Name: Entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de Rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende a realizar entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de rata mediante implantación de catéter. Este protocolo seguro y económico permite evaluar farmacocinética y eficacia de terapéuticos novedosos.

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Nos gustaría dar las gracias a Ionis Pharmaceuticals por suministrar las ASOs descritas en el artículo.

Todos los procedimientos in vivo se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC, por sus cuales) del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC, por sus cuales) siguen las directrices establecidas por la guía de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Preparación de materiales e instrumentos
<ol><li>Prepare las cánulas de guía especiales.<ol>
<li>Utilice una herramienta giratoria con rueda de corte (o una sierra afilada) para cortar los dos extremos de una aguja de 19 G, lo que resulta en una cánula guía de 1,5 x 2 cm de largo(Figura 1Aiii). Utilice la rueda de rectificación de la herramienta giratoria para suavizar los dos extremos. NOTA: Alternativamente, las cánulas guía prefabricadas y estériles se pueden comprar a un proveedor comercial(Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el conjunto de catéter/alambre.<ol>
<li>Corte una pieza de 8 cm de largo de tubo PE-10 (tubo de polietileno, diámetro 0.011 pulgadas) para servir como catéter intratecal. Haga una marca a 2 cm de un extremo con un rotulador resistente al etanol. Corte un alambre de estilo de 11 cm de largo de alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno. Inserte el alambre de estilización(Figura 1Aii) en el lumen del catéter PE-10 (Figura 1Ai). NOTA: Se necesita un conjunto de conjunto de catéter/alambre(Figura 1Av) para cada animal. Alternativamente, los catéteres y alambres de estilo se pueden comprar a un proveedor comercial(Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el conjunto del catéter de entrega.<ol>
<li>Cortar un trozo de catéter PE-50 (5 x 10 cm, tubo de polietileno, diámetro 0,023 pulgadas)(Figura 1Bi). A un extremo del catéter PE50 inserte un adaptador de tubo de 23 G(Figura 1Biv). Este extremo se conectará a una jeringa de 100 ml(Tabla de materiales)durante la cirugía. Inserte una aguja modificada de 30 G con el cubo cortado(Figura 1Biii) en una pieza de aproximadamente 0,5 cm de tubo PE-10(Figura 1Bii)y conecte el tubo PE-10 al otro extremo del catéter.</li>
		<li>El extremo de la aguja de 30 G del conjunto del catéter de entrega(Figura 1Bv) se conectará al extremo distal del catéter PE-10 implantado en la rata durante la cirugía. NOTA: Alternativamente, el conjunto del catéter de entrega(Figura 1Bv) se puede comprar a un proveedor comercial(Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare el conjunto de la cannula-aguja guía(Figura 1Avi)colocando una cánula guía(Figura 1Aiii)sobre el extremo de una aguja de 23 G.</li>
	<li>Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos, incluida la cánula guía y los conjuntos de alambre/catéter utilizando un esterilizador de óxido de etileno durante 12 h. NOTA: Todos los instrumentos quirúrgicos excepto el catéter pueden ser autoclavedos; catéter se derretirá a alta temperatura.</li>
</ol>2. Preparación de la cirugía
NOTA: Este procedimiento se realiza rutinariamente en ratas Sprague Dawley machos y hembras con pesos corporales entre 200 g y 400 g. Dos ratas se alojan por jaula bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso gratuito a alimentos y agua.
<ol><li>Peso de una rata y colóquela en una cámara de isoflurano para inducir anestesia (1-5% de isoflurano en O2,valorado a efecto). NOTA: La rata se anestesia continuamente con isoflurano para mantener la anestesia profunda a través de un cono nasal durante todo el procedimiento. Se puede utilizar un método de anestesia alternativo (por ejemplo, administración de ketamina 100 mg/kg y xilazina 10 mg/kg) según lo aprobado por la IACUC.</li>
	<li>Cuando la rata no responda a un pellizco de dedo del pie, afitúe la espalda de la cola a la columna torácica caudal y coloque la rata arasda en la sábana estéril colocada encima de una almohadilla de calentamiento.</li>
	<li>Coloque un tubo centrífugo cónico de 50 ml debajo del abdomen de la rata para flexionar la columna vertebral en la región lumbar(Figura 2A)y aplicar un pomada oftálmica a los ojos.</li>
	<li>Inyectar buprenorfina de liberación sostenida (1,0 mg/kg; Tabla de Materiales) por vía subcutánea en la rata. Limpie la piel expuesta con povidona alterna y exfoliantes de alcohol y repita esto tres veces. NOTA: Un alivio alternativo del dolor se puede utilizar según lo aprobado por el protocolo IACUC.</li>
	<li>Cubra al animal con una cortina transparente estéril que ha sido fenesada sobre el sitio quirúrgico.</li>
</ol>3. Cirugía
<ol><li>Con la rata apoyada por el tubo cónico de 50 ml, identifique los dos pozos naturales entre los músculos por encima de la pelvis (flechas en la Figura 2A). Con una mano sosteniendo esos hoyos, utilice la otra mano para presionar suavemente y sentir la columna vertebral de la dirección caudal a rostral y encontrar la primera sangría importante entre las vértebras y este es el espacio intervertebral entre las vértebras S1 y L6(Figura 2B ).</li>
	<li>Muévase ligeramente rostrally para identificar la siguiente sangría, el espacio intervertebral entre las vértebras L5 y L6 y el lugar de inyección (* en la Figura 2A). Utilice un bisturí para hacer una incisión de no más de 2 cm de largo en la piel a lo largo de la línea media de rostral a caudal para que el lugar de inyección esté en el centro de la incisión (línea punteada en la Figura 2A).</li>
	<li>Utilice tijeras de disección para diseccionar el tejido conectivo con el fin de visualizar la capa muscular. Luego haga una incisión de 1 cm en la cápsula muscular inmediatamente lateral al proceso espinal dorsal de la vértebra lumbar L6. NOTA: Los huesos de la vértebra lumbar L6 se pueden visualizar en este punto.</li>
	<li>Coloque el conjunto de la cánula-aguja guía cerca del aspecto anterior de la 6a vértebra lumbar y empújelo hacia el espacio intervertebral a lo largo del aspecto anterior de la 6a vértebra para que el extremo de la aguja penetre en el canal espinal. Empuje la cánula guía en su lugar a lo largo de la aguja y retire la aguja de 23 G dejando sólo la cánula guía en su lugar. NOTA: Es útil utilizar fórceps contundentes para localizar el proceso dorsal de la vértebra lumbar L6 antes de insertar la aguja. Generalmente, se puede ver líquido del lDI entrando en el cubo de la aguja (este líquido puede estar temtulado con un toque de sangre, pero esto no indica que se haya hecho daño o que la aguja no esté colocada correctamente). Los autores no han visto una gran cantidad de sangre o sangrado severo durante este procedimiento. Si se produce alguno de los dos casos, se debe contactar a un veterinario para determinar el tratamiento adecuado y si se deben eutanasiar a los animales.</li>
	<li>Inserte el conjunto catéter-alambre en la cánula guía. Angulo hacia abajo el conjunto catéter-alambre en aproximadamente un ángulo de 45o hasta el canal espinal y forzar el extremo aproximadamente 0,3 cm en el canal espinal.</li>
	<li>Retire la cánula guía, dejando el catéter con el alambre de estilo en su lugar. Retire el alambre de estilización aproximadamente 2,5 cm de la punta intratecal del catéter y avance el catéter hacia el canal espinal hasta que la marca de 2 cm esté en la entrada del canal (sólo visible debajo del músculo) como se muestra en la Figura 1Bvi. NOTA: El catéter insertado debe extenderse rostrally en el espacio subaracnoideo. La colocación exitosa debe permitir el libre movimiento del catéter en ese espacio.</li>
	<li>Retire completamente el alambre de estilo, y se puede ver el CSF entrando en el catéter implantado.</li>
	<li>Conecte el conjunto del catéter de entrega al extremo distal del catéter implantado a través del extremo de la aguja de 30 G(Figura 1Bv,vi).</li>
	<li>Cargue 60 ml de solución salina estéril en una jeringa de 100 l (jeringa de lavado). Cargue un bolo de 30 ml del compuesto de ensayo (p. ej., solución de ASO) en una segunda jeringa (jeringa de inyección).</li>
	<li>Conecte la jeringa de lavado (cargada con solución salina) al extremo del adaptador de tubo del conjunto del catéter de entrega(Figura 1Bv). Inyectar 20 ml de solución salina estéril en el espacio intratecal (lavado previo a la inyección).</li>
	<li>Conecte la jeringa de inyección (cargada con compuesto de prueba) al extremo del adaptador de tubo del conjunto del catéter de entrega(Figura 1Bv). Inyectar 30 s de compuesto de ensayo en el espacio intratecal durante 30 s. NOTA: El volumen de inyección de rutina de ASO es de 30 s para lograr un buen derribo en la médula espinal y en la corteza. Se ha informado que los volúmenes de inyección pueden afectar a la distribución compuesta12,aunque no se han probado diferentes volúmenes de inyección. Si se utiliza otro compuesto o volumen, es necesario determinar empíricamente la seguridad y la eficacia.</li>
	<li>Repita el paso 3.10 y enjuague el catéter con otros 40 ml de solución salina estéril (lavado posterior a la inyección). A continuación, desconecte el conjunto del catéter de entrega del catéter implantado. NOTA: Se piensa que el lavado previo y post-inyección reduce el secuestro local de los compuestos y mejora su distribución a las estructurasrostral12.</li>
	<li>Cortar y sellar asépticamente el catéter implantado: Coloque un par de fórceps de disección estéril en un esterilizador de cuentas hasta que estén muy calientes, luego apriételos en el tubo con el extremo caliente de los fórceps. NOTA: Esta acción derrite el catéter. Por lo tanto, el agujero en el tubo se derrumba y todos los lados se pegan entre sí, sellando el tubo de una manera aséptica y luego se coloca en el espacio subcutáneo.</li>
	<li>Utilice suturas monofilamento absorbibles para fijar el catéter termosellado restante al tejido conectivo. A continuación, utilice suturas monofilamento no absorbibles para cerrar la piel sobre el catéter sellado térmicamente. NOTA: Los clips de herida también se pueden utilizar según lo aprobado por el protocolo IACUC. La técnica es compatible con inyecciones repetidas, aunque sólo se ha utilizado para inyecciones de una sola vez en nuestras manos. La viabilidad de las inyecciones repetidas debe evaluarse empíricamente con la aprobación de la IACUC.</li>
	<li>Use gasa y salina para lavar cualquier sangre de la piel y permitir que el animal se recupere de la anestesia en una incubadora calentada hasta que esté móvil, momento en el que se devuelve a su jaula de origen (dos ratas por jaula). NOTA: Cuando realice cirugías en varias ratas en el mismo día, limpie las herramientas con agua para eliminar la sangre y vuelva a esterilizar con un esterilizador de perlas secas calentada (durante al menos 20 s, con tiempo para enfriarse) entre animales. Se utiliza un nuevo conjunto de instrumentos cada 5 animales.</li>
	<li>Monitoree a los animales diariamente durante al menos 3 días después de la cirugía y continúe monitoreando a los animales semanalmente después de recuperarse de la cirugía de acuerdo con el protocolo IACUC. NOTA: Si se produce alguna complicación (retención de orina, infecciones por incisión, trastorno neurológico como convulsiones o parálisis), se debe contactar a un veterinario para determinar el tratamiento adecuado y si se deben eutanasiar animales. Si no se utiliza buprenorfina de liberación sostenida, el alivio del dolor debe administrarse diariamente después de la cirugía de acuerdo con el protocolo IACUC.</li>
</ol>4. Evaluación de la desconexión específica del tejido después de la inyección de TI
<ol><li>Dos semanas después de la inyección de bolus de TI de los ASO, recoger diferentes regiones del cerebro (es decir, corteza cerebral, estriado y cerebelo) así como diferentes segmentos de la médula espinal (es decir, cervical, torácica y lumbar). Extraiga el ARN tisular total utilizando un kit de extracción de ARN comercial y realice la reacción de síntesis de ADNr como se describió anteriormente13. NOTA: Se utilizaron reactivos estándar para qPCR con los siguientes ensayos: rata Malat1 y rata GAPDH. Los niveles de transcripción relativos se calcularon utilizando el método deTC de 2 - -(CT - ciclo de umbral).</li>
</ol>

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<li>Wurster, C. D., Ludolph, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nusinersen+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Nusinersen for spinal muscular atrophy.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 11, (2018).</li>
</ol>

Los autores son todos empleados de Biogen, Inc. o Ionis Pharmaceuticals. Los autores reciben los oligonucleótidos antisentido descritos en el artículo de Ionis Pharmaceuticals.

El presente artículo muestra un método potente para administrar agentes terapéuticos directamente en el SNC de rata. En teoría, una técnica similar también se puede realizar en ratones, aunque debido al tamaño más pequeño, el método puede ser más difícil. Por lo tanto, nuestro grupo realiza inyecciones intracerebroventriculares (ICV) en ratones para la administración de fármacos del SNC, que alcanzan los mismos objetivos a través de una vía diferente de administración. Este método se ha descrito en otro estudio<sup class...

El sistema vascular del sistema nervioso central (SNC) ha evolucionado como un regulador crítico de la homeostasis, controlando el tráfico de moléculas, suministrando nutrientes y eliminando los residuos. Este sistema es también la primera línea de defensa de los ataques de patógenos externos, gracias a una densa distribución de uniones estrechas a lo largo de las paredes de las células endoteliales. Estas uniones estrechas conforman un aspecto de la barrera hematoencefálica (BBB). Mientras que el BBB permite el transporte de moléculas necesarias para satisfacer las demandas de nutrientes y energía (por ejemplo, iones, glucosa), también limita selectivamente el paso de patógenos, así como sustancias químicas tóxicas1,2,3.
Irónicamente, la misma función protectora del BBB que limita el paso de patógenos y sustancias químicas tóxicas también es el principal obstáculo para nuestra capacidad de acceder fácilmente al SNC con tratamientos terapéuticos después de la administración sistémica al organismo2, 4,5. Este papel del BBB ha impulsado el desarrollo de una plétora de nuevas tecnologías y enfoques de distribución de medicamentos6.
Una forma de superar este obstáculo es inyectar los fármacos directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) que persigue continuamente tanto el cerebro como la médula espinal7,8,9,10. En este artículo, describimos un método para entregar con éxito agentes en el espacio intratecal lumbar colocando el extremo interno del catéter completamente en el espacio de la quinquina cauda de la columna vertebral de la rata. Mazur et al. en otros lugares11publicaron previamente una descripción de este procedimiento.
El protocolo es muy eficaz y produce una tasa de éxito superior al 90% de la entrega de oligonucleótidos antisentido (ASO) al SNC cuando se evalúa mediante un análisis cuantitativo de reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) del desenlace del gen objetivo8. El procedimiento causa un mínimo de malestar a los animales, ya que el 100% de las ratas sobreviven a la cirugía y muestran una hinchazón mínima alrededor de la herida quirúrgica y no hay signos de angustia (por ejemplo, hiperactividad, deshidratación, círculos, pérdida de equilibrio, disminución de la ingesta de alimentos y deshidratación) durante la observación postoperatoria. Otra ventaja del método descrito aquí es que no requiere equipos caros, ni herramientas especiales.

<table><tbody><tr><td>3M Steri-Drape Cortina pequeña con apertura adhesiva</td><td>3M</td><td></td><td>1020</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Decon Laboratories, Inc</td><td></td><td>8416-160Z</td></tr><tr><td>Palitos de hisopo con alcohol</td><td>Dynarex</td><td></td><td>NO 1204</td></tr><tr><td><a href="https://punchout.fishersci.com/shop/products/bd-general-use-syringes-5/22124967?crossRef=BD%20302830#?keyword=BD+302830">BD Jeringas de uso general 1 mL Punta Luer-Lok</a></td><td>BD</td><td>1ml TB Punta Luer-Lok</td><td>BD 302830</td></tr><tr><td>BD Tubo de PE intramédico</td><td>BD</td><td>Tubo de polietileno PE50 Diámetro 0.023 en</td><td>BD 427400 (10 pies, Fischer Scientific 22-204008) o 427401 (100 pies, Fischer Scientific 14-170-12P)</td></tr><tr><td>BD Tubo de PE intramédico</td><td>BD</td><td>Tubo de polietileno PE10 Diámetro 0.011 en</td><td>BD 427410 (10 pies, Fischer Scientific 14-170-11B) o 4274011 (100 pies, Fischer Scientific 14-170-12B)</td></tr><tr><td>BD Intramedic Adaptador de tubo de PE</td><td>BD</td><td>calibre 23 intramedic luer stub adaper</td><td>BD 427565 o Fisher Scientific 14-826-19E</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Agujas de un solo uso 30G</td><td>BD BD</td><td></td><td></td></tr> 305128 <tr><td>Buprenorfina de liberación sostenida-lab</td><td>ZooPharm</td><td>Se requiere</td><td></td>receta</tr><tr><td>médica Esterilizador de óxido de etileno</td><td>Andersen Sterilizer INC.</td><td>AN 74i, esterilizador de gas</td><td>AN 74i</td></tr><tr><td>cánula guía</td><td>BD</td><td>19G x 1 WT (1,1 mm x 25 mm)</td><td>aguja BD 305186</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton 100ul</td><td>Hamilton company</td><td>Jeringa Hamilton 100ul</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador de perlas calientes Herramientas</td><td></td> de <td>ciencia</td><td>fina MODELO DE ESTERILIZADORNO FST 250</td></tr><tr><td>Pomada oftálmica</td><td>Dechra veterranery producto</td><td></td><td>17033-211-38</td></tr><tr><td>Recortadora de mascotas Pocket Pro</td><td>Braintree Scientific</td><td></td><td>CLP-9931 B</td></tr><tr><td>Exfoliante de povidona</td><td>PDI</td><td></td><td>S48050</td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>Baxter</td><td>Cloruro de sodio 0,9% Infusión intravenosa BP 50ml</td><td></td></tr><tr><td>FE1306G Bisturí</td><td>Pluma</td><td>bisturí desechable</td><td>nº 10</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica para animales pequeños</td><td>K& H Fabricación</td><td></td><td>Modelo # 1060</td></tr><tr><td>Estilete de alambre</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T14</td><td>LH-36233780</td></tr><tr><td>Cortina de toalla de cirugía</td><td>Dynarex</td><td></td><td>4410</td></tr><tr><td>Tijeras y pinzas quirúrgicas</td><td>FST y Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suturas</td><td>Ethicon</td><td></td><td>4-0 o 5-0</td></tr><tr><td>Herramienta para hacer la Guía cannular</td><td>Grainger</td><td>Herramienta rotativa (Dremel)</td><td>14H446 (Fabricante: EZ456)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Disco de corte con bloqueo EZ</td><td>1PKX5 (Fabricante: 3000-1/24)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Muela abrasiva, óxido de aluminio</td><td>38EY44 (fabricante: EZ541GR)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Mandril de bloqueo EZ</td><td>1PKX8 (Fabricante: EZ402-01)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Azulejo de suelo con rueda de diamante</td><td>3DRN4 (fabricante: EZ545)</td></tr><tr><td>Fuente alternativa de materiales prefabricados y esterilizados para este procedimiento</fuerte>Sistema de</td> catéter dosificador Sistemas de infusión SAI RIDC-01 Cánula guía SAI Sistemas de infusión SAI Catéteres internos RIDC-GCA Sistemas de infusión SAI Alambre de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>estilete RIDC-INC Sistemas de infusión SAI <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>RIDC-STY</td></tr></tbody></table>

entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de rata

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

La barrera hematoencefálica (BBB) es una defensa importante contra la entrada de agentes potencialmente tóxicos o patógenos de la sangre en el sistema nervioso central (SNC). Sin embargo, su existencia también reduce drásticamente la accesibilidad de los agentes terapéuticos administrados sistémicamente al SNC. Un método para superar esto, es inyectar esos agentes directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR), evitando así el BBB. Esto se puede hacer a través de la implantación de un catéter para perfusión continua utilizando una bomba osmótica, o para la administración de bolo único. En este artículo, describimos un protocolo quirúrgico para la entrega de oligonucleótidos antisentidos dirigidos al SNC (ASO) a través de un catéter implantado directamente en el espacio de cauda equina de la columna adulta de rata. Como resultados representativos, mostramos la eficacia de una única inyección intratecal de ASO de bolo a través de este sistema de cateterismo para derribar el ARN objetivo en diferentes regiones del SNC de rata. El procedimiento es seguro, eficaz y no requiere costosos equipos o herramientas quirúrgicas. La técnica descrita aquí también se puede adaptar para suministrar medicamentos en otras modalidades.

Usando el método descrito aquí, inyectamos dos grupos de ratas hembra adultas (250-300 g; n a 10/grupo) con un solo bolo de PBS salino con búfer de fosfato o 300 g de ASO dirigidos al ARN Malat1 largo no codificante (linc); en nuestro laboratorio utilizamos rutinariamente el Malat1 ASO como un compuesto de herramienta, porque Malat1 se expresa ubicuamente y a niveles altos en todos los tejidos14,incluyendo el cerebro y la médula espinal. El Malat1 ASO funciona a tr...

Aquí, describimos un método para suministrar medicamentos al sistema nervioso central de la rata mediante la implantación de un catéter en el espacio intratecal lumbar de la columna vertebral. Nos centramos en la entrega de oligonucleótidos antisentido, aunque este método es adecuado para la entrega de otras modalidades terapéuticas también.

Entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de Rata

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...

Este protocolo permite la entrega directa de terapias en el sistema nervioso central de la rata para evaluar la farmacocinética, farmacodinámica y eficacia de nuevas terapias en modelos de enfermedad de rata. Este procedimiento es seguro, eficaz y no requiere equipos costosos ni herramientas quirúrgicas. Demostrando el procedimiento serán Yi Chen y Yi Luo, científicos de investigación de mi laboratorio.Para preparar las cánulas guía especiales, utilice una herramienta giratoria con una rueda cortada para cortar ambos extremos de una aguja de calibre 19 para obtener una cánula guía de aproximadamente un centímetro y medio a dos centímetros de largo. A continuación, utilice la rueda de rectificación de la herramienta giratoria para suavizar ambos extremos. Para preparar el conjunto de alambre del catéter, corte una pieza de ocho centímetros de largo de tubo PE10 de 011 pulgadas de diámetro para servir como el catéter intratecal para cada animal.Utilice un rotulador resistente al etanol para hacer una marca a dos centímetros de un extremo de cada pieza de tubo. Para cada animal, inserte un alambre de estilo de 11 centímetros de largo cortado de alambre de acero inoxidable recubierto de politetrafluoroetileno en el lumen del catéter PE10 de ocho centímetros de largo. Para preparar el conjunto del catéter de entrega, corte una pieza de cinco a 10 centímetros 023 pulgadas de diámetro de catéter PE50 e inserte un adaptador de tubo de calibre 23 en un extremo del catéter.A continuación, inserte una aguja de calibre 30 con un cubo cortado en una pieza de aproximadamente 0,5 centímetros de tubo PE10 y conecte el tubo PE10 al otro extremo del catéter. Para preparar un conjunto guía de cánula-aguja, coloque una cánula guía sobre el extremo de una aguja de calibre 23. Antes de comenzar la cirugía, coloque una almohadilla de calentamiento en la mesa de la cirugía y cubra la almohadilla con una sábana de cortina estéril.Coloque un tubo de centrífuga cónica de 50 ml en la lámina y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo en la rata experimental anestesiada. Después de pesar al animal, afeitar la espalda de la cola a la columna torácica caudal y colocar la rata afeitada en la hoja estéril en la posición propensa. Coloque el tubo de 50 ml debajo del abdomen para flexionar la columna vertebral en la región lumbar y aplique pomada oftálmica a los ojos.A continuación, inyectar por vía subcutánea un miligramo por kilogramo de buprenorfina de liberación sostenida y limpiar la piel expuesta con povidona secuencial y exfoliaciones de alcohol. Escurre al animal con una lámina transparente estéril fenestrada. Para la colocación del catéter y la inyección del compuesto, identifique los dos hoyos naturales entre los músculos por encima de la pelvis afeitada, y con una mano sosteniendo los hoyos, utilice la otra mano para presionar suavemente y sentir la columna vertebral desde la dirección caudal a rostral para localizar la primera sangría mayor entre las vértebras.Después de identificar el espacio intervertebral entre las vértebras S1 y L6, muévase ligeramente rostralmente para identificar el espacio intervertebral entre las vértebras L5 y L6. Utilice un bisturí para hacer una incisión de no más de dos centímetros de largo en la piel y la cápsula muscular en este sitio a lo largo de la línea media de la dirección rostral a caudal para que el lugar de inyección esté en el centro de la incisión. Utilice tijeras de disección para diseccionar el tejido conectivo hasta que se pueda visualizar la capa muscular.Haga una incisión de un centímetro en la cápsula muscular inmediatamente lateral al proceso espinal dorsal de la vértebra lumbar L6. Coloque el conjunto de aguja de la cánula guía cerca del aspecto anterior de la sexta vértebra lumbar y empuje el ensamblaje hacia el espacio intervertebral a lo largo del aspecto anterior de la sexta vértebra para que el extremo de la aguja penetre en el canal espinal. Utilice fórceps contundentes para localizar el proceso espinal dorsal de la vértebra lumbar L6 y luego empuje la aguja a lo largo del aspecto anterior de la sexta vértebra en el espacio invertebrata.Empuje la cánula guía en su lugar a lo largo de la aguja, retire la aguja e inserte el conjunto del alambre del catéter en la cánula guía. Angling el catéter en un ángulo de aproximadamente 45 grados al canal espinal, forzar el extremo del catéter aproximadamente 0,3 centímetros en el canal. Retire el alambre de estilo aproximadamente 2,5 centímetros de la punta intratecal del catéter y avance el catéter hacia el canal espinal hasta que el marcado de dos centímetros en el catéter sea simplemente visible debajo del músculo.Cuando el catéter esté en su lugar, retire la cánula guía para dejar el catéter y el alambre de estilo en su lugar. Avance el catéter en el canal espinal hasta que la marca de dos centímetros esté en la entrada del canal y retire completamente el cable de estilo. El líquido cefalorraquídeo se puede visualizar entrando en el catéter implantado.A continuación, conecte el conjunto del catéter de entrega al extremo distal del catéter implantado a través del extremo de la aguja del calibre 30. A continuación, cargue 60 microlitros de solución salina estéril en una jeringa de 100 microlitros y cargue un bolo de 30 microlitros del compuesto de prueba en una segunda jeringa. Conecte la jeringa salina al extremo del adaptador de tubería del conjunto del catéter de entrega y enjuague 20 microlitros de solución salina estéril en el espacio intratecal.Cuando se haya lavado toda la solución salina, sustituya la jeringa salina por la jeringa cargada en bolo e inyecte 30 microlitros del compuesto de ensayo en el espacio intratecal durante un período de 30 segundos. Cuando se haya entregado todo el bolo, sustituya la jeringa cargada de bolo por otra jeringa cargada con solución salina y enjuague el catéter con 40 microlitros adicionales de solución salina. Cuando se haya entregado el segundo volumen de solución salina, desprenda el conjunto del catéter de entrega del catéter implantado y utilice un par de fórceps de disección esterilizados con calor muy caliente para sujetar el tubo para cortar y sellar térmicamente el catéter implantado.Utilice suturas monofilamento absorbibles para fijar el catéter termosellado al tejido conectivo y luego utilice suturas no absorbibles para cerrar la piel. Luego use gasas y solución salina para lavar cualquier sangre de la piel y coloque la rata en una incubadora calentada con monitoreo hasta la plena recomprensión. En este experimento representativo, se obtuvo un muy buen derribo en todas las regiones recolectadas después de un solo parto de oligonucleótido de bolo antisenfoto como se demostró.Sin embargo, se midió cierto grado de variabilidad regional con la médula espinal que presenta el mayor porcentaje de derribo. Después de una inyección exitosa del oligonucleótido antisenso, u otras terapias, en un modelo adecuado, se puede evaluar la farmacocinética, farmacodinámica y eficacia de las terapias.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Chen, Y., et al. Administración intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de ratas. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra la administración de un compuesto de prueba en el líquido cefalorraquídeo (LCR) a través de un catéter implantado en la columna lumbar de un modelo de rata. El compuesto circula a lo largo del LCR hasta el cerebro y la médula espinal, ingresa a las neuronas y ofrece potencial terapéutico.

Administración intratecal de un compuesto de prueba al sistema nervioso central de la rata

Fuente: Li, D., et al. Inyección intratecal directa de virus adenoasociados recombinantes en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra el procedimiento para la inyección intratecal de virus adenoasociados (AAV) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ratón despierto, que cubre la preparación de la jeringa, la alineación de la columna vertebral y la inserción precisa de la aguja. Este método valida la administración de genes dirigidos, lo que respalda su potencial para las...

Administración intratecal de virus en un modelo de ratón para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central

Se describe un método para dirigir fármacos al sistema nervioso central ya sea por la implantación de un catéter o la realización de una inyección en bolo en el ventrículo lateral derecho en ratones. Nos centramos específicamente en la entrega de los oligonucleótidos antisentido. Esta técnica es fácilmente adaptable a otras drogas y para ratas.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Este informe describe una técnica sencilla y rápida de la aguja de punción intratecal para una transfección localizada de siRNA en la médula espinal lumbar de ratón bajo anestesia de corta luz duradera.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

Directa de la inyección intratecal de virus Adeno-asociado recombinantes en ratones adultos

Aquí, presentamos un protocolo utilizando un dispositivo de posicionamiento del ratón que permite la colocación adecuada de ratones para la administración intranasal de una formulación de péptido-siRNA dirigida al cerebro que permite un silenciamiento eficaz del gen en el sistema nervioso central.

Un dispositivo de posicionamiento para la colocación de ratones durante la entrega de siRNA intranasal al sistema nervioso central

El presente protocolo describe las instrucciones paso a paso para realizar inyecciones intratecales en ratones neonatos para la edición de genes y la administración de fármacos.

Inyección intratecal de ratón recién nacido para la edición del genoma y la administración de fármacos

Se describe un procedimiento quirúrgico para realizar inyecciones en la cisterna lumbar de la rata juvenil. Este enfoque se ha utilizado para la administración intratecal de vectores de terapia génica, pero se prevé que este enfoque se pueda utilizar para una variedad de terapias, incluidas las células y los fármacos.

Administración intratecal de vectores en ratas juveniles mediante inyección en cisterna lumbar

Una inyección intratecal lumbar representa una vía de administración traslacionalmente relevante para administrar terapia génica al sistema nervioso central. Este protocolo estandarizado integral para inyecciones intratecales lumbares en ratones y ratas neonatales, juveniles y adultos tiene como objetivo guiar a los investigadores en la adopción de esta técnica para estudios preclínicos de terapia génica.

Inyección intratecal lumbar de vectores de terapia génica para el sistema nervioso central dirigida en ratones y ratas

Este artículo detalla métodos de administración intratecal para terapias dirigidas al SNC en ratones adultos, centrándose en la precisión del protocolo y en la posibilitación de inyecciones repetidas. Incluye hallazgos de un estudio de validación en el que los oligonucleótidos antisentido redujeron la expresión mutante de SOD1 en ratones modelo SOD1-ALS, lo que respalda la utilidad del enfoque en la investigación preclínica sobre enfermedades neurodegenerativas.

Inyección intratecal lumbar de SOD1-ASO para la dirección precisa del SNC y la eficacia predictiva en ratones humanos SOD1-G93A ALS

Aprende a realizar entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de rata mediante implantación de catéter. Este protocolo seguro y económico permite evaluar farmacocinética y eficacia de terapéuticos novedosos.

Entrega intratecal de oligonucleótidos antisentido en el sistema nervioso central de Rata

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