Monitoreo del pH extracelular en biopelículas entre reinos mediante microscopía confocal

El protocolo presenta un método fácil de realizar para el cultivo de biopelículas entre reinos que consisten en StreptococcuS. mutans y Candida albicans. La posterior ratiometría de pH basada en microscopía confocal permite un monitoreo preciso de los desarrollos de pH dentro de la matriz extracelular de esas biopelículas.

La elección cuidadosa de los parámetros de adquisición de imágenes es de suma importancia para obtener datos de imagen con contraste suficiente para su posterior análisis. La ratiometría de pH es un método rápido, preciso y económico para estudiar los gradientes de pH horizontales y verticales en biopelículas entre reinos en tiempo real. La ratiometría de pH también se puede realizar en biopelículas puramente fúngicas y bacterianas.

El método contribuye a aumentar nuestra comprensión del metabolismo microbiano en biopelículas. Demostrando el procedimiento para el crecimiento del biofilm estará Anette Aakjaer Thomsen, una técnica de mi laboratorio. Cultivar S.mutans y C.albicans en placas de agar de sangre a 37 grados celsius en condiciones aeróbicas.

Luego transfiera colonias individuales de cada organismo a tubos de ensayo llenos de cinco mililitros de infusión cerebral y creció durante 18 horas adicionales. Al día siguiente, centrifugar las culturas a 1.200 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en solución salina fisiológica y ajustar el OD 550 a 0.5 para C.albicans y S.mutans.

A continuación, diluya la suspensión S.mutans de uno a 10 para lograr concentraciones equivalentes. Pipetear 50 microlitros de solución salival estéril en los pozos de una placa de 96 pozos inferior óptico para microscopía. Incubar la placa durante 30 minutos a 37 grados Celsius, luego lavar la placa tres veces con 100 microlitros de solución salina fisiológica estéril y vaciar los pozos.

Añadir 100 microlitros de C.albicans suspensión a cada pozo, incubar la placa a 37 grados Celsius durante 90 minutos, luego lavar el pozo tres veces con solución salina. A continuación, añadir 100 microlitros de suero bovino fetal inactivado por calor a cada pozo. Incubar el plato durante dos horas, luego lavarlo tres veces con solución salina.

Vacíe los pozos pero deje un depósito de 20 microlitros para evitar fuerzas de cizallamiento excesivas. Añadir 100 microlitros de suspensión S.mutans y 150 microlitros de BHI con 5% de sacarosa a cada pozo. Luego incubar la placa a 37 grados celsius durante 24 horas o más.

Cuando cultiva biopelículas más antiguas, sustituya el medio diariamente. Al final de la fase de crecimiento del reino cruzado, lave la placa cinco veces con solución salina fisiológica estéril. Para obtener imágenes de pH ratiométricas, utilice un microscopio de escaneo láser confocal invertido con una lente de inmersión de aceite o agua 63X, una línea láser de 543 nanómetros y un sistema de imágenes espectrales.

Utilice una incubadora para calentar la etapa del microscopio a 35 grados centígrados. Establezca el detector para la detección simultánea de fluorescencia verde de 576 a 608 nanómetros y fluorescencia roja de 629 a 661 nanómetros. A continuación, elija una potencia láser adecuada y ganar para evitar la sobreexposición y la subexposición.

Establezca el tamaño del agujero en una unidad de aire o una rebanada óptica de aproximadamente 0,8 micrómetros. A continuación, establezca el tamaño de la imagen en 512 por 512 píxeles y la velocidad de escaneo en dos. Elija un promedio de línea de dos utilizando la opción media.

Preparar 100 microlitros de solución salina fisiológica estéril con 0,4% de glucosa valorada a pH siete. A continuación, haga una solución de stock de C-SNARF-4 y agregue el tinte a una concentración final de 30 micromolares. Vacíe uno de los pozos con la biopelícula entre reinos dejando un depósito de 20 microlitros y agregue la solución salina con glucosa y tinte ratiométrico.

Coloque la placa en la etapa del microscopio y comience a tomar imágenes. Preparar una serie de 50 tampón MES mililolar valorado a pH de cuatro a 7,8 en incrementos de 0,2 unidades de pH a 35 grados centígrados. Pipetear 150 microlitros de cada solución tampón en los pozos de una placa de 96 pozos inferior óptico.

Agregue el tinte a los pozos llenos de tampón a una concentración de 30 micromolares y déjelo equilibrar durante cinco minutos. Caliente la etapa del microscopio a 35 grados Celsius y elija los mismos ajustes que para las imágenes de pH ratiométricas descritas anteriormente. Coloque la placa de 96 pozos en la etapa del microscopio y concéntrese en la parte inferior de los pozos.

Adquiera imágenes de canal verde y rojo para todas las soluciones de búfer. A intervalos regulares, tome imágenes con el láser apagado para corregir el desplazamiento del detector. Realice el experimento de calibración triplicado y exporte todas las imágenes como archivos TIFF.

Almacene las imágenes verdes y rojas en carpetas separadas y cambie el nombre de ambas series de archivos con números secuenciales. Importe las imágenes a un software de análisis de imágenes dedicado como ImageJ. En las imágenes tomadas con el láser apagado, haga clic en analizar e histograma para determinar la intensidad media de fluorescencia.

Restar este valor de las imágenes de biopelícula haciendo clic en proceso, matemáticas y restar. A continuación, importe las dos series de imágenes en margarita y realice una segmentación basada en umbrales de las imágenes de canal rojo haciendo clic en segmento, segmentación automática y umbral personalizado. Establezca el umbral bajo por encima de la intensidad de fluorescencia del citoplasma fúngico y el umbral alto por debajo de la intensidad de las paredes celulares de los hongos y las bacterias.

A continuación, transfiera la capa de objetos de la serie de imágenes segmentadas a la serie de imágenes de canal verde haciendo clic en segmentar y transferir capa de objeto. Elimine los píxeles que no sean de objeto en la serie de canales rojo y verde. Ahora las imágenes de biopelículas se borran de las células bacterianas y fúngicas y se pueden exportar como archivos TIFF.

Importe la serie de imágenes de nuevo a ImageJ y divida la serie de imágenes rojas por sí misma. A continuación, multiplique el resultado por la serie de imágenes original. La serie de imágenes resultante es idéntica a la original, excepto que se eliminan todos los píxeles de intensidad cero.

Repita el proceso con la serie de imágenes verdes. A continuación, utilice el filtro medio en ambas series de imágenes para compensar el ruido del detector. Divida el verde por la serie de imágenes rojas que, a continuación, produce la relación verde-rojo para todos los píxeles del objeto.

Biopelículas robustas entre reinos desarrolladas en las placas de pozo después de 24 y 48 horas. Células individuales y cadenas de S.mutans agrupados alrededor de hifas fúngicas y grandes espacios intracelulares indicaron la presencia de una matriz voluminosa. El pH en el espacio extracelular se visualizó mediante una tabla de búsqueda.

El pH extracelular en las biopelículas cayó rápidamente en los primeros cinco minutos después de la exposición a la glucosa. A partir de entonces, la acidificación se desaceleró típicamente alcanzando valores de 5.5 a 5.8 después de 15 minutos. Debido a los cambios de pH locales, la intensidad de la fluorescencia en las biopelículas cambió con el tiempo.

Durante la segmentación de la imagen, se eligieron umbrales altos y bajos para eliminar adecuadamente todas las áreas cubiertas por células bacterianas y fúngicas. Las áreas azules y verdes fueron eliminadas por los umbrales bajos y altos respectivamente. La cuidadosa elección de los parámetros de adquisición de imágenes es crucial para obtener un buen contraste entre las células bacterianas, las células fúngicas y la matriz de biopelículas.

Si las biopelículas entre reinos se cultivan en células de flujo, los desarrollos de pH se pueden monitorear bajo condición de flujo imitando a los de la cavidad oral. la ratiometría de pH se ha empleado para identificar áreas locales en biopelículas dentales con un pH particularmente bajo, llamados puntos críticos acidogénicos.