Name: Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende a evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster mediante inyección de colorantes y microscopía confocal. Este método permite estudiar la regulación genética en tejidos vivos.

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Los autores agradecen al Dr. F. Bryan Pickett y al Dr. Rodney Dale por el uso de equipos para inyección. Este trabajo fue financiado por fondos de investigación de la Universidad Loyola de Chicago a M.D., D.T., y J.J.

1. Recogida de muestras
<ol><li>Colección embryo
	<ol><li>En cada jaula de recolección de embriones, utilice un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos para las colecciones. Incubar estas moscas en una botella con alimentos de agar harina de maíz(Tabla de Materiales)durante 1 a 2 días antes de comenzar las colecciones23. NOTA: Se pueden utilizar más moscas, pero la proporción de mujeres a hombres debe mantenerse en 2:1.</li>
		<li>Platos de agar jugo de manzana pre-caliente(Tabla 1) a 25oC durante la noche. NOTA: Esto es necesario para la puesta en escena adecuada de embriones. Si las placas se están secando rápidamente, agregue un recipiente con agua a la incubadora para aumentar la humedad de la cámara.</li>
		<li>Anestetiza las moscas del paso 1.1.1 con CO2 y transfiere las moscas a una jaula de recolección. Coloque un plato de agar jugo de manzana precalentado con un pequeño frotis de pasta de levadura en el extremo abierto y asegúrelo a la jaula con la manga roja(Tabla de materiales). Con el fin de limpiar embriones más viejos, permita que las moscas pongan embriones/huevos en una placa de agar jugo de manzana durante 1 h a 25 oC.</li>
		<li>Retire la jaula de recogida de la incubadora. Invierta el lado de la malla de la jaula hacia abajo y toque las moscas hacia abajo hasta la parte inferior de la jaula. Sustituya el agar jugo de manzana por un nuevo plato de agar de jugo de manzana precalentado con un pequeño frotis de pasta de levadura. Deseche el primer plato.</li>
		<li>Dejar que las moscas pongan embriones/huevos en la nueva placa de agar jugo de manzana durante 1 h a 25 oC. Deseche esta placa después de la recolección de 1 h y continúe con el siguiente paso para recoger embriones inyectables.</li>
		<li>Para recoger embriones de etapa tardía 17 (20-21 h AEL), permita que las moscas del genotipo deseado de los pasos 1.1.1-1.1.5 se acosten sobre una nueva placa de agar de jugo de manzana precalentada con un pequeño frotis de pasta de levadura a 25 oC durante 1 h. Placa de edad para 19 h en una incubadora de 25 oC , por lo que los embriones serán de 20 a 21 h de edad en el momento de la toma de imágenes. NOTA: Este paso se puede repetir según se desee para múltiples rondas de recolección de muestras, inyección e imágenes.</li>
		<li>Recoger embriones de placas en un colador de células con malla de nylon de 70 m mediante la adición de solución salina tamponada de fosfato (PBS) con 0.1% tensioactivo no iónico (PBTx; Tabla 1) para cubrir la superficie de la placa y aflojar embriones de la superficie usando un pincel.</li>
		<li>Embriones dechorionatos recogidos en el colador celular en una solución de lejía al 50%(Tabla 1) en una placa Petri de 100 mm durante 5 min con agitación ocasional a temperatura ambiente. Enjuague los embriones 3 veces girando el colador celular en PBTx en una placa Petri, usando un plato fresco de PBTx cada vez.</li>
		<li>Si todos los embriones son del genotipo correcto, proceda directamente al paso 1.1.10. Si la generación de embriones del genotipo correcto requiere una cruz con moscas heterocigotas, seleccione embriones del genotipo correcto utilizando la presencia o ausencia de cromosomas equilibradores marcados fluorescentesmente. Utilice un estereomicroscopio con capacidades fluorescentes para la selección de genotipos. NOTA: Cromosomas equilibradores marcados con proteína fluorescente amarilla deformada; Kruppel-Gal4, proteína fluorescente verde UAS (GFP); y twist-Gal4, UAS-GFP funcionan bien para la selección del genotipo en la embriogénesis tardía(Tabla 2)24,25,26.</li>
		<li>Utilizando una pipeta de vidrio, transfiera embriones en PBTx a una losa de gel de agarosa del 2% (Tabla 1). Retire el exceso de líquido con papel de filtro. Alinee los embriones de 6 a 8 en la losa de gel de agarosa del 2% con el lado posterior a la derecha y dorsal hacia arriba(Figura 1B). NOTA: El micropyle, el pequeño orificio a través del cual los espermatozoides entran en el óvulo, se encuentra en el extremo anterior del embrión. El extremo posterior es más redondeado. La tráquea aparece blanca y se encuentra dorsalmente en el embrión, permitiendo la distinción de los lados dorsal y ventral del embrión(Figura 1B).</li>
		<li>Prepare una diapositiva con una pieza de cinta adhesiva de doble cara. Presione firmemente la diapositiva en la parte superior de los embriones para transferirlos a la cinta de doble cara.</li>
		<li>Desecar embriones por incubación a temperatura ambiente por 25 min (no se utiliza desecante). Después de la desecación, cubrir los embriones con aceite de halocarbon. NOTA: Los períodos de desecación pueden variar dependiendo de la temperatura, la humedad y la ventilación en la habitación. El período de incubación debe utilizarse para configurar el aparato para inyección y el microscopio confocal para la toma de imágenes, tal como se describe en las secciones 2 y 3 de este protocolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Colección larval
	<ol>
<li>Establecer una cruz con 5 x 10 moscas hembra vírgenes del genotipo deseado y la mitad de machos del genotipo deseado en un vial con alimentos de harina de maíz-agar e incubar a 25 oC23.</li>
		<li>Después de 5 a 7 días, dependiendo del genotipo, recoger las larvas de tercera estrella errantes del vial suavemente con fórceps. Enjuague las larvas en 1x PBS para eliminar los alimentos pegados a las larvas. Transfiera las larvas a una placa de agar jugo de manzana para el genotipado como se describe en el paso 1.1.9 si es necesario.</li>
		<li>Enrolle las larvas sobre un pañuelo usando un pincel para secarlas. Transfiera 6 a 8 larvas a un portaobjetos preparado con cinta adhesiva de doble cara con fórceps.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de agujas e inyección de especímenes
<ol><li>Tire de las agujas de un tirador de micropipeta antes del inicio de este protocolo. Asegure los tubos capilares en el tirador de la aguja y tire de acuerdo con la forma estándar de la aguja y los parámetros para las inyecciones de D. melanogaster (Tabla 3)27. Almacene las agujas en un plato de Petri anclando en arcilla hasta su uso para inyección.</li>
	<li>Cargue una aguja con 5 l de 10 kDa de dextran conjugado con cloruro ácido sulforhodamine 101(Tabla de materiales) utilizando una punta de pipeta de carga en gel de 20 l durante el período de desecación de 25 minutos para embriones (paso 1.1.12), o inmediatamente después de la transferencia de larvas al portaobjetos (paso 1.2.3).</li>
	<li>Cargue la aguja en un soporte de aguja y colóquela en un micromanipulador fijado a una base de acero(Tabla de materiales). NOTA: La aguja debe ser casi paralela a la etapa del microscopio para la inyección de embriones y en ángulo ligeramente hacia abajo para las inyecciones de larvas.</li>
	<li>Ajuste el aparato de inyección(Tabla de materiales)a 50 psi, 5 x 10 ms con un rango de 10. NOTA: Puede ser necesario modificar estos ajustes para el aparato de inyección en particular que se está utilizando.</li>
	<li>Coloque la corredera en el escenario y el borde del cepillo de la aguja contra el borde de la cinta de doble cara en un ángulo de 45o para crear una punta en ángulo rota. NOTA: Para los embriones sólo es necesario romper la punta lo suficiente como para permitir el flujo del dextran de 10 kDa. Una aguja perfecta tiene una punta ligeramente inclinada y sólo una pequeña gota de tinte saldrá con cada inyección. Para las larvas, es necesario romper más la punta, pero con una punta en ángulo para penetrar en la pared del cuerpo larvario. Una gota más grande de tinte saldrá.</li>
	<li>Bombee el pedal hasta que el tinte esté en la punta de la aguja.</li>
	<li>Alinee la aguja de modo que sea paralela con el embrión o en ángulo ligeramente hacia abajo hacia la larva.</li>
	<li>Mueva la aguja para perforar el extremo posterior de la muestra e inyecte la muestra bombeando el pedal. Inyectar 2 nL de tinte en embriones, y 220 nL de tinte en larvas. NOTA: El embrión o larva debe inundarse con tinte si la inyección es exitosa.</li>
	<li>Tenga en cuenta el tiempo de inyección para fines de incubación. Incubar embriones durante 10 min a temperatura ambiente. Incubar larvas durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Continúe por el portaobjetos para inyectar muestras adicionales, observando el tiempo de inyección de cada espécimen. NOTA: Dependiendo de la velocidad con la que se pueden realizar los pasos posteriores de disección e imágenes, se pueden inyectar 4 a 8 muestras a la vez.</li>
</ol>3. Preparación de muestras para imágenes
<ol><li>
Imágenes de embriones
	<ol>
<li>Después de la inyección, prepare embriones para la toma de imágenes. Aplique vaselina con un aplicador con punta de algodón en los lados derecho e izquierdo de las muestras en el portaobjetos como espaciador para evitar daños a los embriones al colocar la cubierta.</li>
		<li>Muestras de imagen utilizando un microscopio confocal a lo largo de la profundidad del embrión con un objetivo de 20x. Calcular el porcentaje de muestras totales con tinte observado en el cordón del nervio ventral (VNC) utilizando la siguiente ecuación: % de muestras con BBB comprometida - Número de muestras con acumulación de tinte en el VNC/número total de muestras ensayadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disección e imágenes de larvas
	<ol>
<li>Prepare diapositivas para muestras larvales con anticipación. Monte dos cubiertas espaciadas aproximadamente 0,5 cm de distancia a la diapositiva con esmalte de uñas. NOTA: Los cubreobjetos funcionan como espaciadores para el cerebro, por lo que no se daña durante el proceso de montaje.</li>
		<li>Después de la incubación de 30 minutos, diseccionar las larvas en 1x PBS directamente en el portaobjetos que se utilizará en la toma de imágenes. Primero, usa un par de fórceps para agarrar la larva hasta la mitad del cuerpo larvario, y usa un segundo par de fórceps para separar las mitades anterior y posterior de la larva.</li>
		<li>A continuación, usa un par de fórceps para agarrar la región anterior en los ganchos de la boca, y usa un segundo par de fórceps para invertir la pared del cuerpo sobre la punta de los fórceps agarrando los ganchos de la boca. El cerebro y el VNC estarán expuestos.</li>
		<li>Separe el cerebro y el VNC de la pared del cuerpo separando los nervios y retire la pared del cuerpo de la diapositiva(Figura 1C,D). Retire los discos imaginables si lo desea.</li>
		<li>Cubra la muestra con 10 ml de glicerol al 80% y coloque un cubreobjetos encima de la muestra para obtener imágenes.</li>
		<li>Imagen a través de la profundidad del tejido del sistema nervioso utilizando un objetivo 20x. Calcular el porcentaje de muestras totales con tinte observado en el VNC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
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<li>Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+somatic+permeability+barrier+around+the+germline+is+essential+for+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 142 (2), 268-281 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona una descripción completa de los pasos necesarios para el ensayo para la integridad de BBB durante las etapas larantes de D. melanogaster de D. melanogaster. Se han descrito enfoques similares en otros lugares para probar la integridad del BBB durante el desarrollo, así como en las etapas adultas5,7,29,30. Sin embargo, las descripciones de los procedimientos e...

Durante el desarrollo, la comunicación celular y las interacciones son fundamentales para el establecimiento de la estructura y función de tejidos y órganos. En algunos casos, estas interacciones células-células sellan los órganos del entorno circundante para asegurar el funcionamiento adecuado del órgano. Este es el caso del sistema nervioso, que está aislado por la barrera hematoencefálica (BBB). Disfunción del BBB en seres humanos se ha relacionado con trastornos neurológicos incluyendo epilepsia, y la descomposición de la barrera se ha observado en enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis múltiple y esclerosis lateral amiotrófica1. En los mamíferos, el BBB está formado por uniones estrechas entre las células endoteliales2,3. Otros animales, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, tienen un BBB compuesto de células gliales. Estas células gliales forman una barrera selectivamente permeable para controlar el movimiento de nutrientes, productos de desecho, toxinas y moléculas grandes dentro y fuera del sistema nervioso4. Esto permite el mantenimiento del gradiente electroquímico necesario para disparar potenciales de acción, permitiendo la movilidad y coordinación4. En D. melanogaster, la glia protege el sistema nervioso de la hemolinfa5rica en potasio.
En el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (PNS) de D. melanogaster, dos capas glias externas, la glia subperineurial y la glia perineurial, así como una red externa de matriz extracelular, la lamela neural, forman la hemolinfa-cerebro y la barrera del nervio hemafifáfico6, conocido como el BBB a lo largo de este artículo. Durante el desarrollo la glia subperineurial se convierte nofoides y se agranda para rodear el sistema nervioso5,6,7,8,9,10,11 . La glia subperineurial forma uniones septato, que proporcionan la principal barrera de difusión entre la hemolinfa y el sistema nervioso5,6,12. Estas uniones son molecularmente similares a las uniones similares a septatos que se encuentran en los paranodos de la glia mielinante en vertebrados, y realizan la misma función que las uniones estrechas en el BBB de los mamíferos13,14, 15 , 16 , 17. La glia perineurial divide, crece y envuelve alrededor de la glia subperineurial para regular la difusión de metabolitos y moléculas grandes6,10,18,19. La formación de BBB se completa en 18,5 h después de la puesta de huevos (AEL) a 25 oC5,8. Estudios anteriores han identificado genes que son reguladores críticos de la formación BBB20,21,22. Para comprender mejor las funciones exactas de estos genes, es importante examinar el efecto de la mutación de estos reguladores potenciales en la integridad de bBB. Si bien estudios anteriores han esbozado enfoques para decir la integridad de BBB en embriones y larvas, aún no se ha descrito un protocolo integral para este ensayo5,7. Este protocolo paso a paso describe los métodos para decir la integridad de BBB durante las etapas embrionarias de D. melanogaster y la tercera etapa larval instar.

<table><tbody><tr><td>10 kDa sulforrodamina 101 cloruro ácido (Texas Red) Dextrano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1863</td><td>Dextran debe diluirse en ddH2O esterilizado en autoclave a una concentración de 25 mg/mL.</td></tr><tr><td>20 &mu; L Puntas de pipeta con carga de gel</td><td>Eppendorf</td><td>22351656</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (200 grados)</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>11000200</td><td></td></tr><tr><td>Levadura seca activa</td><td>Red</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Star Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Compresor de aire</td><td>DeWalt</td><td>D55140</td><td></td></tr><tr><td>Jugo</td><td>de manzana Mott's Jugo</td><td></td><td></td>de manzana natural</tr><tr><td>Lejía Lejía</td><td></td><td></td> doméstica <td>1-5% Hipoclorito</td></tr><tr><td>Borosilicato Capilares de vidrio World</td><td>Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tapones para botellas Fisher</td><td>Scientific</td><td>AS-277</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>Muestras fotografiadas con objetivo 20x (UPlanSApo 20x/ 0.75)</td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón</td><td>Puritan</td><td>19-062614</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td> <td>Pinzas Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont de 1/2"; Patrón #5; .05 x .01 mm Punta</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de comida para moscas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-355</td><td></td></tr><tr><td>Viales de comida para moscas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-515</td><td></td></tr><tr><td>Pedal</td><td>Treadlite II</td><td>T-91-S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Caster</td><td>Bio-Rad 1704422</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de gel</td><td>Bio-Rad</td><td>1704436</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipeta</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Azúcar</td><td></td><td></td> granulada <td>Comprado en la tienda de comestibles.</td></tr><tr><td>Laboratorio de Aceite de Halocarbono</td><td>Científico, Inc.</td><td>FLY-7000</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz</td><td>Schott</td><td>Ace I</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador Stand</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>KITE-R</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH310</td><td></td></tr><tr><td>Juegos de filtros Nightsea</td><td>Ciencia de la microscopía electrónica</td><td>SFA-LFS-CY</td><td>Para la visualización del</td></tr><tr><td>sistema de adaptador completo YFP Nightsea con cabezal de luz de color azul real</td><td>Ciencia de la microscopía electrónica</td><td>SFA-RB</td><td>Para la visualización de GFP</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Simply Simmons</td><td>Chisel Blender #6</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Bomba neumática</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>Esto también se conoce como microinyector o regulador de presión. Dado que el modelo utilizado en nuestro estudio ya no está disponible, esta es una alternativa.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas de recolección de embriones pequeños</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico anhidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Placa base de acero</td><td>World Precision Instruments</td><td>5052</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Se utiliza para la disección de tejidos.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico con fuente de luz transmitida</td><td>Baytronix</td><td></td><td>Se utiliza para inyección.</td></tr><tr><td>Tegosept (ácido p-hidroxibenzoico, éster metílico)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>Tapones de vial surfactantes no iónicos</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>AS-273</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en drosophila melanogaster

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

El desarrollo adecuado del sistema nervioso incluye la formación de la barrera hematoencefálica, la barrera de difusión que regula estrechamente el acceso al sistema nervioso y protege el tejido neural de toxinas y patógenos. Los defectos en la formación de esta barrera se han correlacionado con las neuropatías, y la descomposición de esta barrera se ha observado en muchas enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es fundamental identificar los genes que regulan la formación y el mantenimiento de la barrera hematoencefálica para identificar posibles dianas terapéuticas. Con el fin de entender las funciones exactas que estos genes juegan en el desarrollo neuronal, es necesario determinar los efectos de la expresión génica alterada en la integridad de la barrera hematoencefálica. Muchas de las moléculas que funcionan en el establecimiento de la barrera hematoencefálica se han encontrado para ser conservadas a través de especies eucariotas, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster. Las moscas de la fruta han demostrado ser un excelente sistema modelo para examinar los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo y la función del sistema nervioso. Este protocolo describe un procedimiento paso a paso para el ensayo de la integridad de la barrera hematoencefálica durante las etapas embrionarias y larvales del desarrollo de D. melanogaster.

Los métodos descritos aquí permiten la visualización de la integridad del BBB en todo el SNC en embriones y larvas de D. melanogaster (Figura 1). Una vez completada la formación de BBB en la embriogénesis tardía, el BBB funciona para excluir moléculas grandes del cerebro y VNC5. Este protocolo aprovecha esta función para probar la formación BBB. Cuando se inyectaron embriones de tipo salvaje (Oregon R) en etapa tardía 17 (20-21 h de edad) con 10 kDa de dextra...

La integridad de la barrera hematoencefálica es fundamental para la función del sistema nervioso. En Drosophila melanogaster, la barrera hematoencefálica se forma por células gliales durante la embriogénesis tardía. Este protocolo describe los métodos para el ensayo para la formación y el mantenimiento de barreras hematoencefálicas en embriones D. melanogaster y larvas de tercera estrella.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave con respecto a la regulación genética de la formación y el mantenimiento de la barrera blood - brain durante múltiples etapas de desarrollo de la drosophila. Este método también se puede adaptar para examinar la permeabilidad de otras barreras, como el epitelio intestinal en una variedad de organismos. La principal ventaja de esta técnica es que permite evaluar la función de barrera hematoencefálica en los tejidos vivos.La demostración visual de este método es crítica, ya que las manipulaciones de ejemplo pueden ser difíciles y muchos pasos requieren mucha atención a los detalles. Para la recogida de embriones colocar un mínimo de 50 hembras vírgenes con 20 a 25 machos por botella con alimentos de agar harina de maíz e incubar estas moscas durante uno o dos días antes de comenzar las colecciones. El día antes de la recolección, platos calientes de agar con jugo de manzana a 25 grados centígrados durante la noche.A la mañana siguiente transfiera las moscas anestesiadas de dióxido de carbono a una jaula de recolección y coloque un plato de agar de jugo de manzana precalejado con un pequeño frotis de pasta de levadura en el extremo

assay-for-blood-brain-barrier-integrity-in-drosophila-melanogaster

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los ensayos para medir el comportamiento de las funciones del aparato locomotor, el aprendizaje y las habilidades de memoria...

Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

Drosophila melanogaster es un sistema de genética y de comportamiento modelo manejable que se ha utilizado para entender las bases moleculares y celulares de muchos procesos biológicos importantes para más de un siglo 1. Drosophila ha sido bien aprovechado para hacerse una idea de la base genética del comportamiento de las moscas.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Este vídeo muestra un procedimiento para evaluar la alteración de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón EAE. Los tintes fluorescentes de diferentes tamaños se inyectan retroorbitalmente y circulan a través de los vasos sanguíneos del cerebro. El tinte más pequeño se filtra a través de los espacios en el tejido cerebral, mientras que el tinte más grande ingresa solo si la interrupción es grave, lo que se correlaciona con el grado del daño de la barrera.

Determinación de la disrupción de la barrera hematoencefálica mediante colorantes fluorescentes en un modelo de ratón EAE

A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA)...

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

El protocolo describe un análisis simple para identificar larvas de Drosophila melanogaster que experimentan hipoxia bajo niveles normales de oxígeno atmosférico. Este protocolo permite larvas hipóxicas debe distinguirse de otros mutantes que muestran fenotipos superpuestos como lentitud o crecimiento lento.

Un ensayo de tecolote/túnel para la detección de la hipoxia en larvas de Drosophila melanogaster

Presentamos un protocolo para la medición de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Se utiliza un analizador metabólico con un protocolo adaptado y optimizado. Micro-tejido restricciones son un componente fundamental de este protocolo y fueron diseñadas y creadas específicamente para su uso en este análisis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

Este protocolo describe un método para registrar la actividad eléctrica descendente de la sistema de nervioso central de Drosophila melanogaster para permitir pruebas de agentes farmacológicos, mutaciones genéticas de las proteínas neuronales, conveniente y rentable o el papel de los caminos fisiológicos inexplorados.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

El protocolo presenta un método rentable y de alto rendimiento para evaluar la neurotoxicidad en la mosca de la fruta a través de la cuantificación de la disfunción locomotora como alternativa a los modelos tradicionales de mamíferos. Su objetivo es evaluar los efectos neurotóxicos de compuestos farmacéuticos, agentes ambientales o modificaciones genéticas utilizando un modelo sensible, reproducible y éticamente favorable.

Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

Este protocolo presenta un método confiable para evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) en el modelo de pez cebra adulto (Danio rerio) utilizando la evaluación basada en colorantes azules de Evan, lo que permite el análisis cualitativo y cuantitativo de la alteración neurovascular.

Visualizando al guardián: evaluación basada en el tinte azul de Evan de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en peces cebra adultos

Aprende a evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster mediante inyección de colorantes y microscopía confocal. Este método permite estudiar la regulación genética en tejidos vivos.

Ensayo para la integridad de la barrera hematoencefálica en Drosophila melanogaster

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