Name: Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprende a visualizar Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino mediante hibridación fluorescente in situ. Esta técnica permite identificar su localización y formas morfológicas sin alterar las interacciones tridimensionales con el hospedero.

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Los autores quieren agradecer a Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg y KC Huang por su orientación en el desarrollo de la técnica FISH. Teresa O'Meara proporcionó comentarios útiles sobre el manuscrito, y Miriam Levy ayudó con la fotografía. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones De NIH R01AI108992, R01DK113788, y un Premio de Bienvenida Burroughs en la Patogénesis de Enfermedades Infecciosas.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método descrito aquí permite la visualización de levaduras de C. albicans e hifas en los tratados gastrointestinales de ratones colonizados comensales de cualquier sexo o cepa. La sonda FISH hibrida a 23S rRNA, que se distribuye a través del citoplasma fúngico. Nuestro método fue adaptado de un protocolo previamente reportado para visualizar bacterias intestinales20. Debido a que C. albicans cambia su morfología dentro del huésped, el método es útil para monitorear la forma de las células fúngicas, así como la localización. Por ejemplo, hemos utilizado este método para refutar la hipótesis de que las levaduras predominan en todo el tracto digestivo, y para exponer las discrepancias entre los fenotipos in vivo e in vitro de ciertos mutantes "filamentación-defectuosos"12.
Existen varios modelos de ratón para la colonización commensal de C. albicans. La microbiota de ratones de laboratorio y humanos es distinta y, en ratones, se requiere el uso de antibióticos o una dieta especializada para establecer una colonización estable. El tratamiento con antibióticos también mejora la colonización de seres humanos de C. albicans y es un factor de riesgo importante para la enfermedad diseminada10. Los antibióticos utilizados en este estudio son relativamente baratos y producen disminuciones confiables en la microbiota bacteriana. Tenga en cuenta que los antibióticos se utilizan para disminuir la carga de especies bacterianas antagónicas, no para eliminar todas las bacterias de los animales. Si los investigadores desean estudiar C. albicans-las interacciones del huésped en ausencia de bacterias o para evitar el uso de antibióticos o una dieta especial, los animales libres de gérmenes pueden ser sustituidos por animales criados convencionalmente; sin embargo, los ratones gnotobióticos presentan ciertas anomalías inmunitarias y anatómicas y, por lo tanto, pueden no ser adecuados para todos los fines.
Varios pasos son importantes para el éxito de la tinción FISH: El método de fijación recomendado es fundamental para preservar la integridad estructural de los tejidos gastrointestinales, particularmente el contenido frágil del lumen intestinal, como la capa de moco y la tridimensional organización de hongos y bacterias16. Tenga en cuenta que muchas soluciones de fijación de uso común que contienen agua son altamente perjudiciales para la arquitectura luminal. Los fijadores y soluciones para lavados post-fijación recomendados en este protocolo no contienen agua, y es importante evitar la contaminación con agua. Otro paso crítico es el paso de hibridación, donde es importante evitar la evaporación de la solución de hibridación durante la incubación de diapositivas en el horno de hibridación. Sugerimos colocar los portaobjetos en un recipiente estanco para evitar este problema. Alternativamente, se pueden utilizar cámaras de hibridación estancas como las utilizadas originalmente para la hibridación de microarrays.
En este protocolo se describe una sonda FISH específica de C. albicans. Sin embargo, debido a que muchos ratones criados en laboratorio no contienen C. albicans u otros hongos como parte de su microbiota intestinal natural, una sonda panfógica puede manchar específicamente C. albicans en animales colonizados experimentalmente. La sustitución de una sonda panfúngica puede ser deseable debido a sus características superiores de hibridación y una mayor relación señal-ruido. Si la sonda panfúngica se utiliza como sonda pseudoespecífica para C. albicans,es importante documentar la falta de tinción en animales no infectados (es decir, tratados con antibióticos pero no con C. albicans). La tinción de un animal de control no colonizado también es útil para evaluar la tinción de fondo que puede resultar de la adherencia de las sondas FISH a las partículas de alimentos. En general, el uso de sondas FISH ofrece una mayor especificidad sobre la mayoría de los otros métodos de tinción de hongos, como el blanco calcofluor (que mancha la quitina, un componente de pared celular que puede variar entre los tipos de células), GMS o anticuerpos antifúngicos disponibles comercialmente. Además, la tinción FISH permite la costarinación de múltiples organismos utilizando sondas FISH etiquetadas diferencialmente a rRNA específicas de cada especie.
Una advertencia de esta técnica es que ciertos tipos de células de levadura C. albicans parecen muy similares por FISH (por ejemplo, los tipos de células opacas y GUT). Para distinguir entre estos tipos de células, sería útil desarrollar sondas de hibridación a ARNM de hongos específicos del tipo de célula. Sin embargo, en su forma actual, la técnica FISH ya ha revelado sorprendentes discrepancias entre los comportamientos in vivo e in vitro de los mutantes de C. albicans evaluados en ambas condiciones12,lo que indica interacciones complejas en el ambiente comensal natural que no son adecuadamente imitados por los ensayos in vitro existentes. Es probable que otros estudios de diferentes manchas de C. albicans en tipo salvaje adicional y huéspedes mutantes produzcan información adicional sobre las interacciones entre hongos y huésped. En particular, será instructivo perfilar C. albicans en modelos de enfermedad inflamatoria intestinal, que se asocia con altos tituladores de C. albicans en los seres humanos21,y otros modelos de C. albicans sobrecrecimiento y enfermedad. La técnica FISH también se puede combinar con inmunohistoquímica para manchar células huésped específicas. En general, el método presentado aquí proporciona un medio razonablemente rápido y confiable para determinar la localización y morfología de C. albicans dentro del tracto gastrointestinal de mamíferos.

Candida albicans es un hongos commensal, así como un patógeno humano oportunista. Esta levadura carece de un nicho ambiental definido y en su lugar se propaga dentro del tracto gastrointestinal (GI), la piel y el tracto genitourinario de los seres humanos y otros mamíferos1. Mientras que las primeras investigaciones sobre C. albicans se centraron principalmente en su potencial de virulencia, varios informes recientes sugieren que los organismos que propagan en el intestino pueden desempeñar un papel importante en la salud normal, incluido el desarrollo inmune del host2,3,4. Para facilitar las investigaciones de C. albicans commensalismo dentro del intestino de los mamíferos, desarrollamos un modelo de ratón de colonización gastrointestinal estable y un método basado en hibridación flúor in situ (FISH) para visualizar células de levadura fúngicas e hifas dentro de las hifas lumen intestinal.
Con algunas excepciones5, ratones criados en laboratorio suelen exhibir resistencia a la colonización fúngica del tracto digestivo. Se cree que la resistencia a la colonización está mediada por especies bacterianas específicas; sin embargo, esto puede ser superado por el tratamiento de los animales con antibióticos6,7 o el uso de una dieta definida químicamente que presumiblemente altera la composición de las especies bacterianascomposición 8,9. Del mismo modo, en los seres humanos, el uso de antibióticos de amplio espectro se ha asociado con el crecimiento excesivo de C. albicans y la diseminación10. Nuestro modelo de colonización murinos utiliza antibióticos de amplio espectro para establecer la colonización de C. albicans de ratones inmunocompetentes, criados convencionalmente. La penicilina y la estreptomicina se proporcionan en el agua potable de los animales durante una semana antes del avano con 108 unidades formadoras de colonias (Unidades formadoras de colonias) de C. albicans. Mientras continúe el agua infundida con antibióticos, C. albicans se propagará a través del tracto gastrointestinal, alcanzando lanzadores fecales de 106x 108 UFC/g. A pesar del alto nivel de colonización de hongos, los animales permanecen sanos y aumentan de peso al mismo ritmo que los controles no infectados. Este modelo se ha utilizado con éxito para detectar y caracterizar múltiples factores de commensalismo de C. albicans 11,12.
Al igual que otros miembros del reino de los hongos, C. albicans es capaz de una enorme plasticidad morfológica13. En condiciones in vitro, se ha demostrado que hace una transición entre al menos seis tipos de células de levadura unicelulares, así como hifas multicelulares y pseudophas. La transición de levadura a hifa es uno de sus atributos de virulencia mejor caracterizados, y las hifas y pseudoplasófias predominan en la mayoría de los modelos de enfermedades de mamíferos, así como en los tejidos humanos infectados. Para determinar la localización de C. albicans y la morfología celular dentro del tracto digestivo murino, desarrollamos una técnica FISH para tindar levaduras e hifas en secciones histológicas fijas. Las sondas consisten en oligonucleótidos de ADN etiquetados fluorescentemente que hibridan al ARN ribosomal 23S fúngico (ARN RRNA), que se distribuye a través del citoplasma fúngico. Debido a que los tejidos huésped se fijan de una manera que preserva la arquitectura tridimensional del intestino, incluyendo la mucosa huésped, el material digestivo, la microbiota bacteriana y la mucosidad dentro del lumen intestinal, esta técnica permite la localización de hongos con respecto a estos puntos de referencia cuando se tiñen. La técnica FISH se compara favorablemente con las manchas histológicas tradicionales para hongos, como el Schiff de ácido periódico (PAS) o la meteramina-plata (GMS) de Gomori, así como los anticuerpos antifúngicos disponibles comercialmente, ya que estos reactivos no son específicos para C. albicans. Por otra parte, los fijadores estándar eliminan la capa de moco y perturban otros contenidos del intestino lumen14,15.
En este artículo, proporcionamos instrucciones detalladas para establecer la colonización de alto grado de C. albicans del tracto gastrointestinal del ratón, para la disección del tracto digestivo de animales eutanasiados, para la fijación de tejidos de una manera que preserve arquitectura, y para la detección de C. albicans dentro de los tejidos huésped usando FISH. Además de las cepas de tipo salvaje y mutantes de C. albicans, la técnica de gavage se puede utilizar para entregar otros microorganismos. La técnica de fijación sería útil para cualquier estudio en el que se desee la preservación del contenido intestinal. El procedimiento FISH se puede completar en un día y se puede utilizar para localizar múltiples especies de hongos mediante el uso de múltiples sondas etiquetadas diferencialmente.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td>puede ser sustituido de cualquier proveedor</td></tr><tr><td>El agar</td><td></td><td></td> sanguíneo BHI <td>puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>C. albicans Sonda FISH</td><td>Pedido</td><td></td>personalizado de <td>IDT DNA Technologies</td></tr><tr><td>Cámara para hibridación Cámara</td><td></td><td></td><td>estanca de incubación destinada a reducir la evaporación</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>>=99.5%</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Pañuelos de limpieza para tareas delicadas</td><td>Kimberley-Clark</td><td>34256CT</td><td>Kimwipes</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021-5KG</td><td>puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Agujas de alimentación</td><td>Cadencia, Inc.</td><td>7910</td><td>metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; se puede esterilizar en autoclave</td></tr><tr><td>FITC-UEA-1</td><td>Sigma</td><td>L9006-1MG</td><td>otros fluoróforos disponibles</td></tr><tr><td>FITC-WGA</td><td>Sigma</td><td>L4895-2MG</td><td>otros fluoróforos disponibles</td></tr><tr><td>Almohadillas de espuma</td><td>Fisher</td><td>22038221</td><td>Pedir almohadillas de espuma que caben dentro de los casetes</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>47671</td><td>grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MK881746</td><td>reactivo ACS, >=99,5%</td></tr><tr><td>Tarro de vidrio Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-815</td><td>con capacidad para hasta 10 portaobjetos espalda con espalda</td></tr><tr><td>Casetes de histología</td><td>Simport</td><td>M512</td><td>Casetes profundos para que el ciego no se aplaste</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de hibridación</td><td>Sigma</td><td>GBL712222</td><td>sin ARNasa</td></tr><tr><td>Horno</td> <td>de hibridación</td><td></td><td>puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>LB</td><td></td><td></td><td>puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Los medios</td><td></td><td></td> de Lee <td>se prepararon como se describe en Lee et al. 1975</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>179337</td><td>reactivo ACS, >=99.8%</td></tr><tr><td>Ratones</td><td>Charles River Laboratories</td><td>028</td><td>adulto BALB/c; 18-21 gramos (8-10 semanas)</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher</td><td>50-980-487 Solución al</td><td>16%</td></tr><tr><td>Cera de Parrafín</td><td>Sigma</td><td>P3558-1KG</td><td>Paraplast para la inclusión de tejidos</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Unidad de producción de medios de la instalación de cultivo celular de la UCSF</td><td>CCFAL003</td><td>calcio, sin magnesio; puede ser sustituido por cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma</td><td>PENNA-100MU</td><td></td></tr><tr><td>El agar</td><td></td><td></td> dextrosa Sabouraud <td>puede ser sustituido de cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7123</td><td>estéril, puede ser sustituido de cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>puede ser sustituido de cualquier proveedor; mantener libre de RNasa</td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>puede ser sustituido de cualquier proveedor; mantener libre de RNasa</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td></td><td>Sigma S9137-100G</td><td></td></tr><tr><td>La pluma Super PAP</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td>puede ser sustituida de cualquier proveedor</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td>puede ser sustituida de cualquier proveedor; mantener libre de RNasa</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>no contiene DAPI</td></tr><tr><td>Xilenes</td><td>Sigma 214736</td><td></td><td>grado de reactivo</td></tr><tr><td>YEPD</td><td></td><td></td><td>puede ser sustituido de cualquier proveedor</td></tr></tbody></table>

visualización de candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans es un componente fúngico de la microbiota intestinal en humanos y muchos otros mamíferos. Aunque C. albicans no causa síntomas en la mayoría de los huéspedes colonizados, el reservorio commensal sirve como repositorio de enfermedades infecciosas, y la presencia de altos tetadores fúngicos en el intestino se asocia con la enfermedad inflamatoria intestinal. Aquí, describimos un método para visualizar la morfología y localización celular de C. albicans en un modelo de ratón de colonización gastrointestinal estable. La colonización se establece utilizando una dosis única de C. albicans en animales que han sido tratados con antibióticos orales. Los segmentos de tejido intestinal se fijan de manera que se conserva la arquitectura del contenido luminal (microorganismos y moco) así como la mucosa huésped. Finalmente, la hibridación fluorescente in situ se realiza utilizando sondas contra el ARN de hongos para manchar c. albicans e hifas. Una ventaja clave de este protocolo es que permite la observación simultánea de la morfología celular de C. albicans y su asociación espacial con las estructuras anfitrionas durante la colonización gastrointestinal.

Siguiendo las instrucciones proporcionadas, el resultado de esta técnica será el etiquetado fluorescente de los núcleos en el epitelio del huésped, moco y C. albicans en los tejidos GI seccionados. Las células de Candida albicans de tipo salvaje deben aparecer como células de levadura redondas y unicelulares o hifas multicelulares altamente alargadas, a veces ramificadas (las divisiones celulares no serán evidentes en las hifas). Los mutantes de C. albicans pueden aparecer además como levaduras "grises" más pequeñas y ligeramente alargadas o como levaduras "GUT" (transición inducida por el gastrointestinal) o "opacas" más grandes y ligeramente alargadas.
La Figura 1 representa la aguja de alimentación utilizada para el gavage oral, así como las posiciones clave de la aguja durante el procedimiento de gavage. La Figura 2 proporciona una configuración típica utilizada para la disección de órganos y la aparición de segmentos GI del ratón.
La Figura 3 muestra la tinción FISH de diferentes tipos de células C. albicans después de la propagación in vitro y dentro del modelo de ratón. La Figura 3A muestra imágenes de fluorescencia y fase de hifas fijas, permeabilizadas e in vitro. La formación de hifas fue inducida con líquido Lee's medium18 con 2% N-acetilglucosamina, pH 6.8 a 37 oC. La Figura 3B muestra imágenes de fluorescencia y fase de células de levadura fijas, permeabilizadas e in vitro. La Figura 3C,D muestra células GUT fijas, permeabilizadas, in vitro y células opacas, respectivamente. Los tipos de células opacas y GUT son morfológicamente indistinguibles, excepto cuando se visualizan mediante la exploración de microscopía electrónica. Tenga en cuenta que la tinción FISH de células in vitro-propagadas será subóptima si las células no están bien permeabilizadas. En la Figura 3Cse muestra un ejemplo de tinción débil y difusa. Para obtener mejores resultados, las condiciones de fijación y permeabilización celular deben determinarse empíricamente para cada tipo de célula y especie a investigar. Afortunadamente, el protocolo recomendado para visualizar C. albicans en tejidos seccionados produce una permeabilización más consistente.
Figura 3E-G representa C. albicans en los intestinos gruesos del ratón, manchado con la sonda específica De C. albicans (Figura3E) o la sonda panfógica ( Figura3F, G). C. albicans aparece rojo en estas imágenes, los núcleos de células anfitrionas son azules y la capa de moco es verde. Tanto las levaduras redondas como las hifas muy alargadas (puntas de flecha blancas) ocurren en los intestinos gruesos. Tenga en cuenta que la tinción es más brillante con la sonda panfógica. La Figura 3G representa a un mutante ume6 en el mismo compartimiento, manchado con la sonda panfúngica. Ume6 codifica un factor de transcripción que se requiere para la formación de hifas en condiciones in vitro19 . Curiosamente, el fenotipo con cadena de levadura mostrado por este mutante en condiciones in vitro no se recapitula dentro del intestino, lo que sugiere que un factor redundante debe activarse dentro del host12. La Figura 4 representa la aparición de comodines tipo C. albicans en diferentes segmentos del tracto gastrointestinal murino, incluyendo las regiones inmediatamente adyacentes a la mucosa huésped y regiones más centrales del lumen intestinal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig01.jpg"> Figura 1: Clave de alimentación de las posiciones de la aguja durante el gavage. (A) Aguja de alimentación. (B) Alimentación de la bola de aguja insertada al lado de la lengua. (C) Aguja de alimentación en posición vertical con inserción en el esófago. (D) Aguja de alimentación insertada en el estómago con unos pocos milímetros visibles por encima de la nariz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de diseño de disección. (A) Almohadilla de disección y herramientas. (B) Tracto de indicaciones geográficas con impuestos. Secciones proximales (esófago) a distal (ano): I. Estómago. II. Intestinos proximales. III. Intestinos delgados mediales. IV. Intestinos intestinales distales. V. Cecum. VI. Intestino grueso. Las cajas de borde discontinuas rosas indican los tejidos que se deben fijar. (C) Tejidos colocados en casetes. Los números romanos son los mismos que en el panel B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes representativas de C. albicans teñido sofocans.( A) FISH de C. hifas albicans cultivadas en medios líquidos de Lee18 con 2% de N-acetilglucosamina, pH 6.8. (B) FISH de C. albicans células de levadura redondas cultivadas en YEPD + 2% placas de agar. (C) FISH de células DE GUT C. albicans (ySN1045) cultivadas en YEPD + 2% placas de agar. (D) FISH de C. albicans células opacas cultivadas en YEPD + 2% placas de agar. (E) Tipo salvaje C. albicans (ySN250) en intestinos gruesos, teñido con la sonda específica C. albicans. (F) Tipo salvaje C. albicans en intestino grueso, manchado con la sonda panfúngica. (G) Ume6 mutante (ySN1479) en intestinogruesos, manchado con la sonda panfúngica: rojo es C. albicans, azul es núcleoepal huésped, y verde es mucina. Las puntas de flecha indican hifas. Las flechas indican levadura. Las barras de escala de 20 m. Las imágenes F y G están adaptadas de Witchley et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60283/60283fig04.jpg"> Figura 4: Apariencia de C. albicans teñido de FISH en diferentes compartimentos intestinales. El tipo salvaje C. albicans se muestra en los segmentos indicados del tracto gastrointestinal del ratón. Dentro de cada compartimiento, las imágenes representan el área adyacente a la mucosa anfitriona y la región central del lumen intestinal. La tinción se realizó con la sonda panfógica. La barra de escala es de 20 m. Las imágenes están adaptadas de Witchley et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60283/60283fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Reservas de antibióticos (200x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penicilina G</td>
			<td>181 mg/ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Estreptomicina</td>
			<td>400 mg/L</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Methacarn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acción</td>
			<td>Concentración final</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Unidades</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metanol</td>
			<td>60%</td>
			<td>300</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloroformo</td>
			<td>30%</td>
			<td>150</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acido acético glacial</td>
			<td>10%</td>
			<td>50</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solución de hibridación</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acción</td>
			<td>Concentración final</td>
			<td>Volumen</td>
			<td>Unidades</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>20</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>180</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% SDS</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% formamida</td>
			<td>1.00%</td>
			<td>10</td>
			<td>L (mantenido en pequeñas alícuotas a -20 oC entre usos)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de RNase</td>
			<td></td>
			<td>780</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solución de lavado FISH</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M Tris-HCl, pH 7.4</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>1</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 M NaCl</td>
			<td>0,9 M</td>
			<td>9</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Agua libre de RNase</td>
			<td></td>
			<td>40</td>
			<td>Ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Solución de tinción de Mucin-nuclei</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI, 10 g/ml</td>
			<td>20 ng/mL</td>
			<td>2</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>lectina, 40 g/ml</td>
			<td>1.6 g/ml</td>
			<td>40</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td>958</td>
			<td>Μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Volúmenes y concentraciones típicos de las soluciones utilizadas en este protocolo.

El propósito de este protocolo es visualizar la forma de la célula candida albicans y la localización en el tracto gastrointestinal de los mamíferos.

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Este protocolo ha dado lugar a algunas de las mejores ideas que tenemos hasta ahora sobre cómo Candida albicans habita el tracto gastrointestinal de los mamíferos. Por ejemplo, hasta hace poco, no sabíamos realmente dónde se localiza Candida dentro del intestino o cuáles de sus muchas formas morfológicas asume dentro de este nicho. La principal ventaja de esta técnica es que permite visualizar Candida dentro de su entorno natural sin alterar las interacciones tridimensionales que el hongo tiene con las estructuras del huésped o con las bacterias en la microbiota.Debido a que el intestino es un entorno complejo, es muy difícil modelar en el laboratorio y por lo tanto ha sido muy satisfactorio encontrar una manera de sondear la biología de Candida directamente en un modelo anfitrión. Ciertos componentes de la microbiota intestinal incluyendo Candida albicans se sospecha que juegan papel en enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal. Esta técnica se puede utilizar potencialmente para diagnosticar la presencia de microorganismos específicos en muestras de biopsia obtenidas de pacientes.El dominio de la técnica de gavage y la capacidad de diseccionar segmentos gastrointestinales sin desgarrar los órganos es importante para obtener resultados óptimos. Para empezar, gavage cada animal con el volumen calculado de un inóculo dado. Coloque una aguja de alimentación de animales autoclaves en una jeringa de un mililitro y llene la jeringa con un volumen de gavage asegurándose de eliminar todas las burbujas.Coloque la jeringa sobre una superficie estéril. Para asegurar al animal, sostén lo sostenga en la base de la cola con la mano dominante y deslice la mano no dominante hacia arriba la espalda del animal a la piel suelta justo detrás de las orejas. Reúne bien el escrúpulo con el pulgar y el dedo índice.Recoger el animal por el escrúpulo, voltearlo y bucle el pequeño dedo de la misma mano alrededor de la cola para inmovilizar al animal contra la palma de la mano. Extienda suavemente la cabeza del animal para que esté en línea recta con el cuerpo. A continuación, recoja la jeringa con la mano dominante y sostén esta habitación perpendicular al animal con la aguja curva apuntando hacia abajo.Utilice la bola de la aguja para enganchar suavemente una esquina interior de la boca y avanzar la aguja a lo largo del lado de la boca a la parte posterior de la garganta, luego mueva la aguja al centro. Una vez que la bola de la aguja está en la parte posterior de la garganta del animal, incline la aguja hacia arriba para que sea paralela a la línea del cuerpo del animal y permita que se deslice suavemente por la garganta. Si la aguja no se desliza suavemente por la garganta, es posible que la aguja no esté correctamente colocada y se debe retirar para cambiar de posición e intentarlo de nuevo.Avance suavemente la aguja permitiendo que el animal trague la aguja hasta que sólo unos pocos milímetros permanezcan visibles. Compruebe que la bola de la aguja está en el estómago avanzando suavemente el émbolo y si no hay resistencia, continúe entregando el inóculo. Retire lentamente la aguja una vez que se haya administrado el inóculo y coloque el animal en su jaula.Continúe monitoreando al animal durante cinco a 10 minutos en busca de signos de respiración o angustia laboriosas y verifique que reanude la actividad normal poco después del gavage. Si se utilizará el mismo inóculo para el siguiente animal, limpie la aguja con una toallita con alcohol. Si se utilizará un inóculo diferente, sustituya la aguja.Usa fórceps de punta contundente para pellizcar una sección de la piel abdominal e incitar la piel y la fascia subyacente cerca de la base de la pelvis usando tijeras. Extienda la incisión en forma de U a lo largo de cada lado de la cavidad peritoneal y hasta la caja torácica, luego levante la piel fuera del camino. Utilice fórceps de punta contundente para extraer suavemente el cecum de la cavidad peritoneal usando tijeras para cortar las conexiones entre el cecum y los intestinos pequeños y grandes.Coloque todo el cecum en un casete histológico para que quede sin torcido y quede plano. Coloque la segunda almohadilla de espuma en la parte superior y cierre el cassette. A continuación, coloque el cassette en un frasco de tapón de tornillo que contenga metacarn.Exémo la sección de los intestinos gruesos que contiene de uno a dos gránulos fecales y tiene una longitud menor que la del casete. Coloque el tejido en el cassette manteniéndolo plano y sin torcido. Superponga con la segunda almohadilla de espuma, cierre el cassette y colóquelo en el metacarn.Para cada sección del intestino delgado que se va a muestrear, excómete de un segmento de uno a dos centímetros que contenga algún material digestivo. Coloque el tejido en el cassette, superponga con la segunda almohadilla de espuma, cierre el cassette y colóquelo en el metacarn. Al excitar el estómago, cortar las conexiones con el esófago y el intestino delgado.Coloque el tejido en el cassette y coloque el cassette en el metacarn. Deje los cassettes en la solución de metacarn a temperatura ambiente durante al menos tres horas, pero menos de dos semanas. Después de la fijación, retire las almohadillas de espuma y devuelva cada sección de tejido intacto en su casete.Luego lave los tejidos dos veces durante 35 minutos en 100%metanol, dos veces durante 25 minutos en 100% etanol, y dos veces durante 20 minutos en xileno. Seque los casetes sobre una toalla de papel y colóquelos en una cera de parafina prefusible durante dos horas a 70 grados centígrados en un horno de hibridación. A continuación, retire los cassettes de la cera, deje que el exceso de cera drene y guárdelos a temperatura ambiente hasta que estén incrustados en bloques de cera.Desencerar las secciones histológicas incrustadas de parafina insertando las diapositivas en un frasco precalentado lleno de xileno. Deje el frasco a 60 grados centígrados durante 10 minutos y, a continuación, deseche el lavado de xileno. Vierta xileno fresco a temperatura ambiente en el frasco y repita la incubación.Luego llene el frasco con 100% etanol e incubarlo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, retire los portaobjetos del frasco y séquelos al aire. Para manchar a los C.albicans con una sonda de pescado, comience dibujando un círculo alrededor de la sección de tejido usando un Pat Pen.Pipetear 50 microlitros de sonda que contienen solución de hibridación sobre el tejido fijo y extenderlo suavemente con la punta de la pipeta. Superponer el líquido con un cubreobjetos de hibridación asegurándose de evitar burbujas. A continuación, selle los portaobjetos en una cámara de hibridación hermética e incubar las secciones durante tres horas a 50 grados centígrados en un horno de hibridación en la oscuridad.Después de la incubación, agregue la solución de lavado a un frasco de Coplin. Retire con cuidado el cubreobjetos de la corredera con fórceps y coloque el portaobjetos en la solución de lavado. Cubra el frasco con papel de aluminio e incubarlo a 50 grados Centígrados durante 20 minutos.A continuación, lave los portaobjetos vertiendo la solución de lavado y rellenando el frasco con PBS. Inmediatamente verter y rellenar con PBS fresco repitiendo el proceso para un total de dos lavados. Wick away the PBS with a delicate task wipe and circle the intestinal tissue section with a Pat Pen.Coloque los portaobjetos en un recipiente de plástico opaco y agregue 50 microlitros de solución de tinción de núcleos de mucina a la sección del tejido. Cubra el recipiente con papel de aluminio e incubarlo a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. Después de la incubación, poner los portaobjetos en un frasco de Coplin y lavarlos dos veces con PBS.Toque el exceso de PBS en una toalla de papel y luego retire las gotas finales con un pañuelo. Coloque una gota de medio de montaje en cada sección y colóquelo con un cubreobjetos de vidrio asegurándose de evitar burbujas. Deje que el medio de montaje se extienda por todo el cubreobjetos.Ancla el cubreobjetos en su lugar con esmalte de uñas en las esquinas e imágenes de las diapositivas usando un microscopio fluorescente. Este protocolo se puede utilizar para etiquetar fluorescentemente C.albicans in vitro y en tejidos huésped. Las hifas propagadas in vitro, las células de levadura redondas, las células intestinales y las células opacas se fijaron, permeabilizaron y distinguieron con fluorescencia y microscopía de contraste de fase.Las levaduras redondas y las hifas muy alargadas fueron imágenes en el intestino grueso del ratón. Los tejidos del huésped estaban manchados con la sonda específica de C.albicans o la sonda panfúngica. C.albicans fue etiquetado como rojo, núcleos de células huésped azules y la capa de moco verde.C.albicans se detectó en diferentes segmentos del tracto gastrointestinal murino, incluidas las regiones inmediatamente adyacentes a la mucosa huésped y las regiones más centrales del lumen intestinal. Para los científicos que no han realizado previamente la técnica de gavage, es importante obtener entrenamiento especializado antes de intentar este método. Después de la tinción de pescado, se pueden utilizar técnicas inmunofluorescentes para manchar características adicionales de la mucosa huésped.Esto puede permitir la caracterización del daño tisular o las respuestas inmunitarias del huésped. Esta técnica nos ha permitido caracterizar la relación entre la morfología celular de las células fúngicas de los mutantes de Candida albicans y la supervivencia dentro del huésped, mejorando nuestra comprensión de la biología albicans de Candida que se puede aprovechar al desarrollar terapias.

visualization-candida-albicans-murine-gastrointestinal-tract-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la...

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Fuente: Ng, K. M., Tropini, C. Visualización de las interacciones microbiota-huésped intestinal mediante hibridación in situ por fluorescencia, tinción de lectinas e imagen. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demuestra el procedimiento de hibridación fluorescente in situ (FISH) para teñir la microbiota intestinal dentro del tejido intestinal del ratón mediante la hibridación de sondas fluorescentes con ARNr bacteriano (ácido ribonucleico ribosómico) y la contracoloración de las estructuras del...

Hibridación fluorescente in situ de bacterias intestinales en secciones intestinales de ratón

Este video demuestra el desarrollo de un modelo de ratón in vivo para estudiar la formación de biopelículas de Candida albicans en tejido subcutáneo. El experimento consiste en implantar dispositivos infectados con Candida en la región posterior del animal para el desarrollo de la biopelícula.

Candida albicans Formación de biopelículas en un modelo de ratón in vivo

Presentamos un procedimiento experimental de desarrollo de biofilm de Candida albicans en un modelo subcutáneo de ratón. Las biopelículas fúngicas se cuantificaron determinando el número de unidades formadoras de colonias y mediante una imagen de bioluminiscencia no invasiva, donde la cantidad de luz que se produce se corresponde con el número de células viables.

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

Aquí describimos una técnica basada en microscopio para visualizar y cuantificar las cascadas tempranas de eventos durante la fagocitosis de patógenos como los hongos Candida albicans y partículas que miden más de 0,5 μm, incluyendo zymosan y perlas recubiertas de IgG.

La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

Para ver y cuantificar las características internas de las biopelículas de Candida albicans, preparamos especímenes fijos intactos que se clarifican mediante la coincidencia del índice de refracción. A continuación, la microscopía de seccionamiento óptico se puede utilizar para obtener datos de imagen tridimensionales a través del espesor completo de la biopelícula.

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

El ensayo ex vivo descrito en este estudio utilizando extractos de homogeneización intestinal y tinción de inmunofluorescencia representa un método novedoso para examinar la morfogénesis hifágica de Candida albicans en el tracto gastrointestinal. Este método se puede utilizar para investigar las señales ambientales que regulan la transición morfogenética en el intestino.

Un ensayo ex vivo para estudiar Candida albicans Morphogenesis hifal en el tracto gastrointestinal

Este protocolo simplificado detalla un flujo de trabajo para detectar e obtener imágenes de bacterias en muestras de tejido complejo, desde la fijación del tejido hasta la tinción de microbios con hibridación fluorescente in situ .

Visualización de las interacciones entre la microbiota intestinal y el huésped a través de la hibridación fluorescente in situ , la tinción de lectina y la obtención de imágenes

Los microbios intestinales, incluidas las bacterias extracelulares y los patógenos intracelulares como el virus de Orsay y los microsporidios (hongos), a menudo se asocian con nematodos Caenorhabditis silvestres. Este artículo presenta un protocolo para detectar y cuantificar microbios que colonizan y/o infectan nematodos de C. elegans , y para medir la carga de patógenos después de infecciones controladas en el laboratorio.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH) para visualizar la colonización microbiana y la infección en los intestinos de Caenorhabditis elegans

Este manuscrito describe un método para examinar bibliotecas mutantes de Candida albicans de tamaño moderado para fenotipos de morfogénesis durante la infección activa en un huésped mamífero utilizando microscopía confocal no invasiva.

Uso de imágenes in vivo para detectar fenotipos de morfogénesis en cepas mutantes de Candida albicans durante la infección activa en un huésped mamífero

Establecemos un modelo murino de infección relacionada con el catéter (IRC) asociada a C. albicans, en el que se forma una biopelícula en el catéter, y la interacción entre C. albicans y el huésped se correlaciona bien con el IRC clínico. Este modelo ayuda a cribar terapias para el IRC asociado a la biopelícula de C. albicans , sentando las bases para la transformación clínica.

Un modelo de infección por Candida albicans relacionada con catéteres en ratones

Aprende a visualizar Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino mediante hibridación fluorescente in situ. Esta técnica permite identificar su localización y formas morfológicas sin alterar las interacciones tridimensionales con el hospedero.

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

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