin embargo, debido a la limitación de distribución de Poisson, la probabilidad máxima de adquisición de una sola célula es de solo 37%, lo que hace que la operación experimental sea laboriosa y requiera mucho tiempo2. Por el contrario, el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) puede superar la limitación de distribución de Poisson para preparar de manera alta células individuales3. Sin embargo, es posible que algunos laboratorios no puedan acceder a FACS debido a los costosos costos de instrumentación y mantenimiento. Los dispositivos microfabricados se han desarrollado recientemente para el reventado de una sola célula4,el emparejamiento de una sola célula5y las aplicaciones de cultivo de una sola célula. Estos dispositivos son ventajosos en función de su capacidad para manipular con precisión celdas individuales6,realizar experimentos de alto rendimiento o reducir el consumo de muestras y reactivos. Sin embargo, realizar experimentos de cocultivo de una sola célula con varios tipos de células con los dispositivos microfluídicos actuales sigue siendo un desafío debido a la limitación de la distribución de Poisson1,7,8,o la incapacidad de los dispositivos para capturar más de dos tipos de células individuales4,5,6,9,10.
Por ejemplo, Yoon y otros informaron de un dispositivo microfluídico para el estudio de interacción célula-célula11. Este dispositivo utiliza el método probabilístico para emparejar celdas en una cámara. Sin embargo, sólo puede lograr el emparejamiento de dos tipos de celda diferentes debido a restricciones geométricas en la estructura del dispositivo. Otro informe de Lee y otros demostró un método determinista para capturar y emparejar celdas individuales12. Este dispositivo aumenta la eficiencia de emparejamiento por el método determinista, pero está limitado por el tiempo de operación prolongado necesario para emparejar celdas. Específicamente, la segunda captura de célula sin capacidad sólo se puede realizar después de que la primera celda capturada se une a la superficie después de 24 h. Zhao et al. informaron de un dispositivo microfluídico basado en gotas para capturar dos tipos de una sola celda13. Podemos encontrar que el dispositivo microfluídico basado en gotas todavía se limita a la distribución de Poisson y sólo se puede utilizar en células no conectadas, y no es posible cambiar la solución de cultivo durante el proceso de cultivo.
Anteriormente, hemos desarrollado un microfluido "chip de cierre hidrodinámico" que utiliza fuerzas hidrodinámicas deterministas para capturar múltiples tipos de una sola célula en la cámara de cultivo y posteriormente puede realizar experimentos de cocultivo celular para analizar comportamiento de migración de celda sindividual en las interacciones de célulascelulares 14. El chip de cierre hidrodinámico comprende un conjunto de unidades de matriz que cada una contiene un canal de derivación de serpentina, un sitio de captura y una cámara de cultivo. Mediante el uso de la diferencia en la resistencia al flujo entre el canal de derivación de serpentina y la cámara de cultivo, y un procedimiento de operación especialmente diseñado, diferentes tipos de células individuales se pueden capturar repetidamente en la cámara de cultivo. En particular, el amplio espacio de la cámara de cultivo no sólo puede evitar que la célula se enjuague durante la captura de células, sino que también proporcione suficiente espacio para que las células se propaguen, proliferen y migren, lo que permite observar interacciones en vivo de una sola célula. En este artículo, nos centramos en la producción de este dispositivo y los pasos detallados del protocolo.

<table><tbody><tr><td>Cinta médica microfluídica de diagnóstico de poliolefina avanzada</td> de <td>3M Compañía</td><td>3795R</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamina-Penicilina-Estreptomicina</td></tr><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk AutoCAD</td><td>LT 2011</td><td>Nº de pieza 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Tinte CellTracke Azul CMAC Invitrogen</td><td></td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Verde Tinte CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Horno convencional</td><td>YEONG-SHIN empresa</td><td>ovp45</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Desecador de vacío ahorrador de espacio 190 mm base blanca</td></tr><tr><td>DiIC12(3) tinte para membrana celular BD</td><td>Biosciences</td><td>354218</td><td>Utilizado como rastreador de células</td></tr><tr><td>DMEM-F12 medio</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células endoteliales MV 2</td><td>PromoCell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino Hyclone</td><td>Thermo</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton serie 700 Jeringa de vidrio ( 0.1 ml )</td><td>Hamilton</td><td>80630</td><td>100 &micro; L, modelo 710 RN SYR, NDL extraíble pequeño, calibre 22s, 2 pulgadas, estilo de punta 2</td></tr><tr><td>punzonadora Harris Uni-Core</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15075</td> con punzón Harris Uni-Core <td>de 1,5 mm de diámetro interior</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15071</td><td>con placa calefactora de 0,5 mm de diámetro interior</td></tr><tr><td>YOTEC</td><td>de la empresa</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Alineador Msak</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>Plasma de oxígeno</td><td>NORDSON MARCH</td><td>AP-300</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Sistema de tratamiento de plasma de sobremesa Kit de</td></tr><tr><td>polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Politetrafluoroeteno (PTFE)</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>TFT-23T</td><td>diámetro interior, 0,51 mm; diámetro exterior, 0,82 mm</td></tr><tr><td>Cinta extraíble</td><td>3M Company</td><td>Scotch Cinta extraíble 811</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicona</td><td>Eltech Máquina de recubrimiento</td><td>por</td> centrifugado SPE0039 <td></td></tr><tr><td>Eltech</td><td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems Leica</td><td>E24</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 10 fotorresistente negativo</td><td>MicroChem</td><td>Y131259</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2 fotorresistente negativo</td><td>MicroChem</td><td>Y131240</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050 fotorresistente MicroChem</td><td></td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 revelador</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Acetato de éter monometílico de propilenglicol</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus 703007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triclorosilano</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo. Peligroso. Corrosivo para las vías respiratorias, reacciona violentamente con el agua.</td></tr><tr><td>Solución neutralizadora de tripsina</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Los ensayos de cocultivo celular se han utilizado ampliamente para estudiar las interacciones de células celulares entre diferentes tipos de células para comprender mejor la biología de las enfermedades, incluido el cáncer. Sin embargo, es difícil aclarar el complejo mecanismo de interacciones intercelulares en poblaciones celulares altamente heterogéneas utilizando sistemas de cocultivo convencionales porque la heterogeneidad de la subpoblación celular está oscurecida por los valores medios; los sistemas de cocultivo convencionales sólo se pueden utilizar para describir la señal de población, pero son incapaces de rastrear el comportamiento de las células individuales. Además, los métodos experimentales convencionales de una sola célula tienen baja eficiencia en la manipulación celular debido a la distribución de Poisson. Los dispositivos microfabricados son una tecnología emergente para estudios de una sola célula porque pueden manipular con precisión células individuales a un alto rendimiento y pueden reducir el consumo de muestras y reactivos. Aquí, describimos el concepto y la aplicación de un chip microfluídico para múltiples cocultivos de una sola célula. El chip puede capturar de manera eficiente varios tipos de células individuales en una cámara de cultivo (46%) y tiene un espacio de cultivo suficiente útil para estudiar el comportamiento de las células (por ejemplo, migración, proliferación, etc.) bajo la interacción célula-célula a nivel de una sola célula. Las células endoteliales linfáticas y el carcinoma de células escamosas orales se utilizaron para realizar un experimento de cocultivo de una sola célula en la plataforma microfluídica para estudios de interacción de células únicas en vivo.

El dispositivo tiene una estructura de tres capas como se muestra en la fotografía transversal de un dispositivo PDMS cortado(Figura 1A). La primera capa contiene un sitio de captura (6,0 m de ancho y 4,6 m de altura) que conecta la cámara de cultivo y el canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación hace que las celdas fluyan hacia la posición de captura y llenen la entrada ...

Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Es fundamental combinar eficazmente la eficiencia de la captura con la observación dinámica de imágenes de celdas vivas para comprender el efecto de la interacción celda-célula en los comportamientos de las células. Este tubo puede capturar de manera altamente eficiente varias células individuales en una cámara más grande, y proporcionar una base de cultivos suficiente, para el seguimiento dinámico de múltiples comportamientos de interacción de una sola célula. Comience preparando el dispositivo PDMS.Coloque un molde de oblea en el plato de pesaje con 100 microlitros de triclorosilano en un desecador y aplique un vacío durante 15 minutos. Detenga el vacío y salinize el molde de obleas en el desecador a 37 grados Celsius durante al menos una hora. Mezcle la base de PDMS y el agente de curado PDMS en una proporción de diez a uno, luego vierta un total de 20 gramos de la mezcla en el molde de obleas en un plato de 15 centímetros.Coloque el plato de 15 centímetros en un desecador y aplique un aspirador durante un minuto y medio. A continuación, retire el plato del desecador y elimine las burbujas de aire residuales en el PDMS con gas nitrógeno. Curar el PDMS colocando el plato en un horno a 65 grados centígrados durante dos a cuatro horas.Cuando haya terminado, quite la réplica de PDMS del molde de oblea y golpee una entrada de 1,5 milímetros y una salida de 0,5 milímetros en el PDMS. Limpie la réplica de PDMS y la superficie de la diapositiva con cinta extraíble. Tratar la superficie con plasma de oxígeno.A continuación, alinee manualmente la réplica de PDMS con la diapositiva y póngalas en contacto entre sí. Deje la diapositiva PDMS en el horno Celsius de 65 grados durante un día. Al día siguiente, sumerja el dispositivo PDMS en un contenedor lleno de PBS.Colóquelo en el desecador y aplíquelo durante 15 minutos. Mueva el dispositivo a una capucha de cultivo celular y esterilícelo con luz UV durante 30 minutos. Reemplace el búfer del dispositivo PDMS por medio e in incubarlo a cuatro grados centígrados durante un día.Cuando las células logren entre 70 y 80% de confluencia, retire el medio de cultivo y lávelos suavemente tres veces con cinco mililitros de PBS. Añadir un mililitro de medio DMEM/F-12 que contenga un tinte fluorescente micromolar a las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, e incubarlas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lave suavemente las células tres veces con cinco mililitros de PBS estéril, retire el PBS y agregue dos mililitros de 0.25%Trypsin-EDTA.Incubar las células durante cuatro minutos a temperatura ambiente, luego toque suavemente el plato de cultivo para promover el desprendimiento celular. Añadir cuatro mililitros de medio DMEM/F-12 para dispersar las células WNT5B sh4 y pLKO-GFP, transferir las células a un tubo de 15 mililitros y centrifugarlas a 300 xg durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente el pellet celular en un mililitro de DMEM/F-12 medio.Preparar un mililitro de suspensión celular a una concentración de tres veces diez a quintas células por mililitro y mantenerlo en hielo para evitar la agregación celular. Conecte el tubo de politetrafluoroetileno entre la salida del dispositivo y la bomba de la jeringa. Retire el medio y agregue un microlitro de la suspensión de celda preparada en la entrada del dispositivo PDMS.A continuación, cargue la suspensión celular en el dispositivo utilizando una bomba de jeringa a un caudal de 0,3 microlitros por minuto. Agregue un microlitro de medio DMEM/F-12 en la entrada del dispositivo y, a continuación, cargue el medio en el dispositivo con una bomba de jeringa. Cargue 0,3 microlitros de medio DMEM/F12 en el dispositivo con la bomba de jeringa a un caudal de 10 microlitros por minuto.Después de cargar las células, retire el tubo y selle la entrada y salida con cinta de poliolefina para crear un sistema de cultivo cerrado. Mueva el dispositivo PDMS a un plato de cultivo de 10 centímetros y agregue 10 mililitros de PBS estéril alrededor del dispositivo para evitar la evaporación del medio. Transfiera el plato de cultivo a una incubadora para el cultivo de triple célula.El dispositivo PDMS tiene una estructura de tres capas con un sitio de captura que se conecta a la cámara de referencia cultural y al canal de derivación. La diferencia en la resistencia al flujo entre la cámara de cultivo y el canal de derivación permite que la celda fluya hacia la posición de captura, lo que hace que la siguiente celda pase a través del canal de derivación al siguiente sitio de captura. El paso de reflujo se utiliza para liberar la celda del sitio de captura y enviarla a la cámara de cultivo.La eficiencia de captura de celdas de este protocolo se evaluó en tres tipos de células diferentes. Células endoteliales linfáticas humanas, o LECs, células T2.6 de carcinoma de células escamosas orales humanas que expresan ARN de horquilla corto específico de WNT5B y células de control vectorial pLKO-GFP. Las eficiencias de captura de una sola célula de las tres células demostradas fueron aproximadamente del 71% para los LEC, del 74% para las células WNT5B sh4 y del 78% para las células pLKO-GFP.La eficiencia de captura de tres células individuales fue del 48%Este método se puede utilizar para múltiples co-cultivos de una sola célula de células endoteliales linfáticas y células cancerosas escamosas, y la proliferación y morfología de la célula se puede observar bajo un microscopio. Es importante asegurarse de que las suspensiones de celda preparadas tengan agregados de celda mínimos, ya que los agregados de celda no solo reducen la eficiencia de emparejamiento único, sino que también pueden obstruir los microprocesos. La interacción celda-célula entre celdas individuales desempeña un papel importante en el control de los comportamientos de las células.Nuestro método puede proporcionar una herramienta eficiente para ayudar a los investigadores a estudiar la interacción célula-célula a un solo nivel celular, lo que puede conducir al descubrimiento de nuevos mecanismos que no se pueden obtener fácilmente de estudios basados en la población.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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Aprenda a establecer coculturas deterministas de células únicas con un chip microfluídico. Este método permite el seguimiento dinámico de interacciones celulares para estudiar comportamientos en biología celular.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

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