Name: Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Aprende el método de criopulverización para procesar patas de ratón en modelos de artritis inducida por colágeno. Esta técnica mejora la extracción de ARN y proteínas de alta calidad para análisis moleculares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a Edith Janssen la revisión crítica del manuscrito y a Navin Rao y Jennifer Towne por su apoyo a la publicación de este manuscrito.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Janssen I+D.
1. Método de pulverización a base de molino de congelador criogénico
<ol><li>Al finalizar el estudio de la CIA, sacrificar ratones con 1.5% de isoflurano seguido de dislocación cervical.</li>
	<li>El día del procesamiento de tejidos, enfríe previamente todos los instrumentos (espátulas, viales de molienda, etc.) sobre hielo seco durante un mínimo de 10 minutos.</li>
	<li>Corte las patas traseras con una tijera en la línea de piel como se muestra en la Figura 1A.</li>
	<li>Transfiera cada pata en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, congele inmediatamente la congelación en líquido y almacene las patas congeladas a -80 oC. No mantenga las muestras congeladas durante más de una semana.</li>
	<li>Llene el molino congelador con nitrógeno líquido como se muestra en la Figura 1B y déjelo equilibrar durante al menos 10 minutos.</li>
	<li>Conservar la muestra sin procesar sobre hielo seco y evitar ciclos de congelación-descongelación.</li>
	<li>Transfiera una pata trasera al vial de molienda de policarbonato grande pre-enfriado con un tapón de acero inferior, inserte el impactador de acero preenfriado y cierre el vial de molienda de policarbonato con el tapón de acero superior pre-enfriado(Figura 1C).</li>
	<li>Transfiera grandes viales de molienda de policarbonato con las muestras al molino congelador precargados de líquido y cierre la tapa con el cierre de goma que se encuentra en la parte delantera del instrumento.</li>
	<li>Deje que las muestras se enfríen en nitrógeno líquido durante 1 minuto.</li>
	<li>Ajuste el molino congelador al programa de 1 minuto con 10 ciclos por segundo y pulse el botón de inicio. Espere a que el molino congelador complete su ciclo. NOTA: La máquina hace un sonido de tambor a medida que el impactador de acero se mueve hacia adelante y hacia atrás. Use tapones para los oídos para evitar la pérdida auditiva.</li>
	<li>Abra la tapa del molino congelador, saque el gran vial de molienda de policarbonato y colóquelo en un extractor como se muestra en la Figura 1D. Retire el tapón de acero superior colocando presión hacia abajo sobre el mango negro hasta que el tapón de acero se deslice fuera del tubo de policarbonato.</li>
	<li>Transfiera el vial de molienda de policarbonato grande abierto al hielo seco. Retire el impactador de acero con fórceps pre-enfriados.</li>
	<li>Transfiera el polvo congelado al tubo cónico preenfriado de 50 ml.</li>
	<li>Peso 30-50 mg de polvo congelado en un tubo de microcentrífuga congelado tarado de 1,5 ml para extracción de ARN y 100-200 mg de polvo congelado para la extracción de proteínas. NOTA: El polvo congelado debe parecerse a arena fina de color blanco o rosa claro como se muestra en la Figura 1E.</li>
	<li>Almacene las muestras pulverizadas a -80 oC y proceda a los aislamientos de ARN y proteínas en un plazo de 24 h.</li>
</ol>2. Extracción de ARN
<ol><li>Añadir 10 ml de mercaptoetanol (-ME) por 1 ml de búfer RLT.</li>
	<li>Calcular el volumen de tampón RLT correspondiente a una proporción de 23,3 ml/mg de tejido y añadir el volumen adecuado de tampón RLT con el tubo con polvo congelado. Esta relación se determinó empíricamente para ser ideal para las patas de ratón.</li>
	<li>Vortex la muestra a 3.000 RPM durante 10 s.</li>
	<li>Mezcle bien pipeteando 10 veces vigorosamente con un pipeteador de 1 ml.</li>
	<li>Vortex la muestra de nuevo a 3.000 RPM para 20 s.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 13.000 x g durante 2 min.</li>
	<li>Transfiera 700 l de los supernatantes a un tubo nuevo y agregue 700 ml de etanol al 70%. NOTA: Si <700 l está en el tubo, es aceptable proceder, todavía añadiendo un volumen equivalente de 70% de etanol.</li>
	<li>Cargue 700 l de la muestra en una columna de purificación de ARN.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 10.000 x g durante 30 s.</li>
	<li>Deseche el flujo y cargue la parte restante de la muestra en la columna RNeasy.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 10.000 x g durante 30 s.</li>
	<li>Deseche el flujo y lave la columna añadiendo 700 ml de tampón de RW1 con una centrifugación de 10.000 x g durante 30 s. Si se realiza la opción de digestión DNASE, se añaden 350 ml de RW1 antes del tratamiento con DNASE.  Y se añaden 350 ol de RW1 adicionales después del tratamiento con DNASE.</li>
	<li>Opcional) Realice un paso de digestión DNase siga las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Lave el tubo dos veces añadiendo 500 ml de tampón de RPE seguido de centrifugación a 10.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo cada vez.</li>
	<li>Seque la columna por centrifugación a 10.000 x g durante 2 min.</li>
	<li>Elute el ARN añadiendo agua de 50 l con centrifugación a 10.000 x g durante 2 min. Recoja el flujo y transfiera a un nuevo tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Determinar la cantidad de ARN utilizando el método de elección del investigador y almacenar a -80 oC antes de un análisis posterior.</li>
</ol>3. Extracción de proteínas
<ol><li>Diluir la solución de stock de lisis celular 10x en solución de stock de lisis de 1x célula utilizando agua de grado de cultivo celular.</li>
	<li>Reconstituir el conjunto de cócteles inhibidor de proteasa I con 1 ml de agua para hacer un stock inhibidor de proteasa 100x.</li>
	<li>Añadir 100 l de inhibidor de la proteasa a 9,9 ml de lisis celular 1x para hacer una solución de stock final 1x.</li>
	<li>Añadir 4 ml de tampón de lisis celular en frío 1x por mg de polvo de tejido (p. ej., 800 l de tampón de lisis a 200 mg de polvo tisular).</li>
	<li>Añadir una perla de acero inoxidable de 5 mm al tubo.</li>
	<li>Vortex el tubo a 3.000 RPM durante 60 s. Transfiera el tubo al hielo húmedo y continúe con la siguiente muestra.</li>
	<li>Coloque todos los tubos de muestra en una caja y agite la caja centrífuga en un balancín a 1.000 RPM, 4 oC durante 1 h. NOTA: Los investigadores pueden encontrar que la colocación de la caja vertical puede facilitar una mejor mezcla con el cordón.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 10.000 x g y 4oC durante 15 min.</li>
	<li>Transfiera los sobrenatodores a un tubo nuevo y evite la capa de grasa en la parte superior.</li>
	<li>Determinar la concentración total de proteínas. Las diluciones de 10 a 30 veces de lisato proteico son ideales para una prueba de BCA.</li>
	<li>Alícuota la muestra en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdela a -80 oC antes de realizar un análisis posterior.</li>
</ol>

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li>
<li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).</li>
<li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis%3A+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li>
<li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+factors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focus+on+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li>
<li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA%2F1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha%2Fbeta%2C+and+IL-1Ra%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li>
<li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li>
<li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li>
</ol>

Los autores BJ, SH, ML, RM, ML, TO y FS son empleados de Janssen Research & Development Inc y son accionistas de la empresa matriz, Johnson & Johnson, Inc.

Aunque existe una sólida lógica científica para evaluar las vías moleculares en los tejidos sinoviales, muchos informes sobre el perfil inmune del modelo de la CIA murina se centraron en la sangre periférica, mientras que los datos de análisis de proteínas y ARN de las patas inflamadas son bastante limitados. Hay varias razones posibles para este sesgo: las articulaciones del tobillo murino no son más grandes que 2 cm; las zonas afectadas consisten en piel, hueso y tejidos conectivos que a menudo son difíciles de homogen...

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistémica crónica con sinovitis simétrica persistente en las articulaciones y afectación articular adicional de órganos como la piel, el corazón, los pulmones y los ojos1. Aunque las manifestaciones sistémicas de la respuesta inmunitaria son evidentes en pacientes humanos, una de las señas de identidad de la patología de la AR es la infiltración de células inmunitarias en el tejido sinovial y la proliferación de células fibroblastos sinoviales2.
Al igual que la AR humana, el modelo de artritis inducida por colágeno de ratón (CIA) provoca una fuerte inflamación del tejido con respuestas inmunitarias activas en tejidos sinoviales y compartimentos sistémicos. La susceptibilidad de diferentes cepas de ratón a los enlaces del modelo CIA a los principales haplotipos del Complejo histocompatibilidad (MHC) y las interacciones específicas del antígeno T y de la célula B3,4. Además, muchas vías patógenas en la AR humana, incluyendo la producción de autoanticuerpos, deposición del complejo inmune, activación de células mieloides, manifestaciones poliarticulares y formación de pannus con infiltración inmune sinovial, también son evidentes en este modelo 5,6. Los investigadores han empleado este modelo bien establecido de la CIA para investigar los efectos de los tratamientos antiinflamatorios de citoquinas7. Muchos productos biológicos aprobados para enfermedades autoinmunes o inflamatorias, tales como anti-TNF y anti-IL-6, se encuentran para ser eficaces en el modelo de la CIA8,9.
La elaboración de perfiles de las interacciones del sistema inmunitario en el tejido sinovial es crucial para dilucidar los mecanismos moleculares asociados con la patogénesis de la AR. En el entorno clínico humano, una práctica común es realizar biopsias sinoviales de aguja bajo la guía de imágenes por ultrasonido. En los entornos preclínicos, la arquitectura más pequeña de las articulaciones murinas hace que los procedimientos de biopsia sean mucho más difíciles si no imposibles. Recientemente, demostramos la utilización del modelo de la CIA murina para evaluar combinaciones de fármacos para impactar puntos finales dispares y resolver enfermedades en un enfoque combinatorio10. Se empleó un método de pulverización a base de molino de congelador criogénico para procesar patas murinos inflamadas en polvos finos homogéneos y estableció procesos aguas abajo para extraer ARN y proteínas. Este método protege el ARN y las proteínas de los procesos de degrativos enzimáticos y químicos y nos permite aplicar múltiples métodos analíticos a una sola fuente de muestra homogeneizada.

<table><tbody><tr><td>Perla de acero inoxidable de 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Agente reductor de muestras que inhibe las enzimas ARNASA</td></tr><tr><td>Kit de bioanalizador</td><td>Agilent</td><td>5067-1511 Kit de calificación de</td><td>ARN</td></tr><tr><td>b-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>25-055-CI</td><td></td></tr><tr><td>Agua Solución madre de lisis celular</td><td>Señalización celular</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf</td> Tubos de <td>22363204</td><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Caja centrífuga de tubo Eppendorf</td><td>Nalgene</td><td>5055</td><td>Caja para sujetar tubos Eppendorf en disposición de tubo horizontal</td></tr><tr><td>Elastón Everlast 247 Balancín de velocidad variable</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td></td></tr><tr><td>Molino congelador</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6875</td><td>Congelador/Molino para el procesamiento de patas en polvo</td></tr><tr><td>pulverizado Vial de molienda</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6801</td><td>Frasco de policarbonato para el procesamiento de patas en polvo pulverizado</td></tr><tr><td>Kit Pierce BCA Pierce</td><td></td><td>23225</td><td>Kit para la cuantificación de proteínas totales</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Set de cócteles 1</td><td>Calbiochem</td><td>539131</td><td>Inhibidores de</td></tr> <tr><td>la proteasaKit de proteínas BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Quantigene Kit</td><td>Thermofisher</td><td>QP1013</td><td>Kit de análisis de ADNb</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>refrigerada Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Tampón de centrifugación</td></tr><tr><td>RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Tampón de extracción de ARN</td></tr><tr><td>Mini kit RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>que incluye columna RNeasy, tampón RLT y tampón RW1</td></tr><tr><td></td><td>Agitador Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td> Espátula <td>basculante/agitadora</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10806-412</td><td>Espátula para la transferencia de polvo</td></tr><tr><td>Cordón de acero inoxidable</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>Perla para mezclar durante la extracción de proteínas</td></tr><tr><td>Extractor de tubo</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6884</td><td>Extractor para quitar la parte superior del vial de molienda</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>Mezcla de muestras</td></tr></tbody></table>

un protocolo de cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

La elaboración de perfiles de cambios moleculares en los tejidos locales es crucial para comprender los mecanismos de acción de los candidatos terapéuticos in vivo. En el campo de la investigación de la artritis, muchos estudios se centran en las articulaciones inflamadas que se componen de una mezcla compleja de hueso, cartílago, músculo, células estromales y células inmunitarias. Aquí, establecimos un método mecánico fiable y robusto para interrumpir las patas de ratón inflamadas en muestras pulverizadas homogéneas en un entorno croogénicamente controlado. Se procesaron lelíforos de proteínas y ARN para permitir las variables proteómicas y transcripcionales y la caracterización molecular de las vías de enfermedad relevantes en el tejido local.

Aquí, mostramos una visualización representativa de la imagen de gel de ARN extraído de las patas delanteras de los ratones de la CIA en la Figura 2A. El ARNm 28S y la banda rRNA 18S indican que todas las muestras tienen una cantidad suficiente de ARN intacto. A continuación, mostramos una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones totales de proteínas basadas en el análisis de proteína BCA en la Figura 2...

Se desarrolló un método de pulverización criogénica para procesar patas murinas utilizando un molino congelador de nitrógeno líquido para mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con Respuestas.

Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

La evaluación de perfiles moleculares en tejidos locales es un paso crítico para comprender el mecanismo de acción de los productos farmacéuticos activos, ya que se evalúan en modelos preclínicos relevantes para la enfermedad. En el campo de la investigación de la artritis, el entorno de tejido local de interés es las pequeñas articulaciones que soportan peso que se componen de una mezcla compleja de hueso, cartílago, músculo, y las células inmunitarias. Aquí describimos un método robusto confiable para la interrupción mecánica y / o pulverización de este entorno de tejido complejo en un entorno controlado criogénicamente.Este método se puede utilizar para generar esfuerzos de perfilado proteómico y transcripcional aguas abajo para establecer firmas moleculares de la enfermedad a partir de una sola fuente de muestra uniforme. Este método genera un polvo homogéneo a diferencia de muchas otras técnicas antiguas. Además, el antiguo procedimiento de aislamiento de temperatura permite el aislamiento de ARN de alta calidad.Este método se puede utilizar para generar perfiles proteómicos y transcripcionales posteriores que permitan la caracterización molecular de las vías de interés de la enfermedad relevantes. Este método puede proporcionar información sobre cualquier campo de investigación que esté derivando firmas moleculares de los tejidos. El método podría extenderse a cualquier sistema de tejido complejo que tenga componentes densos y difíciles de disociar.Aunque no hemos evaluado hasta este punto, podríamos ver una posible aplicación a tejidos de cartílago densos como orejas o huesos. La naturaleza crítica del tiempo de transferir el polvo a tubos para el pesaje es algo que requiere práctica. Si se toma demasiado tiempo, el polvo comenzará a descongelarse y se volverá amorfo.Es importante limitar el número de muestras a 10 a 15 hasta que se sienta cómodo con el procedimiento. El día del procesamiento del tejido, precanjería todos los instrumentos necesarios sobre hielo seco durante un mínimo de 10 minutos. Use guantes térmicos para evitar ser dañados por el frío extremo.A continuación, transfiera cada una de las patas de ratón preparadas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros separado y congele inmediatamente en nitrógeno líquido. Almacene las patas congeladas en 80 grados Centígrados negativos. Cuando esté listo para continuar, llene un molino congelador con nitrógeno líquido y déjelo equilibrar durante al menos 10 minutos.Coloque la muestra sin procesar sobre hielo seco y manténgala allí para evitar ciclos de congelación/descongelación. A continuación, transfiera una pata trasera a un vial de molienda de policarbonato grande pre-refrigerado con un tapón de acero inferior. Inserte el impactador de acero preenfriado y cierre el vial de molienda de policarbonato con el tapón de acero superior preenfriado.Transfiera los viales de molienda de policarbonato grandes con las muestras al molino del congelador precarido y cierre la tapa con el cierre de goma que se encuentra en la parte delantera del instrumento. Deje que las muestras se enfríen en el nitrógeno líquido durante un minuto. A continuación, ajuste el molino del congelador al programa de un minuto con 10 ciclos por segundo.Pulse el botón de correr y espere a que el molino del congelador complete su ciclo. Después de esto, abra la tapa del molino del congelador y saque el vial de molienda de policarbonato grande. Coloque el vial de molienda en un extractor y retire el tapón de acero superior colocando presión hacia abajo sobre el mango negro hasta que el tapón de acero se deslice fuera del tubo de policarbonato.Transfiera el vial de molienda abierto al hielo seco y utilice fórceps preenfriados para eliminar el impactador de acero. Transfiera el polvo congelado a un tubo cónico pre-refrigerado de 50 mililitros. Pesar entre 30 y 50 miligramos de polvo congelado en un tubo de microcentrífuga estratificada de 1,5 mililitros para la extracción de ARN y entre 100 y 200 miligramos para la extracción de proteínas.Almacene las muestras pulverizadas a 80 grados Celsius negativos y proceda a los aislamientos de ARN y proteínas en un plazo de 24 horas. Primero, agregue 10 microlitros de beta-mercaptoetanol por cada mililitro de tampón RLT. Calcular el volumen de tampón RLT correspondiente a una proporción de 23,3 mililitros por miligramo de tejido y añadir el volumen adecuado de tampón RLT con beta-mercaptoetanol al tubo con polvo congelado.Vórtice la muestra a 3.000 RPM durante 10 segundos. Utilice una pipeta de un mililitro para pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente 10 veces y vórtice la muestra de nuevo a 3.000 RPM durante 20 segundos. Centrifugar a 13.000 g durante dos minutos y transferir 700 microlitros del sobrenadante a un tubo fresco.Agregue 700 microlitros de 70% de etanol a este tubo y cargue 700 microlitros de la muestra en una columna de purificación de ARN. Centrifugar el tubo a una velocidad de al menos 10.000 g durante 30 segundos. Deseche el flujo y cargue la parte restante de la muestra en la columna RNeasy y centrifuga el tubo de nuevo a una velocidad de al menos 10.000 g durante 30 segundos.Deseche el flujo y lave la columna añadiendo 700 microlitros de tampón RW1 y centrifugando al menos la velocidad de 10.000 veces g durante 30 segundos. Si se realiza la opción DNAse digestión, se añaden 350 microlitros de RW1 antes del tratamiento con DNAse. Y después del tratamiento con DNAse, se añaden 350 microlitros adicionales de RW1.A continuación, lave la columna dos veces añadiendo 500 microlitros de tampón de RPE y centrífuga a una velocidad de al menos 10.000 veces g durante 30 segundos asegurándose de descartar el flujo a través cada vez. Después de esto, seque la columna centrifugando a una velocidad de al menos 10.000 veces g durante dos minutos. Eluda el ARN añadiendo 50 microlitros de agua y centrifugando a una velocidad de al menos 10.000 veces g durante dos minutos.Recoja el flujo y transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Determinar la cantidad de ARN utilizando el método de elección del investigador y almacenar en negativo 80 grados Celsius antes de un análisis posterior. Diluir la solución de lysis de células 10X a solución de lysis celular 1X con agua de grado de cultivo celular.Reconstituir el conjunto de cócteles inhibidores de la proteasa uno con un mililitro de agua para hacer un stock inhibidor de la proteasa 100X. Añadir 100 mililitros de inhibidor de la proteasa a 9,9 mililitros de tampón de lisis de células 1X para obtener una solución final de 1X en stock. Agregue cuatro microlitros de tampón de lysis de células heladas por cada miligramo de polvo de tejido y agregue un cordón de acero inoxidable de cinco milímetros al tubo.Vórtice el tubo a 3.000 RPM durante 60 segundos. Transfiera el tubo al hielo húmedo y continúe con la siguiente muestra. Además, los investigadores pueden encontrar que la colocación de la caja vertical puede facilitar una mejor mezcla con el cordón.Después de una hora, centrifugar los tubos a 10.000 veces g y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Transfiera los sobrenadantes a un tubo fresco asegurándose de evitar la capa de grasa en la parte superior. Determinar la concentración total de proteínas.Aliquot cada muestra en 1,5 mililitros de microcentrífos de microcentríquel y almacenarlos en 80 grados Celsius negativos hasta que esté listo para realizar análisis posteriores. En este estudio, se utiliza un método de pulverización criogénica para procesar las patas murinas con el fin de mejorar el rendimiento y la calidad del ARN o proteína extraída de los tejidos y permitir el análisis de perfiles moleculares asociados con respuestas inflamatorias. Una visualización representativa de la imagen de gel muestra el ARN extraído de las patas frontales de los ratones de la CIA.El rRNA 28S y las bandas de ARNr 18S indican que todas las muestras tienen suficiente cantidad de ARN intacto. Aquí se muestra una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones totales de proteínas basadas en el análisis de proteína BCA. Las concentraciones totales de proteínas de ratones ingenuos, ratones de la CIA o ratones de la CIA bajo diversos tratamientos son comparables entre grupos.A continuación, se realizan análisis de Luminex para determinar las concentraciones de citoquinas inflamatorias y quimioquinas en el extracto de proteína. Una gráfica de dispersión representativa de las concentraciones de citoquinas y quimioquinas normalizadas revela que, en comparación con los ratones ingenuos, varias citoquinas se elevan en ratones de la CIA y el tratamiento con anticuerpos anti-IL17A inhibe significativamente la producción de varias citoquinas. El análisis de microarray se realiza para evaluar los cambios en el transcriptoma en la CIA y los efectos relacionados con el tratamiento.Aquí se muestra una gráfica representativa de los genes de los genes en ratones de la CIA en comparación con los ratones ingenuos. Al realizar este procedimiento, es fundamental que los investigadores minimicen el tiempo que el tubo y el polvo se mantienen fuera del hielo seco. Esto ayuda a prevenir el deshielo del polvo y los problemas posteriores al ARN y la proteína degradados.La alta calidad de las firmas moleculares generadas por esta técnica permite a los investigadores interrogar el perfil único que una voluntad terapéutica imparte y permite además la diferenciación de los mecanismos que se pueden utilizar para tratar afecciones artríticas. Esta técnica podría utilizarse para extraer una serie de tejidos densos como oídos y huesos para evaluar aún más las firmas moleculares en estos tejidos de interés. Comprender cómo las terapias modulan las firmas moleculares de la enfermedad nos permite evaluar mejor qué vías de señalización específicas se modulan.Y tal vez aún más importante, qué vías no están reguladas con el mecanismo terapéutico que se evalúa. Cuando se trabaja con nitrógeno líquido y hielo seco, es imperativo utilizar equipos de protección personal, incluidos guantes y protectores faciales debidamente clasificados. La exposición de la piel durante más de unos segundos puede causar quemaduras graves.Cuando se trabaja con grandes cantidades de hielo seco, es importante trabajar en un área bien ventilada, ya que el hielo seco libera dióxido de carbono.

a-cryo-pulverization-protocol-for-processing-mouse-paws-to-evaluate

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una terapia basada en células para la artritis autoinmune en ratones. Las células T reguladoras derivadas de iPSC que expresan receptores específicos de ovoalbúmina se inyectan con albúmina sérica bovina metilada (mBSA) emulsionada en un adyuvante. Las células presentadoras de antígenos murinos (APC) procesan y presentan la mBSA a las células T, lo que provoca la activación de las células T y la migración a la membrana sinovial de la articulación de la rodilla. Las...

Una terapia basada en células para la artritis autoinmune en un modelo murino

Hemos desarrollado una medida evocada de dolor de la artritis y junto con un método estandarizado para medir el dolor espontáneo en diferentes modelos murinos de artritis inducida químicamente. Estas medidas son sensibles y reproducibles para diferentes tipos de dolor en las articulaciones.

Medidas espontáneas y evocadas de dolor en modelos murinos de dolor Monoarticular de la rodilla

Aquí, presentamos tres métodos para evaluar la migración y la infiltración de neutrófilos tanto in vivo como in vitro. Estos métodos se pueden utilizar para descubrir terapias prometedoras dirigidas a la migración de neutrófilos.

Detectar la migración y la infiltración de neutrófilos en ratones

El presente protocolo describe los arañazos controlados de microcuchilla en la superficie del cartílago articular después de desestabilizar la rodilla del ratón cortando el ligamento miniescotibial medial. Este modelo animal presenta una forma acelerada de osteoartritis (OA) adecuada para estudiar la formación de osteofitos, la osteosclerosis y el dolor en etapa temprana.

Desestabilización del menisco medial y el cartílago rasguño modelo murino de osteoartritis acelerada

El presente estudio proporciona un protocolo modificado para aislar macrófagos sinoviales y fibroblastos del tejido de artritis inflamatoria murina.

Aislamiento y cultivo de macrófagos sinoviales primarios y fibroblastos a partir de tejido murino de artritis

Presentamos un protocolo para la manipulación de Tuina realizada en ratas con artrosis de rodilla inmovilizada por yeso. Sobre la base de los resultados preliminares, sugirió que la eficacia del método se basaba en la reducción de la inflamación y la pérdida de cartílago.

Manipulación de Tuina para reducir la inflamación y la pérdida de cartílago en ratas con artrosis de rodilla

El estudio demuestra el papel de la piel en la modulación de las respuestas inmunitarias en ratones a través de la inmunización epicutánea (EC). La inmunización de la AE con un antígeno proteico puede suprimir las respuestas inmunitarias en la hipersensibilidad de contacto o revertir la supresión inducida por la piel cuando se combina con patrones moleculares asociados a patógenos. La inmunización anticonceptiva anticonceptiva (AE) se muestra prometedora como un enfoque eficaz y sin agujas para...

Modelo murino de inmunomodulación inducida epicutáneamente

La imagen in vivo de las articulaciones es una técnica valiosa para descubrir el comportamiento migratorio de los leucocitos y la dinámica molecular dentro de las articulaciones inflamadas. Aquí presentamos un protocolo detallado para la obtención de imágenes in vivo de las articulaciones utilizando un modelo murino de artritis inducida por colágeno tipo II (CIA).

In vivo Las imágenes revelan el comportamiento migratorio de los leucocitos dentro de las articulaciones

Aquí, presentamos un protocolo que establece un modelo de ratón con artritis reumatoide (AR) a través de la transferencia adoptiva de células T CD4+ de ratones SKG, proporcionando una herramienta experimental rápida y confiable para investigar los mecanismos inmunológicos, la progresión patológica y el desarrollo de nuevos tratamientos para la AR.

Un modelo adoptivo de transferencia de artritis reumatoide en ratones

Las células M en un folículo especializada asociada a epitelio que recubre las placas de Peyer juegan un papel importante para el inmunovigilancia la mucosa en el intestino de tejido linfoide asociado. Aquí se describe el método de evaluación para transcitosis bacteriana por las células...

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

Aprende el método de criopulverización para procesar patas de ratón en modelos de artritis inducida por colágeno. Esta técnica mejora la extracción de ARN y proteínas de alta calidad para análisis moleculares.

Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno (Video) | JoVE Journal

Un protocolo de Cryo-pulverización para el procesamiento de patas de ratón para evaluar las vías moleculares de la inflamación del tejido en un modelo de artritis inducida por colágeno

Explorar más videos