Name: Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprende a aislar ARN de células secundarias de glándulas accesorias de Drosophila mediante FACS. Este protocolo permite análisis transcriptómico de poblaciones celulares raras para estudiar genes cruciales en el éxito reproductivo.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio de Karch, a la forma de placa de genómica iGE3, a las instalaciones centrales de Flow Cytometry de la Universidad de Ginebra y al Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye, que estableció el protocolo para FACS. Agradecemos a Luca Stickley por su ayuda para visualizar las lecturas en IGV. Nos damos las gracias por el permiso suave para reutilizar figuras, y a los editores por incitarnos a ser creativos con la escritura.
Esta investigación fue financiada por el Estado de Ginebra (CI, RKM, FK), el Fondo Nacional Suizo de Investigación (www.snf.ch) (FK y RKM) y donaciones de la Fundación Claraz (FK).

1. Líneas de Drosophila Utilizadas y Colección de Hombres
<ol><li>Para este protocolo, utilice machos que expresen GFP en los SC y no en las células principales. Aquí, se utiliza un controlador AbdB-GAL4 (descrito en la referencia18),recombinado con UAS-GFP (en el cromosoma 2). También se pueden utilizar otros controladores apropiados. Para el aislamiento de SC sbajo diferentes condiciones mutantes, cruce la mutación en líneas que contengan la línea GFP específica de SC.</li>
	<li>Recoger dos lotes de unos 25 machos vírgenes sanos por cada genotipo y envejecerlos a 25 oC durante 3-4 días en viales con alimentos Drosophila recién hechos. NOTA: A medida que la edad, el estado de apareamiento, la nutrición y el entorno social afectan cada uno a la biología reproductiva, se deben seguir protocolos estrictos para controlar estos parámetros. Los machos vírgenes envejecen durante 3-4 días después de la eclosión pupal a 25oC con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h, en alimentos estándar de harina de maíz-agar-levadura, en grupos de 20-25 machos por vial.</li>
</ol>2. Soluciones y preparación de materiales
<ol><li>
Prepare las siguientes soluciones.
	<ol>
<li>Preparar medio suplementado en suero (SSM): Medio Drosophila de Schneider complementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor y 1% Penicilina-Streptomicina.</li>
		<li>Prepare alícuotas de 1x enzima trippsina (p. ej., TrypLE Express Enzyme) y guárdelas a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparar alícuotas de papaína [50 U/ml] (almacenadas a -20 oC y descongeladas una sola vez).</li>
		<li>Preparar 1x solución salina tampón de fosfato (PBS, almacenado a temperatura ambiente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare múltiples puntas de pipeta redondeadas por llama para la disociación física de las glándulas accesorias. NOTA: Utilice puntas de baja retención para manipular las glándulas accesorias, ya que tienden a adherirse al plástico no tratado. El proceso de redondeo de llama reduce la abertura de la punta y suaviza los bordes de la punta. Esto asegura una disociación eficiente después de la digestión de la peptidasa sin cortar las membranas celulares.<ol>
<li>Corta una punta de 200 s con una cuchilla afilada y pásala suavemente sobre una llama para redondear su punta de modo que la abertura sea más ancha pero lisa para su manejo durante el paso 3.7.</li>
		<li>Acotar la abertura de múltiples puntas de 1.000 l pasando la abertura de la punta cerca de una llama durante menos de un segundo. Gire ligeramente la punta para evitar el sobre-fusión o obstrucción. Ordena las puntas hechas de más estrecha a más ancha. Esto se puede hacer cronometrando la velocidad de la aspiración. Trate de disociar una muestra a pequeña escala de aGs para probar la eficiencia de las puntas más estrechas. NOTA: Estas puntas son fundamentales para la agitación mecánica (pasos 5.2 y 5.3). Las puntas de pipeta redondeadas con llama de calidad permiten una disociación completa mientras se preserva la viabilidad celular. Como tal, estos consejos se lavan a fondo con agua al final del procedimiento para su reutilización. Esto permite la disociación reproducible del día a día.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Disección de glándulas de accesorios
<ol><li>Ponga de 20 a 25 Drosophila masculina en un plato de vidrio sobre hielo.</li>
	<li>Diseccionar 1 macho en SSM. Quítese el tracto reproductivo y despeje el par de glándulas accesorias de todos los demás tejidos, aparte del conducto eyaculatorio. NOTA: Retire los testículos porque los espermatozoides liberados pueden crear grumos y perturbar el proceso de disociación. Retire la bombilla eyaculatoria, lo que dificulta el manejo cuando flota.</li>
	<li>Con fórceps, transfiera las glándulas accesorias a una placa de vidrio llena de SSM a temperatura ambiente. Repita los pasos 3.2-3.3 20 veces para obtener un lote de 20 pares de glándulas en SSM. NOTA: Estos pasos se lograrán en 15 a 20 min. Los AG deben verse sanos, y los movimientos peristálticos de la capa muscular alrededor de las glándulas deben ser visibles. GFP se puede monitorear con un microscopio fluorescente.</li>
	<li>Transfiera las glándulas accesorias a 1pbS para un lavado de 1-2 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Para una mejor disociación, es imperativo enjuagar las glándulas con PBS. La duración de este paso, sin embargo, debe ser limitada ya que las células muestran signos de estrés en PBS; células secundarias disociadas en PBS se hinchan rápidamente y mueren.</li>
	<li>Diluir la papaína de 20 ml [50 U/ml] en 180 ml de enzima trippsina 1x para obtener la solución de disociación (para escalar hacia arriba o hacia abajo mantenga 9 ml de enzima tripsina y 1 l de papaína para cada macho). Con fórceps, transfiera los prensaestopas a esta solución.</li>
	<li>Aísle la punta de las glándulas accesorias (que contienen células secundarias) de la parte proximal. Usa fórceps finos para pellizcar firmemente el centro de un lóbulo glandular y cortar con la punta afilada de un segundo fórceps. Retire la parte proximal de las glándulas accesorias y el conducto eyaculatorio para mejorar la disociación y reducir el tiempo de clasificación celular. NOTA: Disecting la parte distal de 20 pares de glándulas tomará de 15 a 20 min y la digestión por peptidasas comenzará así a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de que todas las puntas de la glándula hayan sido diseccionadas, transfiéralas en un tubo de 1,5 ml utilizando una punta especial de pipeta de 200 ml preparada en el paso 2.2.1. Debe ser ancho, redondeado y húmedo antes de manipular las glándulas. NOTA: Para pipetear el tejido de la glándula accesoria, las puntas siempre deben estar premojadas con la solución adecuada (enzima de trippsina o Musin, mantener un tubo de cada uno para este propósito). Enjuague cuidadosamente las puntas entre las muestras para evitar la contaminación.</li>
</ol>4. Digestión de tejidos
<ol><li>Colocar el microtubo en una coctelera de 37oC durante 60 minutos, balanceándose a 1.000 rpm. NOTA: Tanto el tiempo de agitación como el tiempo de digestión son fundamentales para una disociación exitosa. La digestión más corta o inmóvil dará una baja disociación, probablemente porque la capa muscular externa y el líquido seminal viscoso interno protegen las células de la glándula accesoria de las peptidasas.</li>
	<li>Añadir 1 ml de SSM a temperatura ambiente para detener la digestión y proceder inmediatamente al paso 5.</li>
</ol>5. Disociación mecánica de las células
<ol><li>Usando una punta ancha redondeada de 1.000 l, premoja con SSM, transfiera la muestra a una placa de 24 pocillos. Monitor e fluorescencia gFP bajo el microscopio: la mayoría de las puntas de las glándulas deben verse intactas y unas pocas SC deben separarse.</li>
	<li>Usando una punta de pipeta estrecha redondeada generada en el paso 2.2.2, entuba hacia arriba y hacia abajo de 3 a 5 veces para interrumpir el tejido de la glándula accesoria. NOTA: Supervise la fluorescencia para asegurarse de que se han roto los parches de tejido grandes. Repita el paso 5.2 si este no es el caso.</li>
	<li>Usando una punta de pipeta redondeada muy estrecha (generada en el paso 2.2.2), pipetea hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces. NOTA: Solo las celdas individuales deben ser visibles después del paso 5.3. Se recomienda el uso de placas de 24 pocillos porque permiten una fácil supervisión del proceso. Cuando se procesaron algunas muestras y se dio un resultado satisfactorio (células secundarias de aspecto saludable perfectamente disociadas), los pasos de pipeteo se realizarán en el microtubo.</li>
	<li>Espere al menos 15 minutos para permitir que las células se asienten en la parte inferior del pozo y elimine el exceso de SSM para reducir el tiempo de clasificación. NOTA: Dejar que las células se acomoden resultó superior a métodos alternativos como la centrifugación, y permite una última inspección visual de las células justo antes de FACS.</li>
	<li>Pipet las células en un tubo limpio de 1,5 ml y la piscina de muestras idénticas (dos lotes de 20 machos para cada condición). Enjuague los pozos con SSM para recuperar las últimas células y encofrelas en el tubo (utilice un pequeño volumen).</li>
	<li>En microtubos de 1,5 ml, añada 300 ml de solución de lisis celular y 1 l de proteinasa K [50 g/L] (soluciones proporcionadas en el kit de purificación de ARN, ver Paso 7). Prepare dos tubos para cada muestra (uno para MCs y otro para SCs).</li>
</ol>6. FACS (Clasificación celular activada por fluorescencia)
<ol><li>Agregue el marcador de viabilidad a cada muestra que se va a ordenar unos minutos antes de la clasificación (0,3 mM Draq7). PRECAUCION: Draq7 debe manejarse con precaución.</li>
	<li>
Ordenar una población homogénea de células secundarias vivas (GFP-positivas, células Draq7-negativas). En otro microtubo, clasifique una población de células principales (células más pequeñas, GFP negativas, Draq7 negativas). Utilice la siguiente estrategia de gating FACS: NOTA: Ajuste la presión del clasificador de celdas a 25 PSI y pase las células a través de una boquilla de 100 m. La tasa de clasificación es de alrededor de 2.000 celdas/s.<ol>
<li>Excluya los desechos y seleccione el total de celdas en función del FSC-SSC(Figura 2E)para excluir los desechos.</li>
		<li>Excluya las células muertas. Emocione Draq7 con un láser de 640 nm y recoja la fluorescencia emitida con un filtro de paso de banda 795/70. Salida de celdas positivas de la puerta Draq7(Figura 2F).</li>
		<li>Elimine los dobletes usando un doble gating en SSC-H vs SSC-W y FSC-A vs FSC-H(Figura 2H). NOTA: Excluya los dobletes celulares rigurosamente usando doble gating, para reducir la contaminación de la célula principal.</li>
		<li>Ordene las células positivas de 550 GFP en un microtubo de 1,5 ml con tampón de lysis y Proteinase K. Esta población se considera células secundarias (SC, Figura 2G). Emocione GFP a 488 nm y recoja la fluorescencia emitida con un filtro de paso de banda 526/52.</li>
		<li>Ordenar 1.000 células GFP-negativas, homogéneas y de pequeño tamaño, en un microtubo de 1,5 ml con tampón de Lysis y Proteinase K. Esta población se considera células principales (MC, Figura 2G).</li>
		<li>Vórtice todas las muestras. NOTA: De 40 machos (40 x 80 SC a 3.200 células secundarias), se obtienen 600 a 800 células secundarias individuales vivas (alrededor del 20-25% de recuperación). Deje de clasificar alrededor de 550 SC y 1.000 MC para normalizar las muestras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Extracción de ARN
NOTA: Utilizamos Epicentre MasterPure RNA Purification Kit para la extracción de ARN, con las siguientes adaptaciones. Se pueden utilizar otros kits siempre y cuando el rendimiento sea lo suficientemente alto como para preparar una biblioteca para la secuenciación a partir de 500 celdas (2 NG RNA se utilizaron aquí).
<ol><li>Muestras de calor a 65oC durante 15 min y vórtice cada 5 min para completar la lisis celular.</li>
	<li>Colocar muestras en hielo durante 5 min. Siga las recomendaciones del fabricante para precipitaciones de ácidos nucleicos (partes "Precipitación de ácidos nucleicos totales" y "Eliminación del ADN contaminante de preparaciones totales de ácido nucleico").</li>
	<li>Suspenda el gránulo de ARN en 10 ml de tampón TE libre de RNase.</li>
	<li>Añadir inhibidor de la RNase (opcional).</li>
	<li>Almacene las muestras a -80 oC.</li>
</ol>8. Controles de calidad de la cantidad, calidad y especificidad del ARN
<ol><li>Estimar la calidad y concentración del ARN. Debido al pequeño volumen y la concentración, utilice chips de ARN 6000 Pico aquí. ARN de buena calidad se define como no degradado, visible como una línea de base baja con picos agudos correspondientes a arNM.</li>
	<li>
RT-qPCR para controlar la identidad de las células ordenadas
	<ol>
<li>Realice la transcripción inversa con 2 ng de RNA total usando hexamers aleatorios como imprimadores. Realice RT en ARN de célula sócitor secundario y ARN de célula principal. NOTA: los cDNAs se pueden diluir, acicalar y mantener congelados para su uso posterior.</li>
		<li>Realizar PCR cuantitativo en tiempo real utilizando pares de imprimación adecuados para cuantificar los genes de limpieza (alfa-tubulina, 18S rRNA), genes específicos de células secundarias (MSA, Rab19, Abd-B) y gen específico de células principales (péptido sexual).</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Secuenciación (Preparación de la Biblioteca de ADNc, Secuenciación y Análisis de Datos)
<ol><li>Utilice 2 ng de ARN totales para sintetizar cDNAs con imprimaciones políditas. Utilice la tecnología SMARTer para amplificarlos para la amplificación.</li>
	<li>Utilice un kit Nextera XT para preparar la biblioteca.</li>
	<li>Secuencia con múltiplexód, 100 nucleótidos de una sola lectura secuenciación (aunque 50 lecturas de nucleótidos son apropiados para la mayoría de los propósitos) para producir alrededor de 30 millones de lecturas para cada muestra.</li>
</ol>10. Análisis de datos
<ol><li>Ejecute FastQC.</li>
	<li>Utilice el alineador STAR para asignar las lecturas en el genoma de referencia UCSC dm6 Drosophila y generar archivos .bam. Utilice Integrative Genomics Viewer (IGV) para visualizar las lecturas en el navegador del genoma.</li>
	<li>Use HTSeq para realizar recuentos de genes.</li>
	<li>Utilice el método Media recortada de valores M (TMM) para normalizar los recuentos de genes22. Utilice edgeR para realizar análisis estadísticos de la expresión diferencial, las gráficas MA y el PCA.</li>
	<li>Para el análisis y las estadísticas de la expresión génica, utilice el Modelo Lineal General, la prueba F cuasi-probable con La Tasa de Detección Falsa (FDR) y la Corrección de Benjamini & Hochberg (BH).</li>
</ol>

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<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+conditions+sensed+by+the+reproductive+organ+during+development+optimize+male+fecundity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila.</a> Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).</li>
<li>Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-based+isolation+and+RNA+extraction+of+Secondary+Cells+from+the+Drosophila+male+Accessory+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland.</a> bioRxiv. , 630335(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna divulgación.

Los métodos para la disociación celular del tejido Drosophila como los discos imaginativos ya se describen23. Nuestros intentos de simplemente utilizar estos procedimientos en las glándulas accesorias fracasaron, animándonos a desarrollar este nuevo protocolo. La digestión de la proteasa y la trituración mecánica fueron pasos críticos que tenemos problemas para el éxito del procedimiento, y por lo tanto colocamos muchas notas en las secciones 2 a 5 para ayudar a los experimentadores a obt...

Los órganos se componen de múltiples tipos de células, cada una con funciones discretas y a veces expresando conjuntos muy diferentes de genes. Para obtener una comprensión precisa de cómo funciona un órgano, a menudo es fundamental estudiar cada tipo de célula distinta que compone este órgano. Uno de los métodos principales utilizados para explorar la posible función es el análisis del transcriptoma. Este potente método proporciona una instantánea de la expresión génica en una célula, para revelar los procesos y vías activas. Sin embargo, este tipo de análisis es a menudo difícil para las poblaciones de células raras que deben ser purificadas a partir de células vecinas mucho más abundantes. Por ejemplo, la glándula accesoria masculina Drosophila es un órgano compuesto principalmente de dos tipos de células secretoras. Como el más raro de los dos tipos de células comprende sólo el 4% de las células de esta glándula, el uso de un análisis de transcriptoma específico de tipo celular no se había utilizado para ayudar a determinar la función de estas células.
Las glándulas accesorias (AG) son órganos del tracto reproductivo masculino en insectos. Son responsables de la producción de la mayoría de las proteínas del líquido seminal (proteínas de líquido seminal (SFP) y proteínas de la glándula accesoria (ACL)). Algunos de estos SFP son conocidos por inducir las respuestas fisiológicas y conductuales en las hembras apareadas, comúnmente llamada la respuesta post-acoplamiento (PMR). Algunos de los PMR incluyen: un aumento de la ovulación y la tasa de puesta de óvulos, el almacenamiento y liberación de espermatozoides, un cambio en la dieta femenina, y una disminución en la receptividad femenina a los varones de cortejo secundario1,2. Dado que los insectos afectan a muchas de las principales cuestiones sociales, desde la salud humana (como vectores de enfermedades mortales) hasta la agricultura (los insectos pueden ser plagas, pero son críticos para la polinización y la calidad del suelo), la comprensión de la reproducción de insectos es un área importante de investigación. El estudio de los AG y los ACP se ha avanzado significativamente con el organismo modelo Drosophila melanogaster. Estos estudios han puesto de relieve el papel de los AG y algunas de las proteínas individuales que producen en la creación del PMR, impactando el trabajo en otras especies como el vector de la enfermedad Aedes aegypti3,4,y otros insectos1 ,5. Además, como los aGs secretan los componentes del fluido seminal1,6 son a menudo considerados como el análogo funcional de la glándula prostática de mamíferos y la vesícula seminal. Esta similitud de función combinada con similitudes moleculares entre los dos tipos de tejido, han hecho de los AG un modelo para la glándula prostática en moscas7.
Dentro del macho Drosophila, hay dos lóbulos de glándulas accesorias. Cada lóbulo puede ser visto como una estructura similar a un saco compuesto por una monocapa de células secretoras que rodean un lumen central, y envuelto por músculos lisos. Como se mencionó anteriormente, hay dos tipos de células secretoras morfológica, de desarrollo y funcionalmente distintas que componen esta glándula: las células principales en forma poligonal (que componen el 96% de las células), y las células secundarias redondas (SC) más grandes (que componen el 4% restante de las células, o alrededor de 40 células por lóbulo). Se ha demostrado que ambos tipos de celda producen conjuntos distintos de ACL para inducir y mantener el PMR. La mayoría de los datos obtenidos hasta la fecha destacan el papel de una sola proteína en la activación de la mayoría de los comportamientos característicos de la PMR. Esta proteína, el péptido sexual, es un pequeño péptido de 36 aminoácidos que es secretado por las células principales8,9,10. Aunque el péptido sexual parece desempeñar un papel importante en el PMR, otros ACP, producidos por las células principales y secundarias, también han demostrado afectar a varios aspectos de la PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Por ejemplo, sobre la base de nuestros conocimientos actuales, los SC, a través de las proteínas que producen, parecen ser necesarios para la perpetuación de la señalización SP después del primer día18.
Dada la rareza de los SC (sólo 80 células por macho), todo nuestro conocimiento sobre estas células y las proteínas que producen proviene de la genética y los enfoques candidatos. Hasta ahora, sólo se ha demostrado que una lista relativamente pequeña de genes es específica de SC. Esta lista incluye la proteína homeodominio Proventriculus defectuoso (Dve)19, el lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 y 1921, CG1656 y CG1757511, 15,21 y el factor de transcripción homeobox Abdominal-B (Abd-B)18. Anteriormente, hemos demostrado que un mutante deficiente tanto para la expresión de Abd-B como para el LncRNA MSA en células secundarias(iab-6cocuD1 mutante) acorta la longitud de la PMR de 10 días a solo un día12 , 18 , 20. Este fenotipo parece ser causado por el almacenamiento inadecuado de SP en el tracto reproductivo femenino12,18,20. A nivel celular, las células secundarias de este mutante muestran morfología anormal, perdiendo sus características estructuras similares a la vacuola18,20,21. Usando esta línea mutante, previamente intentamos identificar los genes involucrados en la función SC comparando los perfiles transcripcionales de los aGenteros de tipo salvaje o glándulas accesorias mutantes12. Además, otros laboratorios mostraron que el número de SC, la morfología y el contenido vacuolar dependen de la dieta masculina, el estado de apareamiento y la edad21,25,26.
Aunque se lograron progresos positivos utilizando estos enfoques, un transcriptoma completo de SC dista mucho de lograrse. La rareza de estas células en este órgano hizo difícil progresar aún más incluso desde células de tipo salvaje. Para probar la expresión génica, los cambios en estas células después de estímulos ambientales particulares serían aún más difíciles. Por lo tanto, se necesitaba un método para aislar y purificar el ARN SC que fuera lo suficientemente rápido y simple como para funcionar bajo diferentes orígenes genéticos y condiciones ambientales.
Tanto los genes Abd-B como MSA requieren un potenciador específico de 1,1 kb del Complejo Drosophila Bithorax (llamado potenciador D1) para su expresión en SCs18,20. Este potenciador se ha utilizado anteriormente para crear un controlador GAL4 que, cuando se asocia con un UAS-GFP,es capaz de impulsar la expresión GFP fuerte específicamente en SCs. Por lo tanto, usamos esta línea como base para un protocolo FACS para aislar estas células del tipo salvaje y del iab-6cocuD1 AG). Como los SC mutantes iab-6cocuD1 muestran una morfología celular diferente, mostramos que este protocolo se puede utilizar para aislar las células para la determinación de su transcriptoma de este tipo de célula rara en condiciones muy diferentes.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>VWR</td><td>734-2325</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio binocular para disección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prismático con fuente de luz para GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Draq7 0,3</td><td>mM BioStatus</td><td>DR71000</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos de plástico 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td> Pinza <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>disección fina</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>inactivado por calor antes de su uso</td></tr><tr><td>Platos de vidrio para disección</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubitera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II Sistema de transcripción inversa</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación de ARN MasterPure</td><td>Epicentre</td><td>MCR85102</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT kit</td><td>illumina</td><td></td><td><a href="https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html">https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html</a></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td></td><td></td><td>50U/mL stock</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>casera Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones</td><td></td><td></td><td></td>PolydT</tr><tr><td>Cebadores de hexámero</td><td></td><td></td><td></td>aleatorio</tr><tr><td>Kit RNA 6000 Pico</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medio</td><td>Gibco</td><td>21720-001</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer kit de síntesis de ADNc</td><td>Takara</td><td></td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits">https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits</a></td></tr><tr><td>SYBR select Master mix para CFX</td><td>aplicado biosystems</td><td>4472942</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Hangzhou Allsheng instrumentos</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 1250 &mu; L punta graduada</td><td>Starlab</td><td>S1161-1820</td><td></td></tr><tr><td>Tipone 200 &mu; L punta biselada</td><td>Starlab</td><td>S1161-1800</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzima</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo basado en facs para aislar el arn de las células secundarias de drosophila male accessory glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Para entender la función de un órgano, a menudo es útil entender el papel de sus poblaciones celulares constituyentes. Desafortunadamente, la rareza de las poblaciones celulares individuales a menudo hace que sea difícil obtener suficiente material para estudios moleculares. Por ejemplo, la glándula accesoria del sistema reproductor masculino Drosophila contiene dos tipos distintos de células secretoras. Las células principales conforman el 96% de las células secretoras de la glándula, mientras que las células secundarias (SC) conforman el 4% restante de las células (alrededor de 80 células por macho). Aunque ambos tipos de células producen componentes importantes del líquido seminal, sólo unos pocos genes son conocidos por ser específicos de los SC. La rareza de los SC ha obstaculizado hasta ahora el estudio del análisis transcriptomico de este importante tipo de célula. Aquí, se presenta un método que permite la purificación de SC s c. para la extracción y secuenciación de ARN. El protocolo consiste primero en disección de glándulas de moscas que expresan un reportero de PfP específico de SC y luego sometiendo estas glándulas a digestión proteasa y disociación mecánica para obtener células individuales. Siguiendo estos pasos, las células individuales, vivas, marcadas con GFP se clasifican utilizando un clasificador de células activado sfluorescentes (FACS) para la purificación del ARN. Este procedimiento produce ARN específicos de SC de 40 machos por condición para la secuenciación de RT-qPCR y/o ARN aguas abajo en el transcurso de un día. La rapidez y simplicidad del procedimiento permite determinar en un corto período de tiempo los transcriptomas de muchas moscas diferentes, de diferentes genotipos o condiciones ambientales.

El protocolo presentado aquí permite a un experimentador aislar las células secundarias de las glándulas accesorias masculinas Drosophila y extraer su ARN en el transcurso de un solo día(Figura 1).
Usamos la construcción Abd-B-GAL4 18 para etiquetar las células secundarias (SC) pero no las células principales (MC) con GFP(Figura 2</stron...

Aquí, presentamos un protocolo para disociar y ordenar una población celular específica de las glándulas accesorias masculinas Drosophila (células secundarias) para la secuenciación de ARN y RT-qPCR. El aislamiento celular se logra a través de la purificación FACS de células secundarias que expresan GFP después de un proceso de disociación de múltiples pasos que requiere disección, digestión de proteasas y dispersión mecánica.

Un protocolo basado en FACS para aislar el ARN de las células secundarias de Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Este método permite un análisis transcriptómico de una población celular rara de la glándula accesoria masculina Drosophila, llamada células secundarias, y descubre genes que las hacen críticas para el éxito reproductivo. En el transcurso de un día, esta técnica permite la clasificación de células secundarias de diferentes genotipos y la extracción del ARN total para la secuenciación posterior de qPCR o ARN. A veces los proyectos están limitados por la rareza del material inicial.Este método puede proporcionar la base para otros grupos que enfrentan el desafío de trabajar con una población de células raras. Debido a que el procedimiento necesita acumular 40 glándulas, es importante practicar las disecciones. Preparar las puntas caseras de las pipetas también es importante, por lo que debe visualizarlo en el vídeo cómo hacerlo y prepararse con antelación.Antes de comenzar el procedimiento, corte y enrólla las puntas de 200 microlitros para manipular las glándulas y pase la abertura de la punta de múltiples puntas de 1.000 microlitros cerca de una llama durante menos de un segundo para estrechar las aberturas. A continuación, ordene las puntas modificadas de más estrechas a más anchas en función de su velocidad de aspiración. Para la disección de la glándula accesoria, coloque 20 a 25 Drosophila macho en una placa de vidrio sobre hielo, y use fórceps y un microscopio de disección para eliminar el tracto reproductivo de una mosca masculina.Limpie el par de glándulas accesorias de todos los demás tejidos, incluidos los testículos y la bombilla eyaculatoria, y transfiera las glándulas accesorias a una placa de vidrio que contenga un medio suplementado con suero a temperatura ambiente. Cuando se hayan recogido 20 pares de glándulas accesorias, lave las glándulas en un plato de PBS durante uno a dos minutos a temperatura ambiente. Al final del lavado, transfiera las glándulas a una solución de disociación recién preparada y utilice fórceps afilados bajo un microscopio diseccionado para pellizcar firmemente el medio de un lóbulo glandular.Usando un segundo par de fórceps, corte el tejido con la punta afilada para separar la región proximal de la glándula accesoria y el conducto eyaculatorio de la porción de la glándula que contiene las células secundarias. Corte las glándulas para que las peptidasas puedan llegar a las células que de otro modo están protegidas por la capa muscular externa y por el líquido seminal viscoso en el lumen de la glándula. A continuación, utilice una punta de pipeta pre-húmeda, redondeada contra llamas, ancha y de 200 microlitros para transferir las glándulas a un tubo de 1,5 mililitros.Para la digestión de tejidos, coloque el tubo en una coctelera celsius de 37 grados durante 60 minutos a 1.000 rotaciones por minuto. Al final de la incubación, detenga la digestión con un mililitro de medio suplementado con suero, y utilice una punta de pipeta pre-húmeda, redondeada a la llama, ancha, de 1.000 microlitrólitro para transferir las muestras a una placa de 24 pocillos. Compruebe las células para su expresión de GFP bajo un microscopio fluorescente.La mayoría de las puntas de las glándulas deben verse intactas, y algunas células secundarias deben separarse. Utilice una punta de pipeta redondeada, estrecha, de 1.000 microlitrotro para triturar suavemente las células de tres a cinco veces para interrumpir el tejido de la glándula accesorio. Luego, utilice una punta de pipeta muy estrecha, redondeada, de 1.000 microlitros de una a dos veces para individualizar las células.Deje que las células se asienten durante 15 minutos. Confirme que las células aparecen sanas bajo el microscopio y elimine el exceso de medio. Luego, transfiera las células a un nuevo tubo de 1,5 mililitros, y enjuague los pozos con un medio fresco para recuperar las células restantes.La construcción Abd-B-GAL4 se puede utilizar en estos experimentos para etiquetar celdas secundarias pero no principales con GFP. En este estudio, ambos tipos de células se clasificaron de glándulas accesorias mutantes de tipo salvaje e iab-6cocuD1. Este mutante D1 carece de la expresión de transcripciones Abd-B y MSA, que afectan el desarrollo, morfología y función de las células secundarias.Después de la disociación celular, FACS se utiliza para seleccionar celdas vivas basadas en DRAQ7, y el nivel de fluorescencia GFP se utiliza para aislar las células secundarias y las células principales. El ARN se extrae de cada población celular y se ajusta a dos nanogramos por muestra para la posterior RT-qPCR y la secuenciación. La cuantificación de la expresión de genes específicos mediante PCR cuantitativo en tiempo real en extractos de células principales y secundarias de tipo salvaje revela que los genes celulares secundarios Rab19 y MSA se detectan únicamente a partir de extractos celulares secundarios, mientras que el péptido sexual del gen de células principal sólo se detecta a partir de muestras de células principales.El análisis de componentes principales en los datos de secuenciación de ARN de tres réplicas de tipo salvaje y tres mutantes revela que el tipo comodín replica ambos clústeres juntos entre sí y lejos de las muestras mutantes. Visualizar lecturas alineadas con genes particulares muestra que los genes de limpieza como la actina 5C, y los genes secundarios específicos de las células Rab19 y Dve se expresan en ambos genotipos. Para la MSA, sin embargo, la fuerte expresión del gen observado en las moscas de tipo salvaje se pierde en las cepas mutantes.Obtener suficientes células secundarias disociadas vivas es importante para un procedimiento exitoso. Por lo tanto, verifique el protocolo de disección y disociación en experimentos a pequeña escala. Este método permite la clasificación de ambos tipos de células de glándula accesoria de un pequeño número de moscas, lo que permite el estudio de cómo esas células reaccionan transcripcionalmente a múltiples condiciones genéticas o ambientales.Se sabe que el éxito reproductivo masculino se ve afectado por muchas cosas, como el genotipo, la edad y el estado de apareamiento. La facilidad de este método debe permitirnos investigar cómo estos factores afectan la transcripción de la glándula accesoria.

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