Name: Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a aislar microvasos del sistema nervioso central en vertebrados lisencefálicos y giroencefálicos sin ultracentrifugación. Este método permite comparar la microvasculatura entre regiones y especies en un solo día.

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El Dr. Cruz-Orengo contó con el apoyo de la Universidad de California, Davis, School of Veterinary Medicine Start Up Funds.

Todos los procedimientos del presente estudio están de acuerdo con las directrices establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California (UC). El cuidado de animales en UC Davis está regulado por varios recursos independientes y ha sido totalmente acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC) desde 1966. Los tejidos del SNC porcino se obtuvieron del Departamento de Ciencias Animales de la UCD, Laboratorio de Ciencias de la Carne. Los tejidos del SNC de los macacos de rhesus se obtuvieron del Departamento Nacional de Patología del Centro Nacional de Investigación de Primates de California (NIH P51OD011107). El personal del laboratorio no realizó anestesia, eutanasia ni necropsia en cerdos y macacos. Por lo tanto, no hay recomendaciones particulares sobre estas cuestiones.
NOTA: Este método fue validado para múltiples especies, pero el protocolo proporcionado corresponde más directamente a los tejidos de ratón y porcino. Los detalles relativos al lóbulo óptico no se aplican cuando se utilizan especímenes de mamíferos. Todos los materiales biopeligrosos deben manipularse en una instalación adecuada para el nivel de bioseguridad (BSL). Todos los materiales agudamente tóxicos deben manipularse debajo de una campana de humos. Todos los residuos médicos biopeligrosos y los residuos tóxicos agudos deben eliminarse adecuadamente.
1. Preparación
<ol><li>Preparar soluciones (Tabla 1) con al menos un día de antelación. NOTA: Es muy difícil disolver 70 kDa de peso molecular (MW) dextran. Es más eficiente dejar que la solución se revuelva durante la noche cubierta con película de parafina o papel de aluminio. El protocolo requiere el uso de dos soluciones MV-2 diferentes dependiendo de la muestra bajo investigación. El 18% dextran separa eficientemente la mielina del pellet de microvas al realizar el protocolo en pequeñas muestras lissencéfalas. Sin embargo, desarrolla un frotis de mielina dentro de la interfaz de los tejidos del SNC a partir de grandes muestras gyrencéfalos, así como el hipotálamo y la hipófisis de pequeños especímenes. Este frotis se previene mediante el uso de 20% dextran.</li>
	<li>Preparar los toboganes bien cargando 50 ml por pozo de poli-D-lisina y dejar secar durante 2 horas a temperatura ambiente (RT), preferiblemente en un armario de seguridad biológica de clase 2 (BSC-2). No se seque demasiado. Enjuague dos veces con solución salina con fosfato (PBS) y guárdela en el refrigerador hasta que esté lista para usar.</li>
</ol>2. Disección de tejido del SNC del espécimen de vertebrado lisencéfalo pequeño
NOTA: El artículo muestra la aplicación del protocolo en un Ratón macho C57BL6/J, de 10 semanas de edad, 25 g.
<ol><li>Preparar dos tubos cónicos de 15 ml y un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con 5 ml y 1 ml, respectivamente, de solución MV-1 por muestra. Mantenga los tubos en el hielo.</li>
	<li>Anestesia<ol>
<li>Anestetizar ratones por inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina, xilazina y anestésico de acepromaz a 100/10/3 mg por kg de peso corporal y rociar con 70% de etanol. Confirme la anestesia evaluando la ausencia de reflejos palpebrales y de pedales tocando un ojo y pellizcando un pie, respectivamente.</li>
		<li>Anestetizar palomas por inhalación de 5% isoflurano utilizando una caja de anestesia de inducción.</li>
		<li>Anestetizar peces y ranas en 1% Tricaína en un tanque de agua de pescado o solución de Anfibio Ringer(Tabla de Materiales),respectivamente.</li>
		<li>Anestetiza los lagartos enfriándose a 4oC antes de la eutanasia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Decapitar al animal con tijeras quirúrgicas, pelar la piel con fórceps para exponer el cráneo, y cortar con tijeras LaGrange a través del foramen magnum (Figura 1A).</li>
	<li>Diseccionar el cerebro con una espátula y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.</li>
	<li>Recuperar la hipófisis de la sella turcica del cráneo con fórceps y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.</li>
	<li>Retire la piel y el músculo para exponer la columna vertebral. Cortar las extremidades, la caja torácica y los órganos internos(Figura 1B).</li>
	<li>Diseccionar la médula espinal por uno de los dos métodos descritos a continuación. A continuación, transfiera a un tubo cónico de 5 ml con solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo.<ol>
<li>Realizar laminectomía cortando en una dirección rostral a caudal con tijeras LaGrange, comenzando a través del foramen vertebralcervical, hasta llegar al cordón lumbar.</li>
		<li>Realizar el lavado en una dirección caudal a rostral a lo largo del foramen vertebral lumbar con una aguja de 18 G y una jeringa de 10 ml cargada con solución MV-1(Figura 1C,D). NOTA: Este método sólo funciona con especímenes muy pequeños, en su mayoría roedores (<100 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando un endoscopio, corte el saco dural de la médula espinal con tijeras de resorte y retire las meninges restantes con un pico de doble punta(Figura 2).</li>
	<li>Transfiera el cerebro a una placa de Petri y, usando un endoscopio de diselación, retire las meninges con un pico de doble punta(Figura 2A–C).</li>
	<li>Exijo los bulbos olfativos y el tálamo con fórceps, tijeras de iris y tijeras de resorte. Usando la selección de doble punta, retire el plexo coroides de todos los ventrículos cerebrales. Asegúrese de quitar todo el plexo coroides. NOTA: El plexo coroideo y las bombillas olfativas son una fuente masiva de contaminación. A diferencia del BBB, estos capilares están altamente fenestrados y los resultados de los experimentos posteriores se verán comprometidos si no se eliminan.</li>
	<li>Usando fórceps, separe las distintas regiones del SNC: corteza, cerebelo, tronco encefálico, lóbulo óptico (no en muestras de mamíferos) e hipotálamo.</li>
</ol>3. Disección de tejido del SNC de un espécimen de vertebrado gyrencéfalo grande
NOTA: Este protocolo utiliza tejidos del SNC porcinos obtenidos de un matadero. Por lo tanto, no se describe ni muestra anestesia, eutanasia o necropsia aquí.
<ol><li>Transporte los tejidos del SNC porcino en un recipiente de histología de 0,946 L (32 oz) cargado con solución MV-1 dentro de un cofre de hielo/cubo.</li>
	<li>Usando un endoscopio, retire las meninges con un pico de doble punta, fórceps, tijeras de iris y tijeras de resorte de cada tejido del SNC. Asegúrese de eliminar cualquier pedazo del plexo coroides de los ventrículos cerebrales.</li>
</ol>4. Homogeneización del tejido del SNC
NOTA: Es más eficiente cuando dos investigadores participan en el proceso de homogeneización: uno disecing las meninges bajo el estereoscopio y el otro homogeneizar los tejidos picados. De esta manera, los tejidos se devuelven rápidamente al cubo de hielo y se mantienen fríos.
<ol><li>Coloque cada región de CNS en una placa Petri con solución MV-1 de 1 ml de solución. Usando una hoja de un solo borde, pique el tejido para obtener piezas de 1-2 mm.<ol>
<li>Para una pequeña muestra de vertebrados, utilice una placa Petri de 100 mm x 20 mm.</li>
		<li>Para una muestra de vertebrado grande, utilice una placa Petri de 150 mm x 15 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogeneización de un pequeño espécimen vertebrado(Tabla 2 y Tabla 3)<ol>
<li>Transfiera la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y la médula espinal a 1 ml de solución MV-1 en una trituradora individual de tejido de vidrio Potter-Elvehjem de 10 ml con una plaga de PTFE utilizando una pipeta de transferencia. Añadir 5 ml de solución MV-1 y homogeneizar cada tejido (10 golpes). Traslado a tubos cónicos individuales de 15 ml. Mantenga los tubos en el hielo. NOTA: Para un vertebrado pequeño, 5 o 4, con o sin lóbulo óptico, respectivamente, se necesitan 10 mL de amoladoras Potter-Elvehjem y tubos cónicos de 15 ml.</li>
		<li>Transfiera el hipotálamo y la hipófisis con fórceps a 100 l de solución MV-1 en un tubo individual de 1,7 ml y homogeneice cuidadosamente con un micropsto de vidrio. Enjuague cada micropstel con 1 ml de solución MV-1. Mantenga el tubo en el hielo. NOTA: Para un vertebrado pequeño, se necesitan 2 microplagas de vidrio y tubos de 1,7 ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogeneización de un espécimen de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5)<ol>
<li>Usando una pipeta de transferencia, transfiera el tejido picado a una trituradora de tejido de vidrio Potter-Elvehjem de 55 ml con un pestillo de PTFE y adjúntelo al agitador superior. Añadir la mitad del volumen recomendado de la solución MV-1, de acuerdo con la parte específica del SNC que se está homogeneiparando(Tabla 5).</li>
		<li>Encienda el agitador superior a muy baja velocidad (150 rpm) y mueva cuidadosamente el tubo de vidrio hacia arriba y hacia abajo durante unos 30 s.</li>
		<li>Apague el agitador superior, agregue más solución MV-1 y repita el paso 4.3.2 hasta obtener una suspensión homogénea.</li>
		<li>Traslado a un tubo cónico de 50 ml. Mantenga el tubo en el hielo.</li>
		<li>Lave la amoladora con agua desionizada entre cada homogeneización del tejido del SNC. NOTA: Para un vertebrado grande 5 o 4, con o sin materia blanca, respectivamente, se necesitan tubos cónicos de 50 ml. Del mismo modo, se necesitan dos (2) tubos cónicos de 15 ml para el hipotálamo y la hipófisis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Purificación de microvasos
<ol><li>El tejido centrífugo se homogeneiza resultante de los pasos 4.2.1, 4.2.2 o 4.3.4 a 2.000 x g durante 10 min a 4oC. Una gran interfaz blanca de mielina se formará en la parte superior de los pellets de los microvasos rojizos. Descarta los supernatantes.<ol>
<li>Espécimen de vertebrados pequeños(Tabla 2 y Tabla 3)<ol>
<li>Resuspenda la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y los gránulos de la médula espinal en 5 ml de solución MV-2 helada con una pipeta serológica de 5 ml (10 rubores). Añadir 5 ml de solución MV-2 helada a cada suspensión y mezclar cuidadosamente girando los tubos.</li>
			<li>Resuspender el hipotálamo y los pellets pituitaria con 1 ml de solución MV-2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Espécimen de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5)<ol>
<li>Agregue 20 ml de solución MV-2 helada a la corteza, el cerebelo, el tronco encerefálico y los gránulos de microvasola de la médula espinal. Resuspende los pellets mezclando en un agitador de revólver de tubo, revolviendo a 40 rpm durante 5 minutos.</li>
			<li>Resuspenda el hipotálamo y los gránulos de microvasos pituitarioes en 5 ml de solución MV-2 con una pipeta serológica de 5 ml (10 rubores). Añadir 5 ml de solución MV-2 helada a las suspensiones y mezclar cuidadosamente girando el tubo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrífuga a 4.400 x g durante 15 min a 4oC.</li>
	<li>Separe cuidadosamente la gruesa y densa capa de mielina en la interfaz líquida de las paredes de cada tubo girando lentamente los tubos y permitiendo que el sobrenadante pase a lo largo de las paredes.</li>
	<li>Deseche la interfaz de mielina y líquido y borre la pared interior de cada tubo con una espátula envuelta con una toallita de papel de baja pelusa. Para muestras de vertebrados pequeños, retire la capa de mielina de cada hipotálamo y tubo pituitario succionando cuidadosamente con una pipeta de transferencia.</li>
	<li>Limpie el exceso de líquido con una toallita de papel retorcida con poca pelusa. Resuspenda cada pellet con 1 ml de solución MV-3 utilizando puntas de baja unión. Mantenga los tubos en el hielo.</li>
</ol>6. Elución y filtración de microvesseles
<ol><li>Vierta la solución MV-3 helada en vasos individuales para cada región del SNC. Manténgase a 4oC.<ol>
<li>Para muestras de vertebrados pequeños, utilice 10 ml de solución MV-3 por vaso de precipitados de 50 ml. Un total de 6-7 vasos es necesario dependiendo de si el lóbulo óptico está incluido o no.</li>
		<li>Para muestras de vertebrados grandes, utilice 30 ml de solución MV-3 por vaso de precipitados de 100 ml. Un total de 6-7 vasos es necesario dependiendo de si se incluye o no la materia blanca.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque un colador de células encima de un tubo cónico de 50 ml. Utilice uno por región cns. Utilice un colador de 100 m para la corteza, el tronco encefálico, el lóbulo óptico, la médula espinal y la hipófisis. Utilice un colador de células de 70 m para el cerebelo y el hipotálamo.</li>
	<li>Humedezca cada colador con 1 ml de solución MV-3 helada.</li>
	<li>Añadir más solución MV-3 a las suspensiones preparadas en el paso 5.5 con una pipeta serológica mientras se mezcla para evitar agregados. Cargue cuidadosamente los microvasos en la parte superior del colador. Enjuague con solución MV-3 helada.<ol>
<li>Para pequeños muestras de vertebrados(Tabla 2 y Tabla 3),añadir 10–15 ml de solución MV-3 con una pipeta serológica y enjuagar con 5 ml de solución MV-3.</li>
		<li>Para muestras de vertebrados grandes, agregue 20 ml de solución MV-3 con una pipeta serológica y enjuague con 10 ml de solución MV-3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montar la unidad de filtración colocando un filtro de red de nylon de 20 m en un soporte de filtro modificado(Figura 2D),uno por región CNS.<ol>
<li>Para muestras de vertebrados pequeños(Tabla 2 y Tabla 3),utilice soportes de filtro modificados de 25 mm para la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico, el lóbulo óptico y la médula espinal. Utilice soportes de filtro modificados de 13 mm para el hipotálamo y la hipófisis.</li>
		<li>Para muestras de vertebrados grandes(Tabla 4 y Tabla 5),utilice soportes de filtro modificados de 47 mm para la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal. Utilice 25 mm para el hipotálamo y la hipófisis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el filtro en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml y un filtro húmedo con 5 ml de solución MV-3 helada, asegurándose de que el tampón vierta por el soporte del filtro hasta el tubo cónico.</li>
	<li>Transfiera los microvasos eludados (del paso 6.4) en la parte superior del filtro de red de nylon de 20 m y enjuague los microrecipientes con 5-10 ml de solución MV-3 helada.</li>
	<li>Recupere el filtro con fórceps limpios y sumerjalo en el vaso de precipitados que contiene la solución MV-3 helada preparada en el paso 6.1.</li>
	<li>Separe los microrecipientes del filtro sacudiéndolo suavemente durante unos 30 s. Para pequeños especímenes de vertebrados, vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo cónico de 15 ml. Para muestras de vertebrados grandes, vierta el contenido del vaso de precipitados en un tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC y resuspender el pellet en 1 ml de solución MV-3 helada con una punta de pipeta de baja unión.<ol>
<li>Para muestras de vertebrados pequeños, transfiera la suspensión (del paso 6.10) a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml y centrífuga a 20.000 x g durante 5 min a 4 oC. NOTA: Este giro se realiza en una centrífuga de sobremesa a máxima velocidad (20.000 x g)para garantizar un rendimiento robusto.</li>
		<li>Para muestras de vertebrados grandes, transfiera la suspensión del paso 6.10 a un tubo de microcentrífuga de 5,0 ml, añada 4 ml de solución MV-3 y centrífuga a 2.000 x g durante 5 min a 4 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Inmunomanchación
NOTA: La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se realizó en reptiles, anfibios y especímenes de peces como prueba de concepto de la viabilidad del protocolo. Por lo tanto, no hay ninguna recomendación para el inmunoetiquetado de estos especímenes.
<ol><li>Retire el sobrenadante de los tubos de microcentrífuga.</li>
	<li>Resuspenda el pellet en 1 PBS estéril usando una punta de pipeta de baja unión(Tabla de Materiales). Evitar que los microvasos formen agregados pipeteando varias veces. Para muestras de vertebrados pequeños(Tabla 3),utilice de 100 a 2.000 ol de acuerdo con el tamaño del pellet. Para especímenes de vertebrados grandes(Tabla 5),utilice de 1.000 a 4.000 l de acuerdo con el tamaño del pellet.</li>
	<li>Usando una punta de pipeta de baja unión, transfiera los microvas a diapositivas de pozo, teniendo cuidado de agregarlos al centro de cada pocal, evitando las paredes laterales.</li>
	<li>Ajuste las diapositivas del pozo, descubiertas, dentro de un BSC-2, y deje secar durante 20 a 30 minutos en RT. NOTA: Se utiliza un volumen relativamente alto de 1x PBS para evitar la formación de agregados. Debido a esto, es necesario dejar que las diapositivas se sequen antes de la fijación para asegurarse de que los microrecipientes están siendo sostenidos por el recubrimiento de poli-D-lisina.</li>
	<li>Retire el PBS residual 1x pipeteando con una pipeta de transferencia, agregue 200 éL de 4% de paraformaldehído (PFA) e incubar durante 30 minutos en RT.</li>
	<li>Pipetear la solución fijativa y lavar 3x con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT. NOTA: En este punto se realizaron manchas de H&E en microvas de sNC de pescado, anfibios y reptiles.</li>
	<li>Añadir 200 s de tampón de bloqueo a la diapositiva del pozo e incubar durante 60 min a 37 oC.</li>
	<li>Retire el tampón de bloqueo con una pipeta de transferencia y añada 200 ml del cóctel de anticuerpos primarios en diluyente de anticuerpos(Tabla de materiales). Incubar a 4oC durante la noche.</li>
	<li>Pipetear el cóctel primario de anticuerpos y lavar 3 veces con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT.</li>
	<li>Cargar el cóctel secundario de anticuerpos(Tabla de Materiales)diluido en 1x PBS e incubar durante 2 h a RT, protegido de la luz.</li>
	<li>Pipetear el cóctel secundario de anticuerpos y lavar 3 veces con 200 éL de 1x PBS durante 5 min a RT, protegido de la luz. Después del último lavado, desenganche el marco del well-slide y seque cualquier exceso de 1x PBS con una toallita de papel de pelusa baja.</li>
	<li>Agregue un soporte de montaje antidescolora líquido y un medio de montaje antidescolora líquido de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) para la tinción nuclear. Dejar secar durante la noche en RT protegido de la luz.</li>
	<li>Una vez seco, manténgase protegido de la luz en una caja deslizante a 4 oC hasta que esté listo para la microscopía confocal y la adquisición de datos.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El BBB incluye las propiedades únicas de las células endoteliales de microvasculatura cerebral del cerebro acopladas por una sofisticada arquitectura de uniones estrechas, adheridas, "peg-socket", y placas de adhesión críticas para la homeostasisdelSNC2,3,19. Las propiedades de las células endoteliales son inducidas y mantenidas por pericitos y los procesos de pie final de la astroglia circundante2,<...

Nuestro cerebro es el órgano más importante de nuestro cuerpo. Por esta razón, mantener la homeostasis cerebral a pesar de factores externos que pueden desencadenar una desviación de la normalidad es una prioridad. Según algunos eruditos, hace unos 400-500 millones de años1, los animales vertebrados desarrollaron lo que ahora conocemos como la barrera hematoencefálica (BBB)2,3. Esta "cerca" protectora ejerce la mayor influencia sobre la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) y funciona regulando estrechamente el transporte de iones, moléculas y células entre la sangre y el parénquima del SNC. Cuando el BBB se interrumpe, el cerebro se vuelve susceptible a la exposición tóxica, infección, y la inflamación. Por lo tanto, la disfunción BBB se asocia con muchos, si no todos, trastornos neurológicos y neurodesarrollo4,5,6.
La sofisticada función del BBB se atribuye a la microvasculatura única del SNC conformada por la unidad neurovascular (NVU)2,3. Células endoteliales altamente especializadas, pericitas y pies de punta astrocíticos son los componentes celulares de la NVU2,3. La matriz extracelular generada por estas células también es esencial para la fisiología NVU y BBB2,3. Aunque los componentes celulares y moleculares esenciales de la NVU se conservan entre los vertebrados, la heterogeneidad se reporta entre las órdenes y las especies7,8. Sin embargo, las limitaciones técnicas impiden nuestra capacidad de considerar plenamente estas diferencias en la neurobiología, la investigación biomédica o traslacional.
Debido a esto, ampliamos un método de aislamiento de microbuques específico de la región del SNC para hacerlo aplicable a numerosas especies de los cinco grupos de vertebrados: peces, anfibios, reptiles, aves y mamíferos. El protocolo se describe para su uso en vertebrados lisencéfalos y grandes, incluidas las especies con relevancia traslacional9. Además, incluimos otras regiones del SNC no investigadas antes en este contexto, pero relevantes para la neurofisiología y con tremendas implicaciones clínicas: el hipotálamo, la hipófisis y la materia blanca. Por último, probamos la capacidad de este método de aislamiento como una herramienta fiable para identificar cambios en la expresión proteica a lo largo de la NVU y/o BBB9,10,11. Como prueba de concepto, mostramos cómo determinar los cambios en la expresión VCAM-1 y JAM-B durante EAE utilizando el método de aislamiento seguido de inmunofluorescencia.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>BP39920</td><td>Se utiliza para bloquear y diluir anticuerpos.</td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>15713-S</td><td>Utilizado como fijador (4% PFA)</td></tr><tr><td>70.000 MW Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>9004-54-0</td><td>Utilizado para solución MV-2</td></tr><tr><td>Pinzas Adson Fine</td><td>Science Tools (FST)</td><td>11006-12</td><td>Utilizado para la extirpación de músculo y piel</td></tr><tr><td>Pinzas Adson, calidad</td> estudiantil <td>FST</td><td>91106-12</td><td>Igual que el anterior pero más barato</td></tr><tr><td>Suero bovino albúmina (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Se utiliza para la solución MV-3, bloqueo y diluyente de anticuerpos</td></tr><tr><td>Corning 100 &mu; m Colador de células</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431752-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 &mu; m Colador de celdas</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431751-50EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning Deskwork puntas de encuadernación baja</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS4151</td><td>Igual que a continuación pero más barato.</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lisine</td><td>R& D</td><td>3439-100-01</td><td>Utilizado para el recubrimiento de portaobjetos</td></tr><tr><td>Burro anti-Cabra IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21432</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21202</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Burro anti-Conejo IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A21206</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Burro anti-Conejo IgG-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>A31573</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Burro anti-Rata IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10029</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Pico de tejido de doble punta</td><td>FST</td><td>18067-11</td><td>Se utiliza para la extirpación de meninges y plexo coroideo</td></tr><tr><td>Pinzas de #3c Dumont</td><td>FST</td><td>11231-20</td><td>Se utiliza para la manipulación de tejidos más delicados y/o pequeños del SNC (como la hipófisis)</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td>Se utilizan para la disección y manipulación del SNC</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7, estudiante</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td>Igual que el anterior pero </td></tr><tr><td>Puntas ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention más</td> baratas <td>Eppendorf</td><td>22493008</td><td>Mejor calidad que las puntas anteriores (más caras).</td></tr><tr><td>Pinzas de Graefe extrafinas, dentadas</td><td>FST</td><td>11151-10</td><td>Se utilizan para la extracción de huesos</td></tr><tr><td>Tijeras finas, afiladas</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Se utilizan para la extracción de saco dural de cerdo y macaco</td></tr><tr><td>Mortero de vidrio 1,5 mL Homogeneizador de tubo de microcentrífuga Homogeneizador, paquete de 10</td><td>Chang Bioscience Inc. (eBay)</td><td>GP1.5_10</td><td>Se utiliza para el hipotátalo y la hipófisis de pequeños vetebrados.</td></tr><tr><td>Cabra anti-CXCL12, biotinilado</td><td>PeproTech</td><td>500-P87BGBT</td><td>Se utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Dilución recomendada: 1:20.</td></tr><tr><td>Cabra anti-JAM-B</td><td>R& D</td><td>AF1074</td><td>Se utiliza como anticuerpo primario para evaluar la neuroinflamación. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG-ALEXA 488</td><td>Thermo</td><td>A11001</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21424</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-PDGFR&beta;</td><td>R& D</td><td>AF1042</td><td>Se utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo IgG-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>A21249</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo IgG-DyLight 488</td><td>Thermo</td><td>35552</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Cabra anti-Rata IgG-DyLight 650</td><td>Thermo</td><td>SA5-10021</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Pinzas Graefe, punta curvada, 1X2 dientes</td><td>FST</td><td>11054-10</td><td>Uso para la sujeción y agitación de la red de filtro de nailon</td></tr><tr><td>HBSS, tampón 1X con calcio y magnesio</td><td>Corning</td><td>21-022-CM</td><td>Utilizado para solución MV-1</td></tr><tr><td>HEPES, tampón líquido 1M</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td>Utilizado para la solución MV-1</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4-Biotina-XX</td><td>ThermoFisher Scientific (Thermo)</td><td>I21414</td><td>Glicoproteína aislada de la leguminosa Griffonia simplicifolia que se une a los residuos de D-galactosil del glicocálido de las células endoteliales. Se utiliza para microbuques del SNC aviar y porcino. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Tijeras LaGrange, dentadas</td><td>FST</td><td>14173-12</td><td>Utilizadas para la disección de cráneo y laminectomía (excepto cerdo y macaco)</td></tr><tr><td>Portaobjetos Millicell EZ Unidad de 8 pocillos</td><td>Millipore Sigma PEZGS0816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-CLDN5</td><td>Thermo</td><td>35-2500</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Ratón anti-GGT1</td><td>Abcam</td><td>ab55138</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Ratón anti-humano CD31 R</td><td>& D</td><td>BBA7</td><td>Se utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de los primates. Concentración recomendada: 16,5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Ratón anti-NFM</td><td>Thermo</td><td>RMO-270</td><td>Se utiliza como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Ratón anti-&alpha;SMA</td><td>Thermo</td><td>MA5-11547</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Red filtrante de nylon, rollo</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY6000010</td><td>Discos de red filtrante cortados con láser a 13 mm de diámetro. Se utiliza para el hipotátalo y la hipófisis de pequeños vetebrados.</td></tr><tr><td>Redes filtrantes de nylon, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2002500</td><td>Se utilizan en la mayoría de los tejidos del SNC de los vertebrados pequeños, excepto el hipotálamo y la hipófisis. Se utiliza para el hipotálamo y la hipófisis de macacos y cerdos.</td></tr><tr><td>Redes filtrantes de nylon, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>NY2004700</td><td>Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos, excepto el hipotálamo y la hipófisis.</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración ProLong Gold con DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td>Se utiliza para cubrir portaobjetos.</td></tr><tr><td>Conejo anti-AQP4</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5971</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Millipore Sigma de</td> <td>conejo</td><td>SAB2107967</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Conejo anti-NG2</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5320</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todas las muestras. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Anti-OSP de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab53041</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 1 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Conejo anti-VE-Cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Conejo anti-ZO-1</td><td>Thermo</td><td>61-7300</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en microvasos del SNC de todos los especímenes. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Rata anti-CD31</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 550274</td><td>Se utiliza como anticuerpo primario para los microvasos del SNC murino. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Rat anti-GFAP</td><td>Thermo</td><td>13-0300</td><td>Utilizado como anticuerpo primario en los microvasos del SNC de todos los especímenes. Dilución recomendada de 1:200.</td></tr><tr><td>Rata anti-VCAM-1</td><td>Becton Dickinson</td><td>BD 553329</td><td>Se utiliza como anticuerpo primario para evaluar la neuroinflamación. Concentración recomendada: 5 &mu; g/mL.</td></tr><tr><td>Solución estéril de Ringer, Frog</td><td>Aldon Corporation</td><td>IS5066</td><td>Utilizado para la anestesia amfibiana</td></tr><tr><td>Streptavidin-ALEXA 555</td><td>Thermo</td><td>S32355</td><td>Se utiliza como anticuerpo secundario para marcar anticuerpos primarios biotinilados. Dilución recomendada de 1:500.</td></tr><tr><td>Estreptavidina-ALEXA 647</td><td>Thermo</td><td>S32357</td><td>Se utiliza como anticuerpo secundario para marcar anticuerpos primarios biotinilados. Dilución recomendada de 1:500.</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas, afiladas</td><td>FST</td><td>14002-12</td><td>Utilizadas para la extirpación de músculo y piel</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas, afiladas-romas</td><td>FST</td><td>14001-16</td><td>Utilizadas para la decapitación (excepto cerdo y macaco)</td></tr><tr><td>Swinnex Portafiltros, 13 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0001300</td><td>Modificado por corte láser. Se utiliza para el hipotátalo y la hipófisis de pequeños vetebrados.</td></tr><tr><td>Portafiltros Swinnex, 25 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0002500</td><td>Modificado por corte láser. Se utiliza en la mayoría de los tejidos del SNC de los vertebrados pequeños, excepto el hipotálamo y la hipófisis. Se utiliza para el hipotálamo y la hipófisis de macacos y cerdos.</td></tr><tr><td>Portafiltros Swinnex, 47 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SX0004700</td><td>Modificado por corte láser. Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos, excepto el hipotálamo y la hipófisis.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>50-165-7277</td><td>Se utiliza para bloquear y diluir anticuerpos.</td></tr><tr><td>Wheaton 120 Vac Agitador aéreo</td><td>VWR (Proveedor DWK Life Sciences)</td><td>62400-904 (DWK #903475)</td><td>Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos con trituradora de tejidos de 55 mL, excepto el hipotálamo y la hipófisis.</td></tr><tr><td>Trituradora de tejidos Wheaton Potter-Elvehjem con mortero de PTFE, 10 mL</td><td>VWR (Proveedor DWK Life Sciences)</td><td>14231-384 (DWK #357979)</td><td>Se utiliza en la mayoría de los tejidos del SNC de los vertebrados pequeños, excepto el hipotálamo y la hipófisis. Se utiliza para el hipotálamo y la hipófisis de macacos y cerdos.</td></tr><tr><td>Trituradora de tejidos Wheaton Potter-Elvehjem con mortero de PTFE, 55 mL</td><td>VWR (Proveedor DWK Life Sciences)</td><td>14231-372 (DWK #357994)</td><td>Se utiliza para tejidos del SNC de macacos y cerdos, excepto el hipotálamo y la hipófisis.</td></tr></tbody></table>

aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

El aislamiento de los microvasculares del sistema nervioso central (SNC) se realiza comúnmente mediante la combinación de tejido cortical de múltiples animales, la mayoría de las veces roedores. Este enfoque limita el interrogatorio de las propiedades de la barrera hematoencefálica (BBB) a la corteza y no permite la comparación individual. Este proyecto se centra en el desarrollo de un método de aislamiento que permite la comparación de la unidad neurovascular (NVU) de múltiples regiones del SNC: corteza, cerebelo, lóbulo óptico, hipotálamo, hipófisis, tronco encefálico y médula espinal. Además, este protocolo, desarrollado originalmente para muestras murinas, fue adaptado con éxito para su uso en tejidos del SNC de especies de vertebrados pequeños y grandes de los que también somos capaces de aislar microvas de la materia blanca del hemisferio cerebral. Este método, cuando se combina con inmunoetiquetado, permite la cuantificación de la expresión de proteínas y la comparación estadística entre individuos, tipo de tejido o tratamiento. Demostramos esta aplicabilidad evaluando los cambios en la expresión de proteínas durante la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo murino de una enfermedad neuroinflamatoria, esclerosis múltiple. Además, los microbuques aislados por este método podrían utilizarse para aplicaciones posteriores como qPCR, RNA-seq y Western blot, entre otros. Aunque este no es el primer intento de aislar los microrridos del SNC sin el uso de ultracentrifugación o disociación enzimática, es único en su adecuación para la comparación de individuos individuales y múltiples regiones del SNC. Por lo tanto, permite la investigación de una gama de diferencias que de otro modo pueden permanecer oscuras: porciones del SNC (córtex, cerebelo, lóbulo óptico, tronco encefálico, hipotálamo, hipófisis y médula espinal), tipo de tejido del SNC (materia gris o blanca), individuos, grupos de tratamiento experimental, y las especies.

Los microvasos aislados del SNC murino mostraron todos los componentes celulares intrínsecos de la unidad neurovascular2,3. Usando molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM, también conocida como CD31) o isolctina IB4 (una glicoproteína que une la célula endotelial glicocalyx) para células endoteliales, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) o antígeno de la neurona-glial 2 (NG2) para peric...

El objetivo de este protocolo es aislar los microvasculares de múltiples regiones del sistema nervioso central de vertebrados lisencéfalos y gyrencéfalos.

Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Este protocolo es significativo porque permite la comparación de la microvasculatura entre diferentes regiones del sistema nervioso central, así como entre diferentes individuos. Esta técnica de aislamiento de microcuelos se puede completar en un solo día, y elimina la necesidad de ultracentrifugación y disociación enzimática. Extirpar las meninges y el plexo coroides puede ser difícil.Asegúrese de trabajar lentamente y cuidadosamente para asegurar la eliminación completa de cada tejido. Para la disección de tejido del SNC de un pequeño espécimen de vertebrado lissencéfalo, coloque el cerebro cosechado en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga solución MV-1 sobre hielo, y use fórceps para recuperar la hipófisis de la sella turcica del cráneo. Coloque la hipófisis en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros de solución mv-1 sobre hielo, y retire la piel y el músculo para exponer la columna vertebral.Después de extraer las extremidades, la caja torácica y los órganos internos, utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 18 para vaciar la columna vertebral con una solución fresca de MV-1, en una dirección caudal-rostral en todo el foramen vertebral lumbar. A continuación, coloque la médula espinal en un tubo de 5 mililitros que contenga una solución de MV-1 fresca. A continuación, coloca el cerebro en una placa de Petri bajo el microscopio de disección y retira las meninges con un pinchazo de doble punta.Asegúrese de revisar la médula espinal para asegurarse de que no queden trozos de meninges. Utilice los fórceps para separar el hipotálamo, el cerebelo, el tallo cerebral y la corteza. Cuando sea necesario, utilice fórceps e iris y tijeras de resorte para extirpar las bombillas olfativas y el tálamo, y utilice el pinchazo de doble punta para eliminar todo el plexo coroides de todos los ventrículos cerebrales.Para la disección de tejido del SNC de una gran muestra de vertebrados girofalálicos, utilice un microscopio diseccionador y un pinchazo de doble punta, fórceps y tijeras de iris y resorte para eliminar las meninges de cada tejido del SNC, teniendo cuidado de eliminar cualquier pedazo de plexo coroideo de los ventrículos cerebrales. Para la homogeneización de los tejidos cosechados del SNC, pica cada región del SNC en trozos de uno a dos milímetros dentro de los platos individuales de Petri. Para homogeneizar los tejidos del SNC a partir de pequeñas muestras de vertebrados, utilice una pipeta de transferencia para añadir un mililitro de solución MV-1 para suspender el tejido picado.Luego utilice la misma pipeta de transferencia para dispensar la corteza, el cerebelo, el tallo cerebral, el lóbulo óptico y las piezas de la médula espinal en amoladoras individuales de tejido de vidrio de 10 mililitros, y utilice un pestillo de PTFE y cinco mililitros de solución MV-1 para moler cada conjunto de tejidos durante unos 10 trazos. Transfiera cada suspensión de tejido en tubos cónicos individuales de 15 mililitros sobre hielo, y use fórceps para colocar el hipotálamo y la hipófisis en 100 microlitros de solución MV-1, en tubos individuales de 1,7 mililitros. Luego, homogeneizar cuidadosamente cada tejido con una micropesta de vidrio.Para homogeneizar una muestra de vertebrado grande, utilice una pipeta de transferencia de corte biselado para transferir el tejido picado a una trituradora de tejido de vidrio de 55 mililitros, y unir la amoladora a un agitador superior. Agregue la mitad del volumen recomendado de la solución MV-1 de acuerdo con la porción específica del SNC que se homogeneiza como se indica en la tabla, y encienda el agitador superior a aproximadamente 150 rotaciones por minuto. Mueva cuidadosamente el tubo de vidrio hacia arriba y hacia abajo durante unos 30 segundos antes de apagar el agitador superior para agregar más solución MV-1 para una homogeneización adicional, hasta obtener una suspensión homogénea.A continuación, transfiera el tejido homogeneizado a un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Para la purificación de microvajillones, el tejido del SNC homogeneiza por centrifugación y desecha los sobrenadantes. Para un pequeño aislamiento de microvajón de muestra de vertebrados, pipetee la corteza, el cerebelo, el tallo cerebral, el lóbulo óptico y los gránulos de la médula espinal, en cinco mililitros de solución MV-2 fresca y helada por muestra, unas 10 veces, antes de agregar cinco mililitros más de solución MV-2 helada a cada tubo.Voltear cuidadosamente los tubos para mezclar, y volver a suspender el hipotálamo y pellets pituitarios en un mililitro de solución MV-2. Para el aislamiento de microvajillones de muestras de vertebrados grandes, agregue 20 mililitros de solución de MV-2 helada a la corteza, cerebelo, tallo cerebral y pellets de microvajimos de la médula espinal, y vuelva a suspender los gránulos en un revólver de tubo a 40 rotaciones por minuto durante unos 5 minutos. Al final de la re-suspensión, separar el tejido del SNC lycates por centrifugación, y girar lentamente cada tubo para permitir que el sobrenadante pase a lo largo de la pared para separar cuidadosamente la capa de mielina gruesa y densa en la interfaz líquida de las paredes del tubo.Deseche las interfaces de mielina y líquido, y borre la pared interior de cada tubo con una espátula envuelta con una toallita de papel de baja pelusa. Luego, utilice una toallita de papel retorcida de baja pelusa para absorber el exceso de líquido, y use puntas de baja unión para volver a suspender cada pellet en un mililitro de solución MV-3. Para la elución y filtración de microvajillones, mezcle unos pocos mililitros de solución de MV-3 fresco para cada lodo de microvajillones de tejido del SNC, y mientras se mezcla para evitar agregados, colalice cada suspensión a través de un colador Pruitt en tubos cónicos individuales de 50 mililitros.Coloque un filtro de red de nylon de 20 micrómetros en un soporte de filtro modificado por región del SNC. Transfiera el soporte del filtro a un tubo cónico de 50 mililitros y moje el filtro con cinco mililitros de solución MV-3 helada, asegurándose de que el tampón vierta por el soporte del filtro, en el tubo cónico. Transfiera los microvajillones eluidos a cada filtro de red de nylon de 20 micrómetros y enjuague los microvajillones con cinco a 10 mililitros de solución mv-3 helada.Utilice fórceps para transferir cada filtro a vasos individuales que contengan la solución MV-3 helada, y agite suavemente cada filtro durante unos 30 segundos para separar las microvajillones. Después de transferir a un tubo cónico de 15 mililitros, recoja los microvajillones por centrifugación y utilice una pipeta de baja unión para volver a suspender cada pellet en un mililitro de solución de MV-3 helada. A continuación, transfiera las suspensiones de microvajillones de pequeños especímenes vertebrados a un tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros para centrifugación durante cinco minutos a 20.000 veces G, en cuatro grados centígrados.Para especímenes de vertebrados grandes, transfiera la suspensión a tubos individuales de centrífuga de cinco mililitros y agregue cuatro mililitros de solución MV-3 para centrifugación durante cinco minutos a 2.000 veces G en cuatro grados centígrados. Los componentes intrínsecos de la unidad neurovascular se pueden detectar en microvasculares, aislados como se ha demostrado, mediante inmunoetiquetado para CD31, PDGFR-beta y aquaporina cuatro, incluidos los microvasculares corticales, cerebelosos, hipófilos, hipotalámicos, cerebrales y espinales. Del mismo modo, se puede visualizar la expresión de la proteína de unión adherens-unión VE-cadherina, las proteínas de unión apretada CLDN5 y Zonula Occludens-1, la angulina-1 de proteína de unión tricelular y las marcas basales chemokina ligando CXCL motif 12, y gamma-glutamyltransferase-1.Además, la mayoría de los microvajillones están desprovistos de la expresión de actina muscular lisa alfa, lo que indica que este protocolo de aislamiento se dirige selectivamente a microcubares de pequeño calibre. Los microvasculares obtenidos de otros pequeños vertebrados lissencéfalos, como el ave, el mentiroso, la rana y el pez, comparten algunas características morfológicas, lo que sugiere que este método es útil para una mayor caracterización de las diferencias en las unidades neurovasculares entre las especies. La cuantificación de los cambios en la expresión de proteínas revela un aumento en la molécula de adhesión de células vasculares uno, y la molécula de adhesión unión B a lo largo de microvasculares de la médula espinal, durante el pico de la encefalomielitis autoinmune experimental.Sin embargo, molécula de adhesión de células vasculares uno también se incrementa significativamente en microvasculares pituitarias, y disminuyó en el hipotálamo y microvasculares de tronco cerebral. Además, se observan cambios en la molécula de adhesión de células vasculares una expresión durante la encefalomielitis autoinmune experimental crónica en todos los tejidos del SNC, y en la expresión de la molécula de adhesión de unión B en el hipotálamo y los microvasculares pituitarios. Los análisis cuantitativos, como la mancha occidental, la PCR y la inmunohistoquímica, se pueden realizar siguiendo este procedimiento para revelar información sobre los patrones de expresión de genes y proteínas dentro de la barrera hematoencefálica.El paraformaldehído es un reactivo agudamente tóxico y siempre debe manipularse bajo la campana de humos mientras se usa un EPP adecuado.

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Investigación

JoVE Journal

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Neurociencia

Este video muestra el aislamiento de vasos intactos del cerebro de un ratón que constituyen la barrera hematoencefálica (BBB) junto con las neuronas y las células gliales. Los vasos aislados se pueden utilizar como modelo in vitro para estudiar su papel en el mantenimiento de la homeostasis cerebral.

Aislamiento de vasos cerebrales de ratón: un protocolo para aislar vasos intactos de una muestra de cerebro murino

Este video muestra el proceso de aislar microvasos cerebrales de ratas sacrificadas. Incluye la disección del cerebro, la limpieza del tejido y la digestión mecánica, seguida de una centrifugación repetida para aislar la fracción pura de los microvasos.

Un método para el aislamiento de unidades neurovasculares a partir de cerebro de rata

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) están interconectadas por proteínas de unión específicas que forman una barrera altamente regulada que separa la sangre y el sistema nervioso central (SNC), la llamada barrera hematoencefálica (BBB). El aislamiento de las células endoteliales microvasculares primarias del cerebro murino, como se discute en este protocolo, permite estudios detallados in vitro de la BHE.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

Describimos un protocolo que permite la purificación del compartimento vascular del cerebro del ratón. Los vasos cerebrales aislados incluyen células endoteliales unidas por uniones estrechas y rodeadas por una lámina basal continua, pericitos, células musculares lisas vasculares, así como membranas astrogliales perivasculares.

La purificación de los buques de cerebro de ratón

Este manuscrito describe un protocolo simple y reproducible para el aislamiento de arteriolas intracerebrales (un grupo de vasos sanguíneos que abarcan arteriolas parenquimatosas, arteriolas penetrantes y arteriolas precapilares) de ratones, para ser utilizado en miografía a presión, inmunofluorescencia, bioquímica y estudios moleculares.

El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas

Tubos capilares del cerebro aislado de tejido de cerebro humano pueden utilizarse como un modelo preclínico para estudiar la función de barrera bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Aquí, presentamos un protocolo optimizado para aislar los capilares del cerebro del tejido de cerebro humano fresco.

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Aquí, se describe un método para el aislamiento de microvasos de cerebro de rata y para la preparación de las muestras de la membrana. Este protocolo tiene la ventaja clara de producir enriquecido microvessel muestras con proteínas aceptable rendimiento de animales individuales. Muestras pueden utilizarse para análisis de proteína sólida en el endotelio microvascular cerebral.

Un método Simple y Reproducible para preparar muestras de membrana de microvasos de cerebro recién aislado de rata

Este artículo presenta dos protocolos optimizados para examinar las células inmunitarias residentes y derivadas periféricas dentro del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal y las meninges. Cada uno de estos protocolos ayuda a determinar la función y composición de las células que ocupan estos compartimentos en estado estacionario y en condiciones inflamatorias.

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Aprende a aislar microvasos del sistema nervioso central en vertebrados lisencefálicos y giroencefálicos sin ultracentrifugación. Este método permite comparar la microvasculatura entre regiones y especies en un solo día.

Aislamiento confiable de microvasculares del sistema nervioso central en cinco grupos de vertebrados

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