Name: Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a evaluar inhibidores migrastáticos en modelos 3D de glioma mediante microscopía confocal de alta resolución. Este protocolo permite analizar con precisión la eficacia de fármacos en entornos tumorales más realistas.

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Nos gustaría dar las gracias al profesor Chris Jones por contribuir con la línea celular KNS42. El microscopio confocal Zeiss LSM880 con AiryScan utilizado en este trabajo es parte del Proyecto de Innovación e Incubación de Huddersfield (HIIP) financiado a través del Acuerdo de Crecimiento de la Asociación Empresarial de la Región de la Ciudad de Leeds (LEP). Crédito para la imagen del microscopio Figura 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

1. Generación de esferoides celulares
Día 1
<ol><li>Prepare el medio de cultivo estándar según lo requiera la línea celular bajo investigación.</li>
	<li>Llevar a cabo todos los pasos asociados al cultivo de tejido en una campana de cultivo de tejido utilizando técnicas de manejo estéril.</li>
	<li>Triptiza y cuenta las células cancerosas. Utilice 20 ml de suspensión celular por placa. Mantenga las suspensiones celulares en tubos universales estériles claramente etiquetados.</li>
	<li>Agregue un número predeterminado de celdas a cada pocal. Tanto el número inicial de células como el tamaño final de los esferoides requeridos depende de la tasa de proliferación de la línea celular que se está investigando. NOTA: Para las líneas celulares de glioma establecidas como U251 y KNS429,10, 5 x 103 células/ml producirán un esferoide microscópicamente visible (200 u 800 m) después de 4 días de incubación.</li>
	<li>Resuspenda las células en tubos universales mediante una inversión suave para evitar el aglutinamiento celular. Pipetear 200 l de la suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos. Si no se requieren todos los pozos, es aconsejable añadir 200 éL de 1x PBS a cada pozo vacío para evitar la evaporación.</li>
	<li>Incubar las células en una incubadora de forma normal a 37 oC. NOTA: Las líneas celulares como las líneas celulares del cáncer de glioma formarán esferoides dentro de 24 h. Permitir que se forme la arquitectura celular 3D incubando el esferoide durante 72 h.</li>
</ol>Día 2
<ol start="7"><li>Compruebe las células mediante microscopía de campo brillante después de 24 h. Dependiendo de la línea celular, las células pueden haber formado un esferoide detectable en la parte inferior del pozo. NOTA: Las líneas celulares de cáncer de glioma establecidas forman fácilmente esferoides dentro de las 24 h. Las líneas celulares de cáncer de glioma derivadas del paciente pueden tardar hasta 1-2 semanas.</li>
</ol>2. Ensayo de invasión de colágeno
Día 3
<ol><li>Colocar colágeno, medio de cultivo 5x, 1 M NaOH y un tubo de 20 ml sobre hielo.</li>
	<li>Añadir con cuidado y lentamente 10,4 ml de colágeno frío en un tubo de cultivo refrigerado. Evite las burbujas. Esta cantidad de colágeno es suficiente para una placa de 96 pocillos. La ampliación es posible, pero se recomienda preparar un tubo de 20 ml por placa a la vez.</li>
	<li>Añadir suavemente 1,52 ml de medio de cultivo 5x estéril frío. Evite las burbujas.</li>
	<li>Justo antes de su uso, agregue suavemente 72 ml de frío estéril 1 M NaOH. Mantenga la solución en hielo.</li>
	<li>Mezcle suavemente pipeteando. Evite las burbujas. La mezcla eficiente conduce a un cambio de color (de rojo a rojo anaranjado (pH 7.4) en el medio. Deje la mezcla sobre hielo hasta su uso.</li>
	<li>Paso crucial: Retire 190 ml de sobrenadante de la placa de 96 pocillos preparada en el día 1. Tenga mucho cuidado de no molestar a los esferoides que se formaron en la parte inferior del pozo. Utilice la pipeta en un ángulo hacia el lado, no el centro, del pozo.</li>
	<li>Agregue suavemente 100 s de la mezcla de colágeno a cada poca. Para evitar cualquier perturbación esferoide, pipetee la mezcla por el lado del pozo. Evite las burbujas. Mantenga cualquier mezcla de colágeno restante en el tubo de 20 ml a temperatura ambiente para evaluar la polimerización.</li>
	<li>Incubar la placa en la incubadora durante al menos 10 minutos para permitir que el colágeno se polimerice. Como pauta, si el colágeno sobrante se ha puesto, convirtiéndose en semisólido y similar a una esponja, los esferoides están listos para ser tratados con inhibidor.</li>
	<li>Añadir los fármacos o inhibidores a la concentración 2x al medio de cultivo. Añadir el medio suavemente a cada pocal (100 ml por pozo). Una vez más, pipetear el medio por el lado del pozo para evitar la perturbación de los esferoides.</li>
	<li>Observe e ilumine cada esferoide mediante microscopía de campo brillante a veces T a 0 h, 24 h, 48 h y 72 h para evaluar la actividad del fármaco. A continuación, devuelva la placa a la incubadora. NOTA: Dependiendo del comportamiento invasivo de la línea celular, la migración lejos del núcleo esferoide original se puede observar a partir de las 24 horas en adelante.</li>
</ol>3. Preparación de esferoides integrados de colágeno y células migratorias para microscopía confocal
<ol><li>Coloque la placa en una capucha de cultivo de tejido y retire suavemente el sobrenadante (200 l). Una vez más, tenga cuidado de no molestar al esferoide y evitar tocar el colágeno, ya que esto puede interferir con el tapón de colágeno.</li>
	<li>Sustituya el sobrenadante por 100 s de 1pbS. Repita este paso de lavado 3x.</li>
	<li>Retire el lavado final y sustitúyalo con un 4% de formaldehído en 1PBS (100 ml por poca). PRECAUCION: El formaldehído es un carcinógeno potencial. Manipule con cuidado de acuerdo con las pautas de salud y seguridad.</li>
	<li>Coloque la placa de 96 pocillos en un banco de laboratorio, cubra con papel de aluminio y déjela durante 24 horas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el formaldehído y sustitúylo por 1pbS. Repita este 1x lavado PBS 3x.</li>
	<li>Preparar 0.1% Triton X-100 en 1x PBS. Retire el lavado de 1x PBS y sustitúyalo por 100 ml de la solución Triton X-100. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo con 1 x PBS y 0.05% leche desnatada en polvo y mezcle bien.</li>
	<li>Retire Triton X-100 y lave 3x con 1pbS. Añadir 100 sL de solución de bloqueo a cada poca y incubar durante 15 min.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo primario requerido en el tampón de bloqueo a la concentración predeterminada. Aquí, utilice anticuerpo anti-ratón IgG acetilado de tubulina (1:100).</li>
	<li>Centrifugar la mezcla tampón de bloqueo de anticuerpos primaria durante 5 min a 15.682 x g. Retire con cuidado la solución de bloqueo y agregue el sobrenadante (25 x 50 l) a cada poca. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Retire la solución de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).</li>
	<li>Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración recomendada o predeterminada, además de las manchas fluorescentes adicionales. Aquí, utilice 1:500 anti-ratón fluoróforo-488 anticuerpo conjugado, faloidin-594 (1:500) para la tinción de la actina, y la mancha de ADN (DAPI).</li>
	<li>Una vez más, centrifugar la solución de anticuerpos secundarios durante 5 min a 13.000 rpm.</li>
	<li>Retire la solución de bloqueo de cada pocal y añada 25 x 50 l de la mezcla secundaria de anticuerpos/phalloidin/DAPI. Incubar en la oscuridad durante 1,5 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire la solución secundaria de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).</li>
	<li>Levante con cuidado tapones de colágeno individuales mediante succión con una pipeta de plástico (200 l) en el centro de un portaobjetos de vidrio liso de alta calidad.</li>
	<li>Agregue una gota de un mountante adecuado al tapón de colágeno, asegurándose de que el enchufe esté completamente cubierto. Evite las burbujas.</li>
	<li>Aplicar el cubreobjetos del espesor óptimo para el objetivo del microscopio que se utilizará para la toma de imágenes y permitir que se ajuste durante la noche. Guarde los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
</ol>4. Microscopía de fluorescencia
<ol><li>Capture imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal adecuado.</li>
</ol>

<ol><li>Gandalovičová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrastatics-anti-metastatic+and+anti-invasion+drugs%3A+promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrastatics-anti-metastatic and anti-invasion drugs: promises and challenges.</a> Trends in Cancer. 3 (6), 391-406 (2017).</li>
<li>Delgado-López, P. D., Corrales-García, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18, 1062(2016).</li>
<li>Foreman, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virotherapy+for+the+treatment+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virotherapy for the treatment of malignant glioma.</a> Neurotherapeutics. 14, 333(2017).</li>
<li>Rodrigues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+tumor+spheroids+technologies+for+3D+in+vitro+cancer+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics+Technologies%22%5BJournal%5D)">Emerging tumor spheroids technologies for 3D in vitro cancer modelling.</a> Pharmacology and Therapeutics Technologies. 184, 201-211 (2018).</li>
<li>Sirenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+assays+for+characterizing+the+viability+and+morphology+of+3D+cancer+spheroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), Mary Ann Liebert, Inc. (2015).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bionic+3D+spheroids+biosensor+chips+for+high-throughput+and+dynamic+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Bionic 3D spheroids biosensor chips for high-throughput and dynamic drug screening.</a> Biomedical Microdevices. 20, 82(2018).</li>
<li>Mosaad, E., Chambers, K. F., Futrega, K., Clements, J. A., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+a+high-throughput+3D+prostate+cancer+spheroid+and+drug-testing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: a high-throughput 3D prostate cancer spheroid and drug-testing platform.</a> Scientific Reports. 8, 253(2018).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Any+way+you+slice+it-a+comparison+of+confocal+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54-65 (2015).</li>
<li>Pontén, J. Neoplastic human glia cells in culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPont%C3%A9n%2C+J+%22Human+Tumor+Cells+in+Vitro%22">Human Tumor Cells in Vitro</a>. , Springer US. Boston. 175-206 (1975).</li>
<li>Takeshita, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+an+established+human+glioma+cell+line%2C+KNS-42%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologica+Medico+Chirurgica%22%5BJournal%5D)">Characteristics of an established human glioma cell line, KNS-42.</a> Neurologica Medico Chirurgica. 27 (7), 581-587 (1987).</li>
<li>Bance, B., Seetharaman, S., Leduc, C., Boëda, B., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+acetylation+but+not+detyrosination+promotes+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule acetylation but not detyrosination promotes focal adhesion dynamics and cell migration.</a> Journal of Cell Science. 132, (2019).</li>
<li>Bacon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+3+indirectly+modulates+tubulin+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 3 indirectly modulates tubulin acetylation.</a> Biochemical Journal. 472, 367-377 (2015).</li>
<li>Jackman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+infiltration+in+paediatric+glioma+using+histone+deacetylase+inhibitors%2C+a+promising+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tackling infiltration in paediatric glioma using histone deacetylase inhibitors, a promising approach.</a> Neuro-Oncology. 20, i19-i19 (2018).</li>
<li>Bhandal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+migration+with+the+histone+deacetylase+inhibitor+MI192%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma migration with the histone deacetylase inhibitor MI192.</a> Neuro-Oncology. 19, i12-i12 (2017).</li>
<li>Del Duca, D., Werbowetski-Ogilvie, T. E., Del Maestro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+preparation+from+hanging+drops%3A+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> Journal of Neuro-oncology. 67 (3), 295-303 (2004).</li>
<li>Bender, B. F., Aijian, A. P., Garrell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+microfluidics+for+spheroid-based+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Digital microfluidics for spheroid-based invasion assays.</a> Lab on a Chip. 16 (8), 1505-1513 (2016).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three+dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Härmä, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dynamic+morphological+drug+responses+in+3D+organotypic+cell+cultures+by+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of dynamic morphological drug responses in 3D organotypic cell cultures by automated image analysis.</a> PLOS ONE. 9 (5), e96426(2014).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Se describe una forma novedosa de crear esferoides de células cancerosas para la identificación de la actividad de los medicamentos migratorios mediante microscopía confocal de alta resolución. El uso de placas de bajo adherente sobre otras técnicas, como las gotas colgantes15,ha facilitado un medio de generación de esferoides reproducibles y uniformes para su uso en los ensayos de migración e invasión de colágeno. Los puntos críticos de este protocolo son la eliminación del medio de crecimiento d...

Las tecnologías de esferoides tridimensionales para el descubrimiento de fármacos preclínicos y el desarrollo de fármacos potenciales contra el cáncer se están favoreciendo cada vez más con las pantallas de fármacos convencionales; por lo tanto, hay más desarrollo de medicamentos migratorios —prevención de migración e invasión—. Los fundamentos de estos desarrollos en el tratamiento del cáncer son claros: los ensayos de esferoides 3D representan un enfoque más realista para la detección de posibles fármacos contra el cáncer, ya que imitan la arquitectura de tumores 3D más fielmente que las culturas monocapa celular, recapitular las interacciones droga-tumor (cinética) con mayor precisión, y permitir la caracterización de la actividad farmacológica en un entorno relacionado con el tumor. Además, el aumento de la resistencia a los medicamentos quimiotóxicos en muchos tipos de cáncer y las altas tasas de mortalidad entre los pacientes con cáncer debido a la metástasis potenciada por la capacidad de las células cancerosas para migrar a sitios tumorales distantes apoya la inclusión de agentes quimioterápicos el potencial migratorio de las células cancerosas como tratamiento adyuvante en futuros ensayos clínicos de cáncer1. Este es particularmente el caso en cánceres altamente invasivos, como los glioblastomas de alto grado (GBM). El manejo de GBM incluye cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, incluso con el tratamiento combinado, la mayoría de los pacientes recaen dentro de 1 año del diagnóstico inicial con una mediana de supervivencia de 11-15 meses2,3. En los últimos años se han realizado enormes avances en el campo de la tecnología 3D: sistemas rotativos, estructuras microfabricadas y andamios 3D, y otros ensayos individuales se están mejorando continuamente para permitir realizar pruebas rutinarias a gran escala4, 5,6,7. Sin embargo, los resultados obtenidos de estos ensayos deben analizarse de manera significativa porque la interpretación de datos a menudo se ve obstaculizada por los intentos de analizar datos generados por 3D con sistemas de análisis de imágenes 2D.
A pesar de ser preferible en términos de velocidad de adquisición de imagen y reducción de la fototoxicidad, la mayoría de los sistemas de campo ancho siguen estando limitados por la resolución8. Por lo tanto, aparte de las lecturas de datos relacionadas con la eficacia de los medicamentos, los efectos detallados de la acción del fármaco en las estructuras celulares 3D de las células migratorias se pierden inevitablemente si se imágen utilizando un sistema de campo amplio. Por el contrario, la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) captura imágenes de alta calidad seccionadas ópticamente que se pueden reconstruir y renderizar en 3D después de la adquisición utilizando software informático. Por lo tanto, CLSM es fácilmente aplicable a las estructuras celulares 3D complejas de imágenes, lo que permite el interrogatorio de los efectos de los inhibidores antimigrastres en las estructuras 3D y análisis en profundidad de los mecanismos de migración celular. Esto sin duda guiará el desarrollo futuro de fármacos migratorios. Aquí, se describe un flujo de trabajo combinado de generación de esferoides, tratamiento de fármacos, protocolo de tinción y caracterización mediante microscopía confocal de alta resolución.

<table><tbody><tr><td>Colágeno I, cola de rata, 100 mg</td><td>354236 Corning</td><td></td><td>para el ensayo de invasión del glioma; esto es ofrecido por muchos distribuidores/fabricantes y deberá determinarse tanto para el tipo de ensayo previsto como para las líneas celulares utilizadas. Para las líneas celulares de cáncer de glioma, la cola de rata de colágeno tipo 1 (por ejemplo, Corning) es la opción preferida. El colágeno debe almacenarse a 4 & grados; C, en la oscuridad, hasta que sea necesario. No es aconsejable mezclar colágeno de diferentes lotes, ya que esto puede afectar la consistencia del colágeno polimerizado. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>varios</td><td>varios para</td><td>imágenes de microscopía</td></tr><tr><td>DMEM polvo</td><td>Sigma</td><td>D5648</td><td>necesarios a una concentración 5x para la solución de colágeno para el ensayo de invasión de glioma; &nbsp; Puede adquirirse en forma de polvo, en agua bidestilada y, dependiendo de la composición final del medio de crecimiento, completarse con los aditivos necesarios. La solución completa 5x debe filtrarse a través de un sistema de filtro de jeringa (0.22 &mu; m) antes de su uso.</td></tr><tr><td>Suero fetal de ternero</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td>necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>de</td> vidrio <td>varios varios para</td><td>imágenes de microscopía</td></tr><tr><td>DMEM de alta glucosa</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma</td></tr><tr><td>Inhibidor</td><td>Tocris</td><td>varios</td><td>varios, de acuerdo con el diseño experimental; Los inhibidores se pueden comprar de fabricantes como Selleckchem y Tocris. Estos fabricantes ofrecen una descripción detallada de las características de los inhibidores, enlaces a referencias asociadas y sugerencias de concentraciones de trabajo. Al igual que con todos los inhibidores, pueden ser potencialmente tóxicos y deben manipularse de acuerdo con las pautas de salud y seguridad. Los inhibidores se preparan como soluciones madre según lo recomendado por el fabricante. Como ejemplo, utilizamos el inhibidor migrastático MI-192 para demostrar el uso de dichos inhibidores. Hemos probado una variedad de inhibidores migratorios de esta manera con resultados comparables.</td></tr><tr><td>Montaje</td><td>varios</td><td>varios</td><td>para imágenes microscópicas</td></tr><tr><td>NaOH (1 M)</td><td>varios&nbsp;</td><td>varios</td><td>NaOH se pueden comprar en la molaridad requerida o prepararse a partir de forma sólida. La solución preparada debe esterilizarse con un filtro utilizando un sistema de filtro de jeringa. Un M NaOH es corrosivo y se debe tener cuidado durante la preparación de la solución.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>varios</td><td>varios</td><td>varios para la fijación de esferoides y células; hacer al 4%, precaución peligro para la salud, asegurarse de que se cumplan las normas de salud y seguridad para la solución de colágeno para el ensayo de invasión</td></tr><tr><td>Pastettes (pipeta graduada, 3 mL)</td><td>varios</td><td>varios</td><td>varios para el ensayo de invasión, eliminación de solución</td></tr><tr><td>PBS, estéril para cultivo de tejidos</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td>necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma y lavados para tinción</td></tr><tr><td>Pluma/estreptococo (antibióticos)</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>necesario para el cultivo celular de líneas celulares de glioma</td></tr><tr><td>Anticuerpo primario, anticuerpo secundario, DAPI, faloidina</td><td>varios</td><td>varios hay</td><td>muchos fabricantes de estos reactivos, para anticuerpos marcados secundarios recomendamos Alexa Fluor (sondas moleculares). Aquí utilizamos para los anticuerpos primarios el anticuerpo de tubulina antiacetilada de ratón (1/100, Abcam). Para los anticuerpos secundarios se utilizó el anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488 anti-ratón 1/500, Molecular Probes. Para la tinción nuclear se utilizó DAPI (muchos fabricantes) y la tinción de actina Phalloidin (muchos fabricantes), ambas utilizadas con la dilución recomendada de 1/500.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>necesario para la solución de colágeno para el ensayo de invasión del glioma a una concentración 5x</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td>necesario para la solución de colágeno para el ensayo de invasión del glioma a una concentración 5x</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>para la tripsinización</td></tr><tr><td>Placas de fijación ultra bajas Sigma</td><td>/Nunc</td><td>CLS7007-24EA</td><td>para el ensayo de invasión de glioma; Se requiere una placa de baja adherencia, y se prefieren placas de 96 pocillos para permitir el cribado a gran escala de los compuestos bajo investigación. Hay varias placas de baja adherencia disponibles comercialmente; Es aconsejable probar una variedad de placas para una generación óptima de esferoides. En nuestra experiencia, Costar Ultra Low Cluster con tapa, fondo redondo, funciona mejor para la generación de esferoides a partir de células de cáncer de glioma en términos de 100% de formación de esferoides y reproducibilidad. Estas placas también se utilizaron con éxito para la generación de esferoides de glioma a partir de material derivado del paciente, células de cáncer de vejiga y ovario en nuestro laboratorio. Además, en estas placas se pueden utilizar neuroesferas madre o progenitoras para facilitar la generación de neurosferas-esferoides estandarizadas</td></tr><tr><td>Stripettes (pipetas serológicas, estériles, 5 mL y 10 mL)</td> <td>varias, por ejemplo, Costar</td><td>CLS4488-50; CLS4487-50</td><td>para el cultivo de tejidos y la preparación de colágeno</td></tr><tr><td>Varios multicanal (50 - 250 &mu; L) y pipetas monocanal (10 &mu; L, 50 y mu; L, 200 &mu; L 1 mL)</td><td>varios</td><td>varios</td><td>para el manejo de células y esferoides</td></tr><tr><td>Microscopía de campo amplio</td><td>varios&nbsp;</td><td>varios</td><td>para la observación de la generación de esferoides y la obtención de imágenes de esferoides; aquí se capturaron imágenes de fluorescencia de campo amplio utilizando un sistema de imágenes celulares EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880 CLSM equipado con un objetivo de aceite Plan Apochromat 63x 1.4 NA</td><td>Zeiss</td><td>cita del fabricante</td><td>Las imágenes confocales se capturaron utilizando un Zeiss LSM 880 CLSM equipado con un objetivo de aceite Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Se utilizaron láseres de diodo de 405 nm, 458/488/514 nm de argón multilínea y HeNe de 594 nm para excitar Phalloidin 594, Alexa Fluor 488 y DAPI respectivamente. Para cada imagen se capturó una única sección óptica representativa, con todos los ajustes, tanto antes como después de la captura de la imagen, con fines comparativos. Todas las imágenes se procesaron posteriormente utilizando el software de imagen Zen asociado y Adobe Photoshop.</td></tr></tbody></table>

caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3d por microscopía confocal de alta resolución

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

El descubrimiento y desarrollo de fármacos en la investigación del cáncer se basa cada vez más en pantallas de drogas en un formato 3D. Se están descubriendo nuevos inhibidores dirigidos al potencial migratorio e invasivo de las células cancerosas, y en consecuencia a la propagación metastásica de la enfermedad, y se consideran tratamientos complementarios en cánceres altamente invasivos como los gliomas. Por lo tanto, se requiere generar datos que permitan el análisis detallado de las células en un entorno 3D después de la adición de un medicamento. La metodología descrita aquí, combinando ensayos de invasión esferoide con captura de imágenes de alta resolución y análisis de datos mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), permitió la caracterización detallada de los efectos del potencial inhibidor antimigratorio MI-192 en células de glioma. Los esferoides se generaron a partir de líneas celulares para ensayos de invasión en placas de 96 pocillos de bajo adherente y luego se prepararon para el análisis de CLSM. El flujo de trabajo descrito se prefirió sobre otras técnicas de generación de esferoides de uso común debido a la facilidad y la reproducibilidad. Esto, combinado con la resolución de imagen mejorada alcanzada por microscopía confocal en comparación con los enfoques convencionales de campo ancho, permitió la identificación y el análisis de cambios morfológicos distintos en las células migratorias en un entorno 3D tratamiento con el fármaco migratorio MI-192.

La tecnología de esferoides tridimensionales está avanzando en la comprensión de las interacciones entre fármacos y tumores porque es más representativa del entorno específico del cáncer. La generación de esferoides se puede lograr de varias maneras; en este protocolo se utilizaron placas de baja adherencia de 96 pocillos. Después de probar varios productos de diferentes fabricantes, las placas utilizadas aquí fueron elegidas porque constantemente tuvieron el mejor desempeño en términos d...

Los efectos de los inhibidores migratorios en la migración de células cancerosas de glioma en ensayos de invasión tridimensionales (3D) utilizando un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) se caracterizan por una microscopía confocal de alta resolución.

Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Este protocolo está demostrando que ahora podemos determinar el efecto de los inhibidores migratorios en detalle en los modelos de cáncer 3D. La principal ventaja es la facilidad y el enfoque todo en uno con el que se puede llevar a cabo esta técnica. Esta técnica permite la evaluación de fármacos migrastáticos en la investigación del cáncer en un entorno 3D, permitiendo la prueba de fármacos en un entorno más relevante para el tumor.Este método se puede aplicar a las pruebas de fármacos citotóxicos en el cáncer o, por ejemplo, para evaluar el efecto de la radiación en la proliferación del cáncer y la migración celular. Es útil practicar el paso de eliminación media y el reemplazo de colágeno con placas ordinarias de 96 pozos para tener confianza. Además, el entrenamiento en un microscopio confocal es esencial.La demostración visual de esta técnica es fundamental para que los investigadores entiendan el manejo delicado requerido de los esferoides y su uso en la microscopía confocal. En el primer día de experimentación, tenga el medio de cultivo estándar, en este caso, U251, listo para la línea celular adecuada. En una capucha de cultivo de tejido, añadir 0,5 mililitros de trippsina en el cultivo para tripsinar las células cancerosas.Contar las células cancerosas en un hemocitoómetro y diluir a una concentración de cinco veces 10 a las terceras células por mililitro. Mantenga las suspensiones celulares en tubos universales estériles claramente etiquetados. Resuspender las células por inversión suave para evitar el aglutinamiento celular.Utilice una pipeta para añadir 200 microlitros del cultivo celular a cada pozo en una placa de 96 pozos. Añadir 200 microlitros de 1X PBS a cada pozo vacío para evitar la evaporación. Incubar las células en una incubadora a 37 grados centígrados.Después de 24 horas, revise las células mediante microscopía de campo brillante. Las líneas celulares como las líneas celulares de cáncer de glioma forman esferoides en la parte inferior del pozo dentro de las 24 horas. Incubar los esferoides durante otras 48 horas para permitir la formación de una arquitectura celular 3D.En el tercer día, coloque el colágeno, el medio de cultivo 5X, el hidróxido de sodio de un molar y un tubo de 20 mililitros sobre hielo. Añadir con cuidado y lentamente 10,4 mililitros de colágeno frío en el tubo de cultivo refrigerado. Evita las burbujas.A continuación, agregue suavemente 1,52 mililitros de medio de cultivo 5X estéril en frío. Evita las burbujas. Justo antes de su uso, agregue suavemente 72 microlitros de hidróxido de sodio un molar estéril en frío y mantenga la solución en hielo.Mezclar suavemente pipeteando y evitando burbujas. La mezcla eficiente conduce a un cambio de color de rojo a rojo anaranjado en el medio. Deje la mezcla sobre hielo hasta su uso.A continuación, para quitar 190 microlitros de sobrenadantes de la placa de 96 pozos preparada en el primer día, utilice una pipeta en un ángulo hacia el lado del pozo. Tenga mucho cuidado de no molestar a los esferoides que se formaron en la parte inferior del pozo. Añadir suavemente 100 microlitros de la mezcla de colágeno a cada pozo, pipeteando por el lado del pozo.Evite las burbujas y cualquier alteración del esferoide. Mantenga cualquier mezcla de colágeno restante en el tubo de 20 mililitros a temperatura ambiente para evaluar la polimerización. Incubar la placa en la incubadora durante al menos 10 minutos para permitir que el colágeno se polimerice.Cuando el colágeno sobrante se vuelve semisólido y similar a una esponja, los esferoides están listos para ser tratados con inhibidor. Añadir los inhibidores a una concentración de 2X a cinco mililitros de medio de cultivo. Pipetear 100 microlitros del medio suavemente por el lado de cada pozo para evitar la alteración del esferoide.Observe e imagine cada esferoide mediante microscopía de campo brillante en momentos de hora cero, 24 horas, 48 horas y 72 horas para evaluar la actividad del fármaco. Luego, devuelva la placa a la incubadora. Ahora, coloque la placa en una capucha de cultivo de tejido, y reemplace suavemente el sobrenadante con 100 microlitros de 1X PBS.Tenga cuidado de no molestar el esferoide, y evite tocar el colágeno. Repita este paso de lavado tres veces más. Retire el lavado final en cada pozo y sustitúyalo con 100 microlitros de 4% de formaldehído en 1X PBS.Coloque la placa de 96 pozos en un banco de laboratorio, cubra con papel de aluminio y déjelo durante 24 horas a temperatura ambiente. Al día siguiente, retire cuidadosamente el formaldehído y sustitúyalo con 1X PBS. Repita este lavado tres veces más.A continuación, sustituya el lavado 1X PBS por 100 microlitros de solución Triton X-100 recién preparada. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo con 50 mililitros de 1X PBS y 05% leche desnatada en polvo en un tubo de 50 mililitros, y mezcle bien.Después de 30 minutos, retire el Triton X-100 y lávelo tres veces con 1X PBS. Añadir 100 microlitros de la solución de bloqueo a cada pozo e incubar durante 15 minutos. A continuación, diluir el anticuerpo acetilado IgG de ratón en el tampón de bloqueo en una proporción de uno a 100.Centrifugar la mezcla tampón de bloqueo de anticuerpos primario durante cinco minutos a 15, 682 veces g. Retire cuidadosamente la solución de bloqueo en cada pozo y agregue de 25 a 50 microlitros del sobrenadante tampón de bloqueo de anticuerpos del tubo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora.A continuación, retire la solución de anticuerpos de cada pozo y lave tres veces con 100 microlitros de 1X PBS. Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración recomendada, además de cualquier mancha fluorescente adicional. Una vez más, centrifugar la solución secundaria de anticuerpos durante cinco minutos a 15, 682 veces g.Retire la solución de bloqueo de cada pozo y agregue de 25 a 50 microlitros del sobrenadante secundario de anticuerpos. Incubar en la oscuridad durante 1 hora y media a temperatura ambiente. Retire la solución secundaria de tinte de anticuerpos y lave tres veces con 1X PBS, 100 microlitros por pozo.Levante cuidadosamente los tapones individuales de colágeno por succión con una pipeta de plástico de 200 microlitros en el centro de un portaobjetos de vidrio. Agregue una gota de un montura adecuado para cubrir el enchufe de colágeno. Coloque un cubreobjetos en la parte superior de la muestra y guárdelo a temperatura ambiente en la oscuridad.La tecnología de esferoides tridimensionales está avanzando en la comprensión de las interacciones fármaco-tumor porque es más representativa del entorno específico del cáncer. En este estudio, se detectaron posibles efectos anti-o pro-migratorios. Esto es especialmente notable en KNS42 con aparentemente ninguna migración en el control o esferoides tratados.Se observó muerte celular en la concentración de inhibidores más alta de 10 micromolares. La fragmentación nuclear y las células migratorias eran evidentes en las células U251. Los esferoides celulares U251 tenían picos que se irradian lejos del esferoide original, con un aumento del redondeo celular en las células aparente con el aumento de la concentración de inhibidores.Se observaron microtúbulos colapsados y fragmentación nuclear en KNS42. Las protuberancias con forma de hoja con picos de una sola célula indican la migración de KNS42. Con la concentración más baja de inhibidores, este fenotipo se pronunció, pero se perdió con el aumento de la concentración de inhibidores.Es crucial dejar todos los reactivos sobre hielo hasta que estén listos. De lo contrario, el colágeno comienza a polimerizarse antes de que todo se haya añadido a los esferoides. Hay margen para cuantificar las imágenes generadas por la microscopía confocal para evaluar los efectos de, por ejemplo, fármacos migrastáticos en la morfología celular.Nos permitió, por primera vez, confirmar el efecto del inhibidor migratorio MI-192 en los niveles de acetilado de microtúbulos y explorarlo más a fondo en términos de migración celular. Se debe tener especial cuidado al manipular el formaldehído para la etapa de fijación. Se aplican las pautas habituales de salud y seguridad.

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Investigación del cáncer

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Los modelos de la invasión de células tumorales en tres dimensiones de la matriz extracelular para reflejar mejor...

Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

Fuente: Guyon, J., et al. Un modelo esferoide 3D para el glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)El video muestra la generación de un modelo esferoide tridimensional de la invasión de células tumorales. Los esferoides se forman a partir de células tumorales cerebrales humanas y se incrustan en una matriz de colágeno. Las células tumorales en la periferia esferoide adoptan un fenotipo invasivo, secretando proteasas para degradar el colágeno y avanzando para invadir la matriz circundante.

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La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

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Caracterización de la migración de la célula en tres dimensiones In Vitro herida ambientes

Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.

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El microambiente tumoral es una parte esencial del crecimiento del cáncer y la invasión. Para imitar la progresión del carcinoma, se necesita una matriz humana biológicamente relevante. Este Protocolo introduce una mejora para el ensayo de invasión de esferoide tridimensional in vitro aplicando una matriz basada en Leiomioma humana. El protocolo también introduce un análisis de invasión celular basado en computadora.

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El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de un dispositivo de imágenes esferoides. Este dispositivo permite imágenes dinámicas o longitudinales de fluorescencia de esferoides de células cancerosas. El protocolo también ofrece un procedimiento simple de procesamiento de imágenes para el análisis de la invasión de células cancerosas.

Imágenes y análisis de fluorescencia resueltos en el tiempo de la invasión de células cancerosas en el modelo esferoide 3D

Aprende a evaluar inhibidores migrastáticos en modelos 3D de glioma mediante microscopía confocal de alta resolución. Este protocolo permite analizar con precisión la eficacia de fármacos en entornos tumorales más realistas.

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Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

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