Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales
June 2nd, 2020
Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.
Dentro de los organismos multicelulares, el tejido muestra altos grados más en su orientación espacial. Las células alinean y muestran un rango de prioridad a grandes distancias en el transcurso de la morfogénesis. Para entender cómo se alcanzan los arreglos planos de la epitelia durante el desarrollo, es crucial rastrear las orientaciones de la célula y la dinámica de crecimiento con alta fidelidad temporal espacial in vivo.
El protocolo descrito está diseñado para imaginar y analizar los comportamientos celulares a nivel global y local en la epidermis pupal de drosophila. Esta metodología podría proporcionar información sobre diferentes teorías de la investigación, la biología celular, la morfogénesis y la polaridad plana y se puede aplicar al análisis de otros tejidos, estructuras y modelos. Todos los pasos se pueden realizar fácilmente después de un poco de práctica.
Exigen precisión. La visualización de este protocolo ayuda a lograr resultados óptimos en un tiempo más corto. La disección pupal es compleja.
Para comenzar, utilice un pincel humedecido para transferir pre-pupas blancas escenificadas a un vial de plástico fresco, y manténgalos allí durante el tiempo que sea necesario a 25 grados centígrados. A continuación, retire cada pupa de la pared del vial con la ayuda de fórceps. Pegue el lado ventral de cada pupa en una corredera de vidrio cubierta con cinta adhesiva de doble cara.
Toque suavemente sobre los espiráculos de la cabeza y la superficie dorsal de la pupa con las puntas de los fórceps para asegurar la adhesión de la caja pupal a la cinta. Comience la disección bajo un microscopio estéreo retirando suavemente el opérculo del puparium con los fórceps. Inserte una punta de los fórceps en un poco profundo entre la caja pupal y la superficie de la pupa a través de la abertura opercular.
Rasgar la caja de la cabeza a la cola lateralmente en uno o más columpios, evitando pellizcar la pupa. Dobla hacia atrás la caja pupal agrietada hacia los lados laterales mientras sigues avanzando hacia el extremo posterior. Retire la pupa de la caja de pupa abierta insertando cuidadosamente los fórceps debajo del animal y tirando suavemente hacia arriba.
La pupa se adhiere a la punta de los fórceps. Sostenga la pupa suavemente por el lado ventral, y transfiera la pupa a un plato con fondo de vidrio encima de una pequeña gota de aceite de halocarbono permeable al gas. Enrolle un pedazo de papel de tejido húmedo en los bordes del plato y cubra el plato para mantener la humedad.
Orientar la pupa sobre la gota de aceite en los platos con fondo de vidrio de acuerdo con el dominio y el proceso a evaluar. Para la toma de imágenes vivas a largo plazo de la expansión temprana de los nidos dorsales, orientar dorsalmente la pupa. Para imaginar su expansión tardía y remodelación de tejidos, oriente dorsalmente la pupa.
Transfiera el plato de fondo de vidrio que contiene las pupas montadas a la etapa del microscopio y concéntrese en la superficie de la zona abdominal utilizando luz transmitida. Para emplear la recombinación mitótica para inducir mosaicos genéticos en el epitelio abdominal, prepare hembras vírgenes portadoras de una flipasa inducible por choque de calor, un sitio de FRT en un lugar genómico específico y un marcador celular distal reconocible para el sitio FRT. Preparar machos mutantes que lleven un sitio FRT en el lugar genómico equivalente.
Cruzar varias hembras y machos en una proporción de tres a uno en un vial de plástico a 25 grados celsius durante cuatro a cinco días. Para generar clones somáticos en los histoblastos, realice un tratamiento de choque térmico en la tercera etapa larval instar de la progenie de la cruz sumergiendo los viales de plástico que contienen a los animales en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 45 minutos a una hora. En el software de imagen J, utilice la función de proyección de intensidad máxima para proteger las rebanadas de pila Z adquiridas por microscopía confocal en 2D.
Los nidos tienen una forma característica que los orienta en un sistema de coordenadas planas anterior a la izquierda y dorsal a la parte superior. Para lograr resultados óptimos con este análisis, la imagen de entrada tiene que ser adquirida con alta resolución. Para obtener valores de orientación cualitativos en los bordes de celda locales, haga clic en el menú del complemento y elija la opción de distribución J de orientación.
Establezca el sigma de la ventana gaussiana en un píxel, spline cúbica en degradado, coherencia mínima en 20 por ciento y energía mínima en un uno por ciento. Utilice la opción de encuesta de color del complemento. Establezca el tono en orientación, saturación en coherencia y brillo para la imagen de entrada.
Este color codifica las orientaciones de arista de celda en relación con el sistema de coordenadas planas establecido. A continuación, en el menú del complemento, utilice la opción de medida J de orientación para cuantificar las orientaciones celulares y la alineación de celda a celda direccional. Generar regiones pequeñas, adyacentes no superpuestas de interés de peso uniforme alrededor de 20 micrómetros por 20 micrómetros dentro del área ocupada por los histoblastos.
La medida de prensado calcula la orientación local dominante y la coherencia de los ROI. En este estudio, la metodología utilizada es capaz de generar películas de alta resolución de las pupas en desarrollo durante períodos de hasta 48 horas sin blanqueo fotográfico significativo o toxicidad fotográfica. Aquí se muestran ejemplos de clones de tipo salvaje marcados por la ausencia de RFP NLS y sus puntos gemelos a las 26 horas posteriores a la formación del puparium.
Los clones alargados a lo largo de los límites segmentarios. Clones gemelos dispuestos en paralelo o en tándem. La morfología de un clon de tipo salvaje a las 26 horas y 47 horas después de la formación del puparium muestra una morfología fronteriza compleja en ambas etapas.
Las gráficas de caja y bigote para parámetros geométricos a las 26 horas y 47 horas después de la formación del puparium muestran que el área promediada y el perímetro aumentaron significativamente en esta ventana de tiempo. La orientación del clon se sostuvo durante la expansión y remodelación. Los parámetros de forma a las 26 horas y 47 horas después de la formación del puparium indican la rugosidad, redondez y circularidad apenas cambiadas en los clones de tipo salvaje.
Asegúrese de no dañar la pupa, de lo contrario morirá en unas pocas horas, afectando las imágenes en vivo. Este protocolo no requiere el empleo de un reactivo o instrumento de sartus. Evite pellizcarse al diseccionar.
Mediante la aplicación de estas metodologías posibles para generar películas de alta resolución para períodos de largo plazo utilizando diferentes técnicas de imagine. Focal a fotones o discos giratorios. El análisis cloral se puede emplear para explorar las respuestas no autónomas ya que las células aleatorias facilitan la identificación de conversaciones cruzadas o mecanismos de comunicación celular.
Estos métodos se pueden adaptar fácilmente para estudiar una gama completa de fenómenos morfogenéticos, incluyendo la coordinación de epidérmica, muscular, y desarrollo neuro durante la metamorfosis.
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Visión general
Este protocolo está diseñado para la imagen y análisis de la dinámica de orientación celular y crecimiento de tejido en el epitelio abdominal de Drosophila mientras la mosca de la fruta experimenta metamorfosis. La metodología descrita aquí puede aplicarse al estudio de diferentes etapas de desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.
Componentes clave del estudio
Área de ciencia
- Biología celular
- Morfogénesis
- Polaridad planar
Antecedentes
- El tejido muestra altos grados de orientación espacial dentro de los organismos multicelulares.
- Las células se alinean y exhiben prioridad en largas distancias durante la morfogénesis.
- El seguimiento de las orientaciones celulares y dinámicas de crecimiento es crucial para entender los arreglos epiteliales.
- Este estudio se centra en la epidermis pupal de Drosophila.
Propósito del estudio
- Imaginar y analizar comportamientos celulares a niveles globales y locales.
- Proporcionar ideas sobre teorías de biología celular y morfogénesis.
- Aplicar la metodología a varios tejidos y organismos modelo.
Métodos utilizados
- Técnicas de imagen para rastrear la orientación celular.
- Análisis de dinámicas de crecimiento de tejido.
- Observación in vivo del desarrollo de Drosophila.
- Aplicación del protocolo a diferentes etapas de desarrollo.
Resultados principales
- Alta fidelidad espacial-temporal en el seguimiento de comportamientos celulares.
- Insitios sobre las dinámicas de orientación celular durante la metamorfosis.
- Aplicaciones potenciales a otros tejidos y organismos modelo.
- La metodología es accesible después de práctica.
Conclusiones
- El protocolo mejora la comprensión de la morfogénesis epitelial.
- Puede adaptarse para varias aplicaciones de investigación en biología celular.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta metodología para obtener ideas más amplias.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Understanding tissue-level organization and growth dynamics is critical for de-risking target validation in complex disease models. This protocol enables high-fidelity tracking of cellular alignment and morphogenetic processes, supporting mechanistic insights into epithelial patterning. Such quantitative spatial-temporal data enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular behaviors to tissue-scale outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-scale organization to validate hypotheses about planar polarity and cellular coordination in morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible imaging and analysis workflows for assessing cellular alignment and directional growth in epithelial systems.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to measurable changes in tissue orientation and clonally resolved growth dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative orientation and coherency metrics from defined regions of interest, enabling objective comparison of cellular behaviors across conditions.
- Operational Value: Standardizes live imaging protocols using gas-permeable halocarbon oil and mounted pupae for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Assay Readiness: Facilitates screening-ready readouts such as clone elongation, border morphology, and area/perimeter changes over time for phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage observations of histoblast clone dynamics to broader tissue remodeling processes relevant to wound healing and regeneration models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of non-autonomous responses via clonal analysis and genetic mosaics to dissect cell communication mechanisms in developing epithelia.
- Predictive Confidence: Sustained orientation and stable shape parameters during expansion provide baseline benchmarks for assessing aberrant morphogenesis in disease-relevant perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of planar cell polarity and extends to lead identification by enabling quantitative assessment of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cellular alignment and tissue orientation during morphogenetic events such as histoblast nest expansion and remodeling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized live imaging and orientation analysis of epithelial sheets over 48-hour periods with minimal photo toxicity.
- Analytics: Generates dominant local orientation and coherency measurements from 20x20 micrometer regions of interest using OrientationJ plugins for objective, quantitative comparison.
- Translational Research: Connects clonal dynamics and border morphology changes to preclinical continuity in tissue repair and regeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform adaptable to other tissues, developmental stages, and model organisms beyond Drosophila pupal epidermis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial morphogenesis and planar polarity pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of live imaging and quantitative orientation analysis across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of aberrant tissue organization, reducing late-stage biological risk in preclinical programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, morphology-based readouts that correlate with functional tissue states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, pupal dissection, and live imaging under stereo and confocal microscopy.
- Dependent on gas-permeable halocarbon oil, glass-bottomed dishes, and stable humidity maintenance for long-term imaging.
- Necessitates standardized image acquisition protocols and plugin-based analysis (OrientationJ) for consistent orientation and coherency quantification.
- Requires adaptation of mounting orientation (dorsal vs. dorsal-lateral) based on the specific biological process being imaged (early expansion vs. late remodeling).
- Practical limitations include sensitivity to dissection-induced damage, which can compromise pupal viability and live imaging quality if not performed with precision.
