Name: Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Aprende a diseñar clústeres artificiales de microRNAs para terapia génica en glioblastoma mediante bioinformática y ensamblaje de secuencias. Este método computacional permite modular simultáneamente múltiples microRNAs con aplicaciones en oncología.

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Los autores desean agradecer a los miembros del Laboratorio de Neurooncología Harvey Cushing por su apoyo y crítica constructiva. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NINDS K12NS80223 y K08NS101091 a P. P.

1. Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el Glioblastoma
<ol><li>Análisis de la expresión diferencial amplia de miRNA en glioblastoma vs.
	<ol>
<li>En primer lugar, determinar los MIRNAs más significativamente desregulados en el tumor. Esto se puede lograr utilizando al menos tres métodos diferentes:<ol>
<li>Mina el Atlas del Genoma del Cáncer, encontrado en https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para la secuenciación de datos11.</li>
			<li>Realizar análisis de microarray a partir de una nueva muestra operativa12.</li>
			<li>Utilice conjuntos de datos publicados anteriormente13. NOTA: Cualquiera que sea el método elegido, la salida proporciona un conjunto masivo de miRNAs cuya expresión está estadísticamente correlacionada (ya sea directa o inversamente) con la biología tumoral. Este grupo inicial constituye el grupo de miRNAs que se analizan más a fondo para la identificación de un subconjunto de miRNAs que muestra la asociación funcional más estricta mediante la realización de un análisis más dinámico de los cambios de expresión, como se describe a continuación.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de expresión de miRNA específico de la condición
	<ol>
<li>Inducción de la diferenciación celular:<ol>
<li>Utilice platos de plástico de poli-d-lisina (PDL) pre-recubiertos para favorecer la formación de un cultivo monocapa. Para el recubrimiento de platos, disolver PDL en agua a una concentración de 100 g/ml. Utilizar 1 ml de solución por superficie de 25 cm2. Enjuague 2x con PBS 6 h después de la aplicación de la solución PDL.</li>
			<li>Placa de células madre neuronales humanas en cantidades iguales (100.000 células/5 ml) ya sea en medio de células madre (medio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), medio de diferenciación astrocítica (DMEM + 10% FBS), o medio de diferenciación neuronal (medio neurobasal + B27 suplemento, +2 m de ácido retinoico)14. El protocolo para la diferenciación de oligodendrocitos requiere la adición de IGF-1 (200 ng/mL) después de la eliminación de EGF/FGF14,15.</li>
			<li>Después del revestimiento de celdas, colóquelo en la incubadora durante 1 semana a 37oC, 5% CO2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Extracción de ARN:<ol>
<li>Después de 7 días, retire las células de la incubadora y retire el medio.</li>
			<li>Lavar las células con PBS (5 ml). A continuación, agregue 1 ml de reactivo de lisis (ver Tabla de materiales)para atajar las células y raspar las células en un tubo de microfusión de 1,5 ml utilizando un rascador de células. Mantenga los tubos que contienen las células lysed a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.</li>
			<li>Proceda al aislamiento total del ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análisis de expresión de miRNA:<ol>
<li>Cuantifique la expresión diferencial de miRNAs específicos identificados en el paso 1.1 entre los tres patrones de diferenciación por PCR en tiempo real, utilizando sondas TaqMan y siguiendo los protocolos del fabricante para la transcripción inversa y la amplificación de PCR ( Figura 1).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Validación de clústeres de miRNA por desafíos específicos del estrés
	<ol>
<li>Cultivo G34 glioblastoma células similares a un tallo en medio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF. Comience con 1 x 106 células en 5 ml en un matraz de 25 cm2 de baja fijación.</li>
		<li>A partir de 48 h después del enchapado, añada concentraciones duplicados de agente alquilante de ADN temozolomida (TMZ) cada 5 días, de la siguiente manera:<ol>
<li>Comience con 5 m durante 5 días. Después de 5 días, retire el medio y reemplácelo por medio fresco sin temozolomida, para permitir que las células supervivientes se recuperen. Después de 48 h, añadir 10 m TMZ e incubar durante otros 5 días.</li>
			<li>Repita el paso 1.3.2.1, duplicando la concentración de TMZ cada vez, hasta que se alcance una concentración de al menos 100 m y las células se vuelvan resistentes al fármaco10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>En un experimento paralelo, irradiar células G34 de la siguiente manera:<ol>
<li>A partir de 48 h después de chapar 1 x 106 células en 5 ml en un matraz de 25 cm2 de baja fijación, irradiar células con 2 Gy de energía (cualquier irradiador que proporcione emisión de fotones es aceptable). Devuelva las células a la incubadora y no moleste. Después de 48 h, irradiar las células de nuevo con 2 Gy adicionales de energía.</li>
			<li>Repita el paso 1.3.3.1 4x hasta que se administre un total de 10 Gy de energía.</li>
			<li>Devuelva las células a la incubadora y deje que se recuperen en medio fresco durante al menos 5 días antes del análisis posterior.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Después de la inducción de la resistencia, las células de la lyse usando reactivo de lisis y extraer ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
		<li>Analice la expresión de los miRNAs específicos identificados en las secciones 1.1-1.2 como se describe en el paso 1.2.1(Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Caracterización de la convergencia funcional de los miRNAs agrupados
	<ol>
<li>Obtenga el targetome previsto de cada miRNAs definido en las secciones 1.2-1.3 obtenidas mediante herramientas de predicción de segmentación de miRNA. NOTA: Generalmente recurrimos a TargetScan, ya que su algoritmo se actualiza periódicamente16. Las herramientas de predicción adicionales son miRanda17, miRDB18y DIANA-miRPath19. Todos estos programas son aplicaciones gratuitas basadas en la web.<ol>
<li>En la página principal de Targetscan, seleccione el miRNA de interés en el menú desplegable rellenado previamente. Haga clic en el botón Enviar.</li>
			<li>Descargue la lista resultante de destinos como hoja de cálculo mediante el vínculo Descargar tabla (Figura complementaria 1).</li>
			<li>Para reducir las posibilidades de predicciones falsas positivas, incluya solo los destinos dentro de la columna de sitios conservados en los análisis posteriores. Además, se puede obtener más rigáscencia mediante el uso de programas de predicción de miRNA adicionales (ver arriba) y sólo incluyendo objetivos que son comunes a todos los algoritmos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Clasificar los targetomes resultantes de acuerdo con las categorías de Gene Ontology usando ToppGene Suite20 para evaluar el enriquecimiento de las vías que son comunes a cada miRNA.<ol>
<li>Pegue la lista de objetivos obtenidos del paso 1.4.1 en la ventana "Conjunto de genes de entrenamiento", utilizando el símbolo HGNC como tipo de entrada. Haga clic en Enviar > Inicio. El programa proporcionará una tabla de salida que muestra las categorías "Go" más significativas para la lista introducida de genes(Figura Suplementaria 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para establecer finalmente la contribución de cada miRNA a la regulación de una vía común o proceso celular (en este caso, regulación de la cromatina), compruebe cada targetome obtenido en el paso 1.4.1 contra la lista completa de genes implicados en el proceso celular específico ( es decir, regulación de la cromatina), utilizando la función de diagrama de Venn proporcionada en el sitio web de Bioinformática y Genómica Evolutiva http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn. NOTA: Este programa permite la intersección de varios grupos al mismo tiempo(Figura 3). Los objetivos únicos específicos proporcionados por cada miRNA se anotan y seleccionan para experimentos funcionales posteriores.<ol>
<li>En la primera página del programa, cargue o copie/pegue la lista si los ARNM de destino para cada miRNA o interés en las ventanas respectivas. Asigne un nombre a cada lista con un identificador único.</li>
			<li>Haga clic en Enviar. El programa proporcionará una salida visual de un diagrama de Venn con números de genes en cada sector, así como una lista completa de ARNm para cada subconjunto y combinaciones de intersección.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Montaje de módulos miRNA en un clúster policistrónico transgénico
<ol><li>
Preparación de andamios transgénicos basados en el locus de racimo miR-17-92
	<ol>
<li>Obtenga la secuencia de nucleótidos del clúster miR-17-92 del navegador del genoma de Ensembl21. Seleccione la secuencia de "núcleo" del par base de 800 que abarca las seis horquillas miRNA codificadas del locus y al menos secuencias de flanqueo de 200 nucleótidos tanto aguas arriba (5') como aguas abajo (3') de la secuencia central.</li>
		<li>Pegue la secuencia anterior en cualquier programa de edición de palabras.</li>
		<li>Defina la secuencia de cada una de las seis horquillas nativas recuperándolas en miRBase22. Marque cada una de estas secuencias dentro del intervalo de la secuencia "núcleo" previamente identificada. Cualquier secuencia entre cada horquilla representa secuencias espaciadoras, que son importantes para el correcto procesamiento del transgén.</li>
		<li>Retire las secuencias de horquillas nativas de la secuencia "núcleo", con la excepción de 3-5 nucleótidos en los extremos de 5' y 3' de cada horquilla, que servirán como un aceptador para las nuevas horquillas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Creación de un nuevo transgén que codifica varios miRNAs de elección
	<ol>
<li>Obtener secuencias de horquillas de miRNAs destinados a ser sobreexpresados en el transgén de miRBase. Tenga en cuenta cuidadosamente los nucleótidos específicos que son los sitios de la escisión del microprocesador.</li>
		<li>Sustituya las horquillas eliminadas (paso 2.1.4) por las secuencias de horquilladeras de los miRNAs deseados obtenidos en el paso 2.2.1.</li>
		<li>Agregue las secuencias de restricción deseadas en ambas regiones flanqueantes del transgén para facilitar la subcloning en vectores de entrega de su elección. Verifique que las secuencias de restricción elegidas no estén presentes dentro de la secuencia sí misma.</li>
		<li>Para controles negativos, utilice secuencias revueltas de 20 nucleótidos para reemplazar la secuencia natural de 20 nucleótidos de cada miRNA maduro. Genere estas secuencias codificadas utilizando una herramienta en línea como https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificar la estructura bidimensional del transgén
	<ol>
<li>Copie la secuencia transgénica completa en el programa de software de predicción de estructura de ARN RNAweb Fold23.</li>
		<li>Mediante la configuración estándar del programa, haga clic en Continuar.</li>
		<li>Analizar la salida gráfica, particularmente para la presencia de horquillas bien definidas y la presencia de estructuras de tallo de doble cadena al menos 11 nucleótidos proximales al sitio de escisión del microprocesador. Además, busque la ausencia de puntos de bifurcación dentro de las secuencias de horquilla(Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Obtención de Transgenes por Síntesis de ADN
<ol><li>Después del diseño y en la validación en silico del cúmulo de miRNA quimérico, obtenga la secuencia de trabajo utilizando la síntesis de ADN de los proveedores comerciales24 y proceda con la clonación aguas abajo en vectores y entrega de transgénicos. Hemos utilizado vectores lentivirales para la entrega in vitro10 y virus asociados a dedeno (AAVs) para la entrega in vivo intracraneal25.</li>
</ol>

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<li>Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+miRNA+and+Gene+Expression+Profiles+in+Alzheimer%27s+Disease%3A+A+Meta-Analysis+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach.</a> Scientific Reports. 8, 4767(2018).</li>
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<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNAs%3A+tiny+regulators+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">miRNAs: tiny regulators with great potential.</a> Cell. 107, 823-826 (2001).</li>
<li>Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+miRNA+biogenesis+and+its+crosstalk+with+other+cellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).</li>
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</ol>

Los autores no informan de conflictos de intereses.

Este protocolo se basa en la noción de que en lugar de funcionar de forma aislada, los miRNAs son biológicamente relevantes al trabajar en grupos, y estos grupos están determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar este enfoque desde una perspectiva traslacional, se introduce un protocolo de seguimiento que permite la recreación de este patrón multi-miRNA en células/tejidos. Esto es posible aprovechando la biogénesis relativamente simple de los miRNAs, por...

los miRNAs ofrecen una oportunidad inigualable para el desarrollo de un enfoque amplio de terapia génica para muchas enfermedades1,2,3, incluyendo el cáncer4,5. Esto se basa en varias características únicas de estas moléculas biológicas, incluyendo su pequeño tamaño6, biogénesis simple7,y tendencia natural a funcionar en la asociación8. Muchas enfermedades se caracterizan por patrones específicos de expresión de miRNA, que a menudo convergen en la regulación de funciones biológicas complejas9. El propósito de este método es primero definir una estrategia para identificar grupos de miRNAs que son sinérgicamente relevantes para funciones celulares específicas. En consecuencia, proporciona una estrategia para el restablecimiento de tales combinaciones de miRNA en estudios y aplicaciones posteriores.
Este método permite el análisis funcional de múltiples miRNAs a la vez, aprovechando su segmentación simultánea de un gran número de ARNm, recapitulando así los complejos paisajes de las enfermedades. Este enfoque se ha empleado recientemente para definir un grupo de tres miRNAs que 1) están simultáneamente regulados en cáncer cerebral y 2) muestran un fuerte patrón de coexpresión durante la diferenciación neuronal, así como en respuesta al estrés genotóxico por radiación o un Agente alquilante de ADN. La re-expresión combinatoria de este módulo de tres miRNAs por el método de agrupación que se describe a continuación da lugar a una profunda interferencia con la biología de las células cancerosas y se puede utilizar fácilmente como estrategia de terapia génica para estudios preclínicos10. Este protocolo puede ser de particular interés para los involucrados en la investigación de miRNA y sus aplicaciones traslacionales.

<table><tbody><tr><td>0.4% agarosa a baja temperatura de fusión&nbsp;</td><td>IBI Scientific IB70058</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 y micro; M unidad de filtro estéril</td><td>Merck Millipore</td><td>SLH033RS</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 pocillos&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Ratones atímicos (FoxN1 nu/nu)</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper, 16cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>Irradiador de cesio 137&nbsp;</td><td>Instalación central de JL Sheperd and Associates</td><td>(Facultad de Medicina de Harvard)</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439142-4L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 11995040</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>solución Eosin Y&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1051750500</td><td></td></tr><tr><td>Células madre de glioma primario humano (GBM62)</td><td></td><td></td><td>Proporcionado por el Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Células madre de glioma primario humano (MGG4)</td><td></td><td></td><td>Proporcionado por el Dr. Hiroaki Wakimoto (Hospital General de Massachusetts, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Vector lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP</td><td>System Biosciences</td><td>CD511B-1</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Microcentrífuga refrigerada Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>n.º de modelo 5424 R, n.º de cat.5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4112APG</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Tubos de centrífuga de fondo redondo de policarbonato de alta velocidad&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>Células progenitoras neurales (NPC)</td><td></td><td></td><td>Proporcionado por el Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)</td></tr><tr><td>Medio Neurobasal&nbsp;</td>Sistema <td></td> de microscopio fluorescente motorizado <td>Thermo Fisher Scientific</td> 21103049 <td></td></tr><tr><td>Nikon eclipse Ti</td><td>Nikon, Japón</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985088</td><td></td></tr><tr><td>tubos de PCR&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6571-960EA</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina&nbsp;</td>Placas de Petri <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>94/16&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-básico&nbsp;</td><td>PeproTech&nbsp;</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Gibco</td><td>12587-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de ARN</td><td>Direct-zol</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Termociclador&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Micro Irradiador Guiado por Imágenes para Pequeños Animales&nbsp;</td><td>Xstrahal Life Sciences, Reino Unido</td><td>Instalación central (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Sorvall WX+&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75000100</tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td></td> Sistema de PCR en tiempo real <td>Thermo Fisher Scientific</td> A1110501 <td></td></tr><tr><td>StepOne</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>4376357</tr><tr><td>Cabina de bioseguridad SterilGARD&nbsp;</td><td>The Baker Company</td><td>SG403A-HE</td> Sacarosa Sigma-Aldrich <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>T98-G</td><td>American Type Culture Collecti</td><td>ATCC CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Transcription Kit de transcripción inversa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 4366596</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Temozolomida</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2706</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek temperatura óptima de corte&nbsp;</td><td>Reactivo</td> TRIzol <td>NC9636948 de</td><td></td>Fisher Scientific</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 15596026</td><td></td><td>Reactivo de lisis</td></tr><tr><td>U251-MG</td><td>Tipo americano Culture Collecti</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>U87-MG&nbsp;</td><td>Colección de cultura tipo americana</td><td>ATCC HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>ViraPower Sistema de expresión lentivectorial&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K4970-00</td><td></td></tr><tr><td>Agua, grado HPLC</td><td>Fisher</td><td>W54</td><td></td></tr><tr><td>Xileno&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de los mirnas asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica

Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy

La relevancia biológica de los microARN (miRNAs) en salud y enfermedad se basa significativamente en combinaciones específicas de muchos miRNAs desregulados simultáneamente en lugar de la acción de un solo miRNA. La caracterización de estos módulos miRNAs específicos es un paso fundamental para maximizar su uso en la terapia. Esto es extremadamente relevante porque sus atributos combinatoriales pueden ser prácticamente explotados. Aquí se describe un método para definir una firma específica de miRNA relevante para el control de los represores de cromatina oncogénica en el glioblastoma. El enfoque define primero un grupo general de miRNAs que se desreglamentan en los tumores en comparación con el tejido normal. El análisis se perfecciona aún más mediante condiciones de cultivo diferencial, subrayando un subgrupo de miRNAs que se expresan simultáneamente durante estados celulares específicos. Por último, los miRNAs que satisfacen estos filtros se combinan en un transgenes policistrónicos artificiales, que se basa en un andamio de genes de agrupaciones de miRNA naturalmente existentes, luego se utilizan para la sobreexpresión de estos módulos de miRNA en las células receptoras.

Este método permitió la caracterización de un módulo de tres miRNAs que están constantemente regulados en tumores cerebrales, que se expresan específicamente durante la diferenciación neuronal(Figura 1) e implican en la respuesta de supervivencia tumoral después de terapia(Figura 2). Esto se logra mediante la regulación de una vía represiva de cromatina oncogénica compleja. Este patrón de co-expresión sugiere una fuerte actividad...

Aquí se describe un protocolo para caracterizar módulos de miRNAs biológicamente sinérgicos y su ensamblaje en transgenes cortos, lo que permite la sobreexpresión simultánea para aplicaciones de terapia génica.

Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica

The biological relevance of microRNAs (miRNAs) in health and disease significantly relies on specific combinations of many simultaneously deregulated ...

Este protocolo permite la modulación simultánea de muchos micro ARN en células eucariotas y se basa en un método muy simple y flexible que minimiza los pasos de clonación molecular. Esta técnica tiene implicaciones para el estudio de las interacciones funcionales del micro ARN in vitro, pero lo más importante es que proporciona una plataforma para un uso más eficaz de los micro RNA en la terapia. Lo hemos desarrollado y utilizado principalmente en el contexto del cáncer cerebral, pero se aplica a cualquier enfermedad en la que intervienen múltiples alteraciones de la expresión génica.Hemos probado nuestros genes trans artificiales en otros modelos como las líneas de cáncer de mama y tiroides que muestran la reproducibilidad de esta técnica. El conocimiento básico de la bioinformática y la biología del micro ARN es útil para este protocolo, pero no es indispensable. Un enfoque bioinformático es importante para definir las combinaciones de micro ARN relevantes y el TRK-11, mientras que la familiaridad con el procesamiento del micro ARN es importante para entender cómo estos diferentes micro ARN se pueden ensamblar en grupos de ADN artificial que se pueden procesar con éxito una vez estables a las células específicas.Para cubrir el plato, primero disolver la poli-D-lisina en agua a una concentración de 100 microgramos por mililitro. Vierta la solución en el plato a la cantidad de un mililitro de solución por cada 25 centímetros cuadrados de superficie. Gire el plato para asegurarse de la cobertura de todo el plato.Después de seis horas aspirar la solución de poli-D-lisina y enjuagar dos veces con PBS. Placa de células madre neurales humanas en la cantidad de 100.000 células por cada cinco mililitros del medio, ya sea en medio de células madre, medio de diferenciación astrocítica o medio de diferenciación neuronal. Después del enchapado celular, coloque el plato en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante una semana y proceda a realizar análisis de expresión de ARN micro de acuerdo con el manuscrito.Para cultivar células similares al tallo del glioblastoma GBM-34, comience con una por diez a las quintas células y cinco mililitros de medio neurobasal en un matraz de unión baja de 25 centímetros cuadrados. Coloque el matraz en una incubadora a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono. 48 horas después del enchapado, añadir concentraciones dobles de ADN alquilante agente temozolomida cada siete días.Comience con la adición de cinco MICROmolar TMZ complementados en cinco mililitros medio durante cinco días. Después de cinco días, retire el medio y sustitúyalo por medio fresco sin temozolomida para permitir que las células sobrevivientes se recuperen. Después de 48 horas, añadir 10 temozolomida micromolar e incubar durante otros cinco días.Repita el tratamiento con temozolomida doble hasta que se alcance la concentración de al menos 100 micromolares y las células se vuelvan resistentes al fármaco. Después de la inducción de la resistencia, células de mentira utilizando 1 mililitro de reactivo de lisis. Extraiga el ARN total y analice la expresión de los microNAs específicos según el manuscrito.Para obtener el targetome previsto de cada micro ARN previamente definido, utilice herramientas de predicción de micro ARN. En la primera página de TargetScan, seleccione el micro ARN de interés en el menú desplegable rellenado previamente. Haga clic en el botón Enviar.Descargue la lista resultante de destinos como una hoja de cálculo mediante el enlace de la tabla de descarga. Para reducir las posibilidades de predicciones falsas positivas, incluya solo los destinos dentro de la columna de sitios conservados y el análisis posterior. Los programas adicionales de predicción de micro ARN obtienen mayor rigurosidad y solo incluyen destinos que son comunes a todos los algoritmos.A continuación, abra La suite ToppGene 20. Para evaluar el enriquecimiento de las vías que son comunes a cada micro ARN, pegue la lista de objetivos obtenidos en la ventana de conjuntos de genes de entrenamiento. Haga clic en Símbolo HGNC como tipo de entrada.Haga clic en Enviar e iniciar. El programa proporciona una tabla de salida que muestra las categorías GO más significativas para la lista introducida de genes. Para establecer finalmente la contribución de cada micro ARN a la regulación de una vía común o proceso celular, abra la función venn-diagram proporcionada en el sitio web de Bioinformática y Genómica Evolutiva.Compruebe cada targetome obtenido con la lista completa de genes involucrados en el proceso celular específico. Si los ARN de mensajería de destino para cada micro ARN de interés se encuentran en las ventanas respectivas, cargue la lista de copiar y pegar. Asigne un nombre a cada lista con un identificador único.Haga clic en Enviar. El programa proporciona una salida visual de un diagrama de venn con números de genes en cada sector, así como una lista completa de ARN de mensajería para cada subconjunto y combinaciones de intersección. Para agrupar los micro ARN seleccionados en un gen trans funcional, obtenga un andamio transgénico basado en el locus de racimo miR-17-92.Obtenga la secuencia de nucleótidos del navegador del genoma en conjunto. Seleccione la secuencia de núcleo de aproximadamente 800 pares base que abarca las seis horquillas de micro ARN codificadas del locus y al menos 200 secuencias de flanqueo de nucleótidos tanto aguas arriba como aguas abajo de la secuencia de núcleo. Pegue la secuencia en cualquier programa de edición de palabras.Define la secuencia de cada uno de los seis pasadores de pelo nativos recuperandolos en la base miR. Marque cada una de estas secuencias dentro del intervalo de secuencia de núcleo previamente identificada. Cualquier secuencia entre cada horquilla representa secuencias espaciadores.A continuación, obtener las secuencias de horquillas de micro ARN destinados a ser sobreesclarados en el gen trans de la base miR. Tenga en cuenta cuidadosamente los nucleótidos específicos que se encuentran en los sitios de escisión del microprocesador. Elimine las secuencias de horquillas nativas de la secuencia de núcleo con la excepción de tres a cinco nucleótidos en las puntas cinco y las de cada horquilla que servirán como un aceptador para las nuevas horquillas.Pegue las secuencias de horquillas de los micro ARN deseados para reemplazar las horquillas previamente eliminadas. Añada las secuencias de restricción deseadas en ambas regiones flanqueantes del gen trans para facilitar la sub-clonación en los vectores de entrega de su elección. Verifique que las secuencias de restricción elegidas no estén presentes dentro de la secuencia misma.Para verificar la estructura bidimensional del gen trans, copie la secuencia transgénica completa en el programa de software de predicción de estructura de ARN RNA WEBfold. Seleccione la configuración estándar del programa y haga clic en continuar. Analizar la salida gráfica, particularmente para la presencia de horquillas bien definidas en presencia de estructuras de vástago de doble hebra que son al menos 11 nucleótidos proximales al sitio de escisión del microprocesador.Además, busque la ausencia de puntos de bifurcación dentro de las secuencias de horquillas. En este punto, el gen trans está listo para ser producido por la síntesis genética y clonado en los vectores de entrega deseados. Este método permitió la caracterización de un módulo de tres micro ARN que están constantemente regulados en tumores cerebrales, que se expresan específicamente durante la diferenciación neuronal.Se confirmaron los patrones de coexpresión de los módulos de micro ARN durante el estrés genotóxico y se sugirió una fuerte actividad sinérgica entre estos tres microR. El gen trans diseñado podría recapitular simultáneamente la expresión de los tres microR en las células del glioblastoma, tanto in vitro como in vivo, con interferencia significativa en la biología tumoral y una aplicabilidad traslacional prometedora. Además, el cúmulo transgénico también era funcional en un modelo de cáncer de mama.Los requisitos cruciales de este protocolo son mantener el tamaño original de la escisión del procesador en el gen trans. Y asegúrese de que se conserva la estructura del lazo del tallo de las horquillas de micro ARN quimérico. Con este método, podemos concentrar múltiples genes de micro ARN biológicamente activos en secuencias de ADN muy cortas que literalmente se pueden instalar in vitro en cualquier vector de administración para uso de terapia génica.Este método es ideal para estudiar la interacción funcional entre diferentes micro RNAs e interferir con complejas vías celulares multifactoriales que de otro modo requerirán múltiples combinaciones de fármacos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aquí describimos un protocolo eficiente y versátil para inducir, monitorizar y analizar nuevos glioblastomas (GBM) utilizando ADN transposón inyectado en los ventrículos de ratones neonatos. Las células de la zona subventricular, que absorben el plásmido, se transforman, proliferan y generan tumores con características histopatológicas de GBM humano.

Transposón mediada Integración de ADN plásmido en la zona subventricular de ratones recién nacidos para generar modelos novedosos de glioblastoma

Los microRNAs desempeñan un papel crucial en el cerebro y son objetivos potenciales para modelar la neurodegeneración. Sin embargo, perturbar los niveles de miARN es un desafío debido a la corta longitud del miARN y la inaccesibilidad del tejido cerebral. Este video presenta un método para el diseño de antagomir y la administración específica del cerebro utilizando un neuropéptido en ratones.

Una alternativa sencilla para inyección estereotáctica para el Cerebro Derribo específico de miARN

Neuroesferas crecidos como culturas 3D constituyen una poderosa herramienta para estudiar la biología del glioma. Aquí presentamos un protocolo para realizar inmunohistoquímica manteniendo la estructura 3D de glioma neuroesferas a través de la inclusión en parafina. Este método permite la caracterización de propiedades de desarrolló de glioma como troncalidad y diferenciación de los nervios.

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

miRNA la terapéutica tienen un potencial significativo en la regulación de la progresión del cáncer. Demostrado aquí son enfoques analíticos utilizados para la identificación de la actividad de un miRNA combinatoria tratamiento en detener el ciclo celular y la angiogénesis.

Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis

Este protocolo utiliza una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en sondas en tiempo real, un ensayo de sulforhodamine B (SRB), 3' regiones no traducidas (3' UTR) clonación, y un ensayo de luciferasa para verificar los genes diana de un miRNA de interés y para entender las funciones de los miRNAs.

Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Este protocolo describe un flujo de trabajo de edición de genes de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas regularmente interespaciadas de alto rendimiento para el análisis de redes de clústeres de microARN que permite la generación rápida de un panel de líneas celulares modificadas genéticamente que llevan combinaciones únicas de eliminación de miembros de grupos de miRNA de hasta 35 kb dentro de un solo experimento.

Herramienta de edición de genes CRISPR para el análisis de redes de clústeres de microARN

La barrera hematoencefálica es un obstáculo importante en la administración de terapias para el glioblastoma, una enfermedad para la que no hay cura. Aquí, reportamos una nano plataforma terapéutica de óxido de hierro guiada por imágenes in vivo que puede eludir esta barrera fisiológica en virtud de su tamaño y acumularse en el tumor.

Entrega de nanopartículas de una carga útil de oligonucleótidos en un modelo animal de glioblastoma multiforme

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende a diseñar clústeres artificiales de microRNAs para terapia génica en glioblastoma mediante bioinformática y ensamblaje de secuencias. Este método computacional permite modular simultáneamente múltiples microRNAs con aplicaciones en oncología.

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Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica

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