Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Este protocolo ha dado lugar a algunas de las mejores ideas que tenemos hasta ahora sobre cómo Candida albicans habita el tracto gastrointestinal de los mamíferos. Por ejemplo, hasta hace poco, no sabíamos realmente dónde se localiza Candida dentro del intestino o cuáles de sus muchas formas morfológicas asume dentro de este nicho. La principal ventaja de esta técnica es que permite visualizar Candida dentro de su entorno natural sin alterar las interacciones tridimensionales que el hongo tiene con las estructuras del huésped o con las bacterias en la microbiota.

Debido a que el intestino es un entorno complejo, es muy difícil modelar en el laboratorio y por lo tanto ha sido muy satisfactorio encontrar una manera de sondear la biología de Candida directamente en un modelo anfitrión. Ciertos componentes de la microbiota intestinal incluyendo Candida albicans se sospecha que juegan papel en enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal. Esta técnica se puede utilizar potencialmente para diagnosticar la presencia de microorganismos específicos en muestras de biopsia obtenidas de pacientes.

El dominio de la técnica de gavage y la capacidad de diseccionar segmentos gastrointestinales sin desgarrar los órganos es importante para obtener resultados óptimos. Para empezar, gavage cada animal con el volumen calculado de un inóculo dado. Coloque una aguja de alimentación de animales autoclaves en una jeringa de un mililitro y llene la jeringa con un volumen de gavage asegurándose de eliminar todas las burbujas.

Coloque la jeringa sobre una superficie estéril. Para asegurar al animal, sostén lo sostenga en la base de la cola con la mano dominante y deslice la mano no dominante hacia arriba la espalda del animal a la piel suelta justo detrás de las orejas. Reúne bien el escrúpulo con el pulgar y el dedo índice.

Recoger el animal por el escrúpulo, voltearlo y bucle el pequeño dedo de la misma mano alrededor de la cola para inmovilizar al animal contra la palma de la mano. Extienda suavemente la cabeza del animal para que esté en línea recta con el cuerpo. A continuación, recoja la jeringa con la mano dominante y sostén esta habitación perpendicular al animal con la aguja curva apuntando hacia abajo.

Utilice la bola de la aguja para enganchar suavemente una esquina interior de la boca y avanzar la aguja a lo largo del lado de la boca a la parte posterior de la garganta, luego mueva la aguja al centro. Una vez que la bola de la aguja está en la parte posterior de la garganta del animal, incline la aguja hacia arriba para que sea paralela a la línea del cuerpo del animal y permita que se deslice suavemente por la garganta. Si la aguja no se desliza suavemente por la garganta, es posible que la aguja no esté correctamente colocada y se debe retirar para cambiar de posición e intentarlo de nuevo.

Avance suavemente la aguja permitiendo que el animal trague la aguja hasta que sólo unos pocos milímetros permanezcan visibles. Compruebe que la bola de la aguja está en el estómago avanzando suavemente el émbolo y si no hay resistencia, continúe entregando el inóculo. Retire lentamente la aguja una vez que se haya administrado el inóculo y coloque el animal en su jaula.

Continúe monitoreando al animal durante cinco a 10 minutos en busca de signos de respiración o angustia laboriosas y verifique que reanude la actividad normal poco después del gavage. Si se utilizará el mismo inóculo para el siguiente animal, limpie la aguja con una toallita con alcohol. Si se utilizará un inóculo diferente, sustituya la aguja.

Usa fórceps de punta contundente para pellizcar una sección de la piel abdominal e incitar la piel y la fascia subyacente cerca de la base de la pelvis usando tijeras. Extienda la incisión en forma de U a lo largo de cada lado de la cavidad peritoneal y hasta la caja torácica, luego levante la piel fuera del camino. Utilice fórceps de punta contundente para extraer suavemente el cecum de la cavidad peritoneal usando tijeras para cortar las conexiones entre el cecum y los intestinos pequeños y grandes.

Coloque todo el cecum en un casete histológico para que quede sin torcido y quede plano. Coloque la segunda almohadilla de espuma en la parte superior y cierre el cassette. A continuación, coloque el cassette en un frasco de tapón de tornillo que contenga metacarn.

Exémo la sección de los intestinos gruesos que contiene de uno a dos gránulos fecales y tiene una longitud menor que la del casete. Coloque el tejido en el cassette manteniéndolo plano y sin torcido. Superponga con la segunda almohadilla de espuma, cierre el cassette y colóquelo en el metacarn.

Para cada sección del intestino delgado que se va a muestrear, excómete de un segmento de uno a dos centímetros que contenga algún material digestivo. Coloque el tejido en el cassette, superponga con la segunda almohadilla de espuma, cierre el cassette y colóquelo en el metacarn. Al excitar el estómago, cortar las conexiones con el esófago y el intestino delgado.

Coloque el tejido en el cassette y coloque el cassette en el metacarn. Deje los cassettes en la solución de metacarn a temperatura ambiente durante al menos tres horas, pero menos de dos semanas. Después de la fijación, retire las almohadillas de espuma y devuelva cada sección de tejido intacto en su casete.

Luego lave los tejidos dos veces durante 35 minutos en 100%metanol, dos veces durante 25 minutos en 100% etanol, y dos veces durante 20 minutos en xileno. Seque los casetes sobre una toalla de papel y colóquelos en una cera de parafina prefusible durante dos horas a 70 grados centígrados en un horno de hibridación. A continuación, retire los cassettes de la cera, deje que el exceso de cera drene y guárdelos a temperatura ambiente hasta que estén incrustados en bloques de cera.

Desencerar las secciones histológicas incrustadas de parafina insertando las diapositivas en un frasco precalentado lleno de xileno. Deje el frasco a 60 grados centígrados durante 10 minutos y, a continuación, deseche el lavado de xileno. Vierta xileno fresco a temperatura ambiente en el frasco y repita la incubación.

Luego llene el frasco con 100% etanol e incubarlo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, retire los portaobjetos del frasco y séquelos al aire. Para manchar a los C.albicans con una sonda de pescado, comience dibujando un círculo alrededor de la sección de tejido usando un Pat Pen.

Pipetear 50 microlitros de sonda que contienen solución de hibridación sobre el tejido fijo y extenderlo suavemente con la punta de la pipeta. Superponer el líquido con un cubreobjetos de hibridación asegurándose de evitar burbujas. A continuación, selle los portaobjetos en una cámara de hibridación hermética e incubar las secciones durante tres horas a 50 grados centígrados en un horno de hibridación en la oscuridad.

Después de la incubación, agregue la solución de lavado a un frasco de Coplin. Retire con cuidado el cubreobjetos de la corredera con fórceps y coloque el portaobjetos en la solución de lavado. Cubra el frasco con papel de aluminio e incubarlo a 50 grados Centígrados durante 20 minutos.

A continuación, lave los portaobjetos vertiendo la solución de lavado y rellenando el frasco con PBS. Inmediatamente verter y rellenar con PBS fresco repitiendo el proceso para un total de dos lavados. Wick away the PBS with a delicate task wipe and circle the intestinal tissue section with a Pat Pen.

Coloque los portaobjetos en un recipiente de plástico opaco y agregue 50 microlitros de solución de tinción de núcleos de mucina a la sección del tejido. Cubra el recipiente con papel de aluminio e incubarlo a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Después de la incubación, poner los portaobjetos en un frasco de Coplin y lavarlos dos veces con PBS.

Toque el exceso de PBS en una toalla de papel y luego retire las gotas finales con un pañuelo. Coloque una gota de medio de montaje en cada sección y colóquelo con un cubreobjetos de vidrio asegurándose de evitar burbujas. Deje que el medio de montaje se extienda por todo el cubreobjetos.

Ancla el cubreobjetos en su lugar con esmalte de uñas en las esquinas e imágenes de las diapositivas usando un microscopio fluorescente. Este protocolo se puede utilizar para etiquetar fluorescentemente C.albicans in vitro y en tejidos huésped. Las hifas propagadas in vitro, las células de levadura redondas, las células intestinales y las células opacas se fijaron, permeabilizaron y distinguieron con fluorescencia y microscopía de contraste de fase.

Las levaduras redondas y las hifas muy alargadas fueron imágenes en el intestino grueso del ratón. Los tejidos del huésped estaban manchados con la sonda específica de C.albicans o la sonda panfúngica. C.albicans fue etiquetado como rojo, núcleos de células huésped azules y la capa de moco verde.

C.albicans se detectó en diferentes segmentos del tracto gastrointestinal murino, incluidas las regiones inmediatamente adyacentes a la mucosa huésped y las regiones más centrales del lumen intestinal. Para los científicos que no han realizado previamente la técnica de gavage, es importante obtener entrenamiento especializado antes de intentar este método. Después de la tinción de pescado, se pueden utilizar técnicas inmunofluorescentes para manchar características adicionales de la mucosa huésped.

Esto puede permitir la caracterización del daño tisular o las respuestas inmunitarias del huésped. Esta técnica nos ha permitido caracterizar la relación entre la morfología celular de las células fúngicas de los mutantes de Candida albicans y la supervivencia dentro del huésped, mejorando nuestra comprensión de la biología albicans de Candida que se puede aprovechar al desarrollar terapias.