Name: Determinación de las relaciones de autoejecución e inter-(in) en albaricoque que combinan la polinización manual, la microscopía y los análisis genéticos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a determinar la autoincompatibilidad en albaricoque mediante polinización manual, microscopía de fluorescencia y análisis PCR de genotipos S. Este método permite evaluar relaciones de compatibilidad entre cultivares en condiciones controladas de laboratorio.

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Esta investigación fue financiada por ministerio de ciencia, Innovación y Universidades-Fondo Europeo de Desarrollo Regional, Unión Europea (AGL2016-77267-R, y AGL2015-74071-JIN); Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00, RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón-Fondo Social Europeo, Unión Europea (Grupo Consolidado A12_17R), Fundación Biodiversidad y Agroseguro S.A.

1. Determinación de auto-(in)compatibilidad
<ol><li>Pruebe las flores en el campo. Es necesario recoger las flores en la etapa de globo(Figura 1A), correspondiente a la etapa 58 en la escala BBCH para el albaricoque28,para evitar la polinización previa no deseada.</li>
	<li>
Autonuquinaciones cruzadas y autonúditos en el laboratorio
	<ol>
<li>Retire las anteras de las flores en la etapa del globo y colóquelas en un pedazo de papel para secar a temperatura de laboratorio.</li>
		<li>Después de 24 h, tamiza los granos de polen usando una malla fina (0,26 mm) (Figura 1B).</li>
		<li>Emascular un grupo de 30 flores en la misma etapa de globo para cada autopolinización y polinización cruzada y colocar los pistilos en espuma florista en agua a temperatura de laboratorio (Figura 1C).</li>
		<li>Polinizar a mano los pistilos con la ayuda de un pincel con polen de flores del mismo cultivar 24 h después de la emasculación. Además, polinizar otro conjunto de pistilos de cada cultivar con polen de flores de un polinizador compatible como control (Figura 1D).</li>
		<li>Después de 72 h, fijar los pistilos en una solución fijativa de etanol/ácido acético (3:1) durante al menos 24 h a 4 oC29. A continuación, deseche el fijador y agregue un 75% de etanol asegurándose de que las muestras estén completamente sumergidas en la solución. Las muestras se pueden conservar en esta solución a 4oC hasta que seutilicen 8,17,30,31,32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Evaluación de la viabilidad del polen a través de la germinación in vitro del polen
	<ol>
<li>Para preparar el medio de germinación, peso 25 g de sacarosa, 0,075 g de ácido bórico (H3BO3) y 0,075 g de nitrato de calcio (Ca(NO3)2)33.</li>
		<li>Añadir los componentes del medio en 250 ml de agua destilada y disolver por completo.</li>
		<li>Solidificar el medio añadiendo 2 g de agarosa y mezclar remolinos.</li>
		<li>Compruebe el pH del medio utilizando un medidor de pH y ajuste el valor a 7.0 con la solución NaOH o HCl.</li>
		<li>Autoclave la mezcla para esterilizar el medio.</li>
		<li>Después del autoclavado, enfríe el medio y distribúyalo en platos Petri en una capucha de flujo laminar estéril.</li>
		<li>Dispersar los granos de polen de los mismos cultivares utilizados para las polinizaciones controladas en el medio de germinación de polen solidificado y observarlos bajo el microscopio después de 24 h6. NOTA: Para esterilizar la campana de flujo laminar, limpie la superficie con un 70% de etanol y encienda la lámpara UV durante 10 min.</li>
		<li>Almacene los platos de Petri en nevera a 4 oC hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Observaciones de microscopía
	<ol>
<li>Lavar los pistilos tres veces durante 1 h con agua destilada y dejarlos en sulfito sódico al 5% a 4 oC. Después de 24 h, autoclavelos a 1 kg/cm2 durante 10 min en sulfito de sodio para suavizar los tejidos34.</li>
		<li>Coloque los pistilos autoclaves sobre un tobogán de vidrio y, con la ayuda de un bisturí, retire los tricomas alrededor del ovario para obtener una mejor visualización de los tubos de polen. A continuación, aplastar los pistilos con un vaso de cubierta.</li>
		<li>Preparar la mancha azul anilina del 0,1% (v/v): mezclar 0,1 ml de azul anilina en 100 ml de 0,1 N de fosfato potásico tribásico (K3PO4). Aplique una gota de azul anilina sobre las preparaciones para manchar las deposiciones de callosa durante el crecimiento del tubo de polen.</li>
		<li>Observe los tubos de polen a lo largo del estilo mediante un microscopio con epifluorescencia UV utilizando 340-380 filtros de paso de banda y 425 filtros de paso largo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extracción de ADN
<ol><li>Muestra 2-3 hojas en el campo en primavera. Se recomienda tomar muestras de las hojas en etapas jóvenes ya que el ADN obtenido es de mayor calidad y niveles más bajos de compuestos fenólicos en comparación con las hojas viejas.</li>
	<li>Extraiga ADN genómico siguiendo los pasos descritos en un kit disponible comercialmente (consulte Tabla de materiales).</li>
	<li>Analizar la cantidad y calidad de las concentraciones de ADN utilizando espectrofotómetro UV-vis (260 nm).</li>
</ol>3. IdentificaciónS-allele
<ol><li>
Configuración de las reacciones DE PCR
	<ol>
<li>Preparar una dilución de 50 ng/L en agua destilada de cada muestra de extracción de ADN.</li>
		<li>Descongele los reactivos de PCR lentamente y manténgalos sobre hielo. Deje el ADN polimerasa en el congelador hasta que sea necesario.</li>
		<li>Preparar las reacciones de amplificación utilizando las diferentes combinaciones de imprimaciones. Cree la mezcla de reacciones PCR combinando los componentes de la Tabla 1. Vortex la reacción PCR mezcla bien y distribuye el volumen indicado para las diferentes combinaciones de imprimaciones a cada pozo de la placa PCR. A continuación, agregue 1 l de la dilución del ADN en cada pocól.</li>
		<li>Coloque la placa PCR en el termociclador y ejecute el programa PCR correspondiente que se muestra en la Tabla 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analice los fragmentos amplificados. Hay principalmente dos formas diferentes de analizar los fragmentos amplificados PCR: electroforesis capilar (CE) con imprimaciones con etiqueta fluorescente o como visualización amplicons de electroforesis de gel de agarosa con imprimaciones no etiquetadas.<ol>
<li>
Electroforesis capilar
		<ol>
<li>Para preparar el tampón de carga, mezcle 35 ml de formamida desionizada con 0,45 ml de tamaño etiquetado estándar. Vórtice el reactivo para mezclar bien, y luego dispensar 35.5 l en el pocódcilo de la placa del lector.</li>
			<li>Agregue 1 l del producto PCR en el pocól. Además, añadir una gota de aceite mineral para evitar la evaporación del agua.</li>
			<li>Prepare la placa de separación añadiendo tampón de separación.</li>
			<li>Utilice el software comercial incluido con el analizador de genes (ver Tabla de materiales). Cree una nueva placa de muestra y guarde los nombres de muestra para todos los pozos de la placa.</li>
			<li>Seleccione el método de análisis. En este caso, desnaturalizar las muestras a 90oC durante 120 s, inyectar a 2,0 kV durante 30 s y separar a 6,0 kV durante 35 min.</li>
			<li>Inserte las dos placas en el analizador genético. Llene la matriz capilar con agua destilada.</li>
			<li>Cargue el gel patentado de poliacrilamida lineal (LPA). Por último, haga clic en Ejecutar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Electroforesis de gel
		<ol>
<li>Preparar un gel de agarosa al 1% añadiendo 1,5 g de agarosa de grado de biología molecular en 150 ml de tampón de electroforesis de 1% TAE (Tris-acetate-EDTA) (40 mM Tris, ácido acético de 20 mM y EDTA de 1 mM a pH 8.0). Disolver la agarosa por calentamiento por microondas durante 2-3 min.</li>
			<li>Para visualizar el ADN, añada 4 s de una mancha de ácido nucleico (ver Tabla de materiales) y mezcle suavemente.</li>
			<li>Añadir un peine de gel, con suficientes pozos para escaleras, controles y muestras, en una bandeja de gel. Luego, vierta lentamente la mezcla en el centro de la bandeja de gel y evite las burbujas.</li>
			<li>Dejar enfriar el gel durante 30-45 min a temperatura ambiente hasta que el gel se haya solidificado por completo. Introducir el gel en la cámara de electroforesis, quitar el peine de gel y llenar la cámara con suficiente tampón 1x TAE para cubrir el gel. NOTA: Compruebe la colocación del gel. Los pozos deben colocarse cerca del polo negativo ya que el ADN cargado negativamente migra hacia el cátodo.</li>
			<li>Añadir 5 l de tampón de carga (0,1% (v/v) azul bromofenol) a los productos de PCR y mezclar bien.</li>
			<li>Para estimar el tamaño de las bandas, cargue 5 s de la escalera de peso molecular del ADN (ver Tabla de materiales).</li>
			<li>Cargue las muestras en los pozos adicionales del gel.</li>
			<li>Una vez cargadas todas las muestras y la escalera de peso molecular del ADN, ejecute el gel a 90 V durante 1-1,5 h, hasta que la línea de tinte azul esté aproximadamente al 75% de la longitud del gel.</li>
			<li>Visualice las bandas en un transilluminador para los ácidos nucleicos.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Tradicionalmente, la mayoría de los cultivares europeos de albaricoque comercial eran autocomprobados36. Sin embargo, el uso de cultivares autoincom incompatibles de América del Norte como padres en programas de cría en las últimas décadas ha dado lugar a la liberación de un número creciente de nuevos cultivares autoincom incompatibles con requisitos de polinización desconocidos7,,8,,37. Por lo tanto, la ...

La autoincompatibilidad es una estrategia de floración para prevenir la autopolinización y promover el cruce1. En Rosaceae, este mecanismo está determinado por un sistema de autoincompatibilidad Gametophytic (GSI) que está controlado principalmente por el locus multiallelic S2. En el estilo, el gen RNase codifica el determinante Tylar S-s,un RNase3,mientras que una proteína F-box, que determina el determinante del polen S,está codificada por el gen SFB 4. La interacción de autoincompatibilidad se lleva a cabo a través de la inhibición del crecimiento del tubo de polen a lo largo del estilo evitando la fertilización del óvulo5,6.
En albaricoque, en lasúltimas,dos décadas se ha producido una renovación varietal en todo elmundo. Esta introducción de un número importante de nuevos cultivares, de diferentes programas de cría públicos y privados, ha dado lugar al aumento de cultivares de albaricoque con requisitos de polinización desconocidos8.
Se han utilizado diferentes metodologías para determinar los requisitos de polinización en el albaricoque. En el campo, la autocompatibilidad puede establecerse mediante polinizaciones controladas en árboles enjaulados o en flores emasculadas y,posteriormente,registrar el porcentaje del conjunto de frutas9,10,11,12. Además, se han realizado polinizaciones controladas en el laboratorio mediante el cultivo semi-in vivo de flores y el análisis del comportamiento del tubo de polen bajo microscopía de fluorescencia8,13,14,15,16,17. Recientemente, las técnicas moleculares, como el análisis de PCR y la secuenciación, han permitido caracterizar las relaciones de incompatibilidad basadas en el estudio de los genes RNase y SFB 18,,19. En el caso del albaricoque, se han notificado treinta y tres S-aleles (S1 a S20, S22 a S30, S52, S53, Sv, Sx), incluyendo un alelo relacionado con la autocompatibilidad (Sc)12,18,20,21,22,23,24. Hasta ahora, 26 grupos de incompatibilidad han sido estabilizados en esta especie según el S-genotipo8,9,17,25,26,27. Los cultivares Scon los mismos S-aleles son inter-incompatibles, mientras que los cultivares con al menos un S-allelediferente y, en consecuencia, asignados en diferentes grupos incompatibles, son inter-compatibles.
Para definir los requisitos de polinización de los cultivares de albaricoque, describimos una metodología que combina la determinación de la auto-(in)compatibilidad por microscopía de fluorescencia con la identificación del genotipo Spor análisis de PCR en cultivares de albaricoque. Este enfoque permite establecer grupos de incompatibilidad y dilucidar las relaciones de incompatibilidad entre cultivares.

<table><tbody><tr><td>Agarosa D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8010.22</td><td></td></tr><tr><td>BIOTAQ DNA Polymerase kit</td><td></td><td>Bioline BIO-21060</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>CEQ System Software</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>69106</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 4 x 25 y micro; mol</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab Kit estándar de tamaño de ADN - 400</td><td>Beckman Coulter</td><td>608098</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de análisis genético GenomeLab GeXP Tampón</td> de separación <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab</td><td>Beckman Coulter</td><td>608012</td><td></td></tr><tr><td>GenomeLab Gel de separación LPA-1</td><td>Beckman Coulter</td><td>391438</td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 100bp</td><td>Bioline</td><td>BIO-33029</td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1kb</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de análisis de imágenes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes moleculares Sistema VersaDoc MP 4000&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH BASIC 20</td><td>Crison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; Kit de PCR de alta fidelidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F553S</td><td></td></tr><tr><td>Power Pack P 25 T</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Forward</td><td>Isogen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Reverse</td><td>Isogen Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cantidad One Software</td><td>Microscopio</td> estereoscópico Bio-Rad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>Sub-Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel</td><td>Stain Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td><td>QIAGEN</td><td>201203</td><td></td></tr> vertical <tr><td>Autoclave</td><td>JP Selecta</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de las relaciones de autoejecución e inter-(in) en albaricoque que combinan la polinización manual, la microscopía y los análisis genéticos

Determination of Self- and Inter-(in)compatibility Relationships in Apricot Combining Hand-Pollination, Microscopy and Genetic Analyses

La autoincompatibilidad en Rosaceae está determinada por un sistema de autoincompatibilidad Gametophytic (GSI) que está controlado principalmente por el locus multiallelic S. En el albaricoque, la determinación de las relaciones de auto-e inter-(in)compatibilidad es cada vez más importante, ya que la liberación de un número importante de nuevos cultivares ha dado lugar al aumento de cultivares con requisitos de polinización desconocidos. Aquí, describimos una metodología que combina la determinación de la auto-(in)compatibilidad por polinización manual y microscopía con la identificación del genotipo Spor análisis de PCR. Para la determinación de auto-(in)compatibilidad, las flores en la etapa de globo de cada cultivar se recolectaron en el campo, se polinizaron a mano en el laboratorio, fijadas y teñidas con azul anilina para la observación del comportamiento del tubo de polen bajo la microscopía de fluorescencia. Para el establecimiento de relaciones de incompatibilidad entre cultivares, el ADN de cada cultivar se extrajo de hojas jóvenes y los S-alelos fueron identificados por PCR. S Este enfoque permite establecer grupos de incompatibilidad y dilucidar las relaciones de incompatibilidad entre los cultivares, lo que proporciona una valiosa información para elegir polinizadores adecuados en el diseño de nuevos huertos y para seleccionar padres apropiados en programas de cría.

Los estudios de polinización en albaricoque requieren el uso de flores en la etapa tardía del globo un día antes de la antítesis (Figura 1A). Esta etapa se considera la más favorable para la recolección de polen y pistilo, ya que las estructuras florales están casi maduras, pero la dehiscencia de las anteras aún no se ha producido. Esto evita la interferencia del polen no deseado, no sólo de polen de la misma flor sino también de otras flores, ya que los pétalos cerrados imp...

Presentamos una metodología para establecer los requisitos de polinización de los cultivares de albaricoque (Prunus armeniaca L.) que combinan la determinación de la auto-(in)compatibilidad por microscopía de fluorescencia con la identificación del S-genotipo por análisis PCR.

Determinación de las relaciones de autoejecución e inter-(in) en albaricoque que combinan la polinización manual, la microscopía y los análisis genéticos

Self-incompatibility in Rosaceae is determined by a Gametophytic Self-Incompatibility System (GSI) that is mainly controlled by the multiallelic locus S. ...

Este método puede ayudar a determinar los requisitos de polinización en diferentes especies y establecer relaciones de incompatibilidad entre cultivares. La principal ventaja de este enfoque es que permite evaluar varias incompatibilidades en condiciones de laboratorio. Evitar los numerosos problemas que pueden ocurrir en experimentos realizados en condiciones de campo.Esto permite la identificación junto con la dedicación de un número de cultivar a los grupos de incompatibilidad correspondientes. Determinar la relación de interconsabilidad entre cultivares. Este enfoque también puede ser útil para determinar la autoincompatibilidad y la relación de incompatibilidad en otros cultivos de árboles frutales como la cereza o la ciruela.Comience probando las flores en el campo. Recoger las flores en la etapa de globo, que corresponde a la etapa 58 en la escala de la BBCH para el albaricoque para evitar la polinización previa. En el laboratorio, retire las anteras de las flores y colóquelas en un pedazo de papel para secar a temperatura ambiente.Después de 24 horas, tamiza los granos de polen con una fina malla de 26 milímetros. Emascular un grupo de 30 flores en la misma etapa de desarrollo de globos para cada auto-y polinización cruzada y colocar las pistolas en espuma florista en agua 24 horas después de la emasculación y polinizar las pistolas usando un cepillo de pintura con polen de flores del mismo cultivar. Polinizar otro conjunto de pistolas de cada cultivar con polen de las flores de un polinizador compatible como control.Después de 72 horas, retire las pistolas de la espuma florista húmeda y fije las pistolas en una solución fija de 3:1 etanol al ácido acético durante al menos 24 horas a 4 grados centígrados. A continuación, deseche el fijador y agregue 75%etanol, asegurándose de que las muestras estén completamente sumergidas en la solución. Las muestras se pueden almacenar en el etanol a 4 grados centígrados hasta su uso.Dispersar los granos de polen de los mismos cultivares utilizados para las polinizaciones de control en medio de germinación de polen solidificado y observarlos bajo el microscopio después de 24 horas. Prepare las pistolas para la microscopía lavándolas 3 veces con agua destilada durante una hora por lavado. Después del último lavado, déjelos en 5% de sulfito de sodio a 4 grados centígrados durante 24 horas.Luego los autoclave a un kilogramo por centímetro cuadrado durante 10 minutos en sulfito de sodio para suavizar el tejido. Coloque las pistolas autoclavadas sobre un tobogán de vidrio y use un bisturí para eliminar los tricomas alrededor del ovario. A continuación, aplastar la pistola con un vaso de cubierta.Aplique una gota de azul anilina sobre las preparaciones para manchar las deposiciones insensibles durante el crecimiento del tubo de polen y observar los tubos de polen a lo largo del estilo con un microscopio de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Utilice un kit comercial para extraer ADN genómico de hojas jóvenes recogidas en la primavera. A continuación, configure PCR combinando reactivos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Vortexing la mezcla de reacción y distribución entre los pozos en la placa PCR. Añadir 1 microlitro de la dilución de ADN en cada pozo y ejecutar PCR utilizando el programa de termo-ciclo descrito en el manuscrito. Una vez completada la reacción, analizar los resultados utilizando electroforesis capilar o electroforesis de gel de agarosa.Para la electroforesis capilar añadir 1 microlitro del producto PCR en el pozo de la placa lectora junto con 1 gota de aceite mineral para evitar la evaporación del agua. A continuación, prepare la placa de separación añadiendo el búfer de separación. Utilice el software comercial del analizador de genes para crear una nueva placa de muestra y guardar los nombres de muestra para todos los pozos de la placa.A continuación, seleccione el método de análisis e inserte las dos placas en el analizador de genes. Llene la matriz capilar con agua destilada. Cargue el gel lineal de poliacrilamida y haga clic en Ejecutar.Si analiza los resultados de la PCR con electroforesis de gel, prepare un gel de 1% de agarosa disolviendo la agarosa en el búfer de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. A continuación, agregue 4 microlitros de mancha de ácido nucleico al gel y mezcle suavemente. Configure una bandeja de gel con un peine y ralentite verter el gel en el medio teniendo cuidado de evitar burbujas.Dejar el gel a temperatura ambiente hasta que esté completamente solidificado, unos 30-45 minutos. Luego poner en la cámara de electroforesis. Retire el peine y cúbralo con 1x tampón TAE.Cargue el gel con la escalera de ADN seguido de los productos PCR mezclados con tinte de carga. A continuación, ejecute el gel a 90 voltios durante 60-90 minutos hasta que la línea de tinte azul esté en aproximadamente el 75% del carril de gel. Una vez finalizada la carrera, visualice el gel con un transilluminator.El crecimiento del tubo de polen en las polinizaciones cruzadas y auto-y cruzadas se observó por microscopía de fluorescencia para determinar la auto(in)compatibilidad para cada cultivar. Los cultivares se consideraban autocomen incompatibles cuando el crecimiento del tubo de polen fue arrestado y auto-compatible cuando al menos un tubo de polen alcanzó la base del estilo. Se utilizaron 5 combinaciones de pares de imprimaciones para identificar los alelos S utilizando PCR en combinación con electroforesis capilar o gel.En primer lugar, los S-alleles fueron identificados por la amplificación del primer intrón S-RNase utilizando el par de imprimación SRc. Luego el segundo intrón de la RNase se amplió con tres conjuntos de imprimación para distinguir los alelos S6, S9, S1 y S7. Y las regiones variables V2 y HVB del gen SFB se amplificaron con la imprimación AprFBC8 para identificar los alelos Sc y S8.Una vez identificados los S-alleles, se pueden establecer diferentes grupos de incompatibilidad con los genotipos que son intercomen incompatibles. Es importante recordar el control en la electroforesis capilar, ya que utilizan un sistema de análisis automático de fragmentos que puede reportar como más diferencias en el tamaño del fragmento causando la identificación inexacta del alelo. La combinación de observaciones de microscopía y análisis genéticos ha dado como resultado un enfoque muy útil para determinar la autoincompatibilidad en el albaricoque y establecer las relaciones de incompatibilidad entre los cultivares.La autoincompatibilidad es ahora el vínculo con los lugareños en el albaricoque. La determinación de los factores parece estar involucrada. El esfuerzo futuro debe centrarse en la edificación genética de este cultivar en albaricoque.La combinación de este enfoque documental se traduce en información valiosa para la selección adecuada de cultivares en huertos comerciales y genotipos de patrones en programas de cría de albaricoque. Un enfoque similar se puede utilizar en otros cultivos perennes leñosos.

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Research

Investigación

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