Name: Migración, Chemo-Atracción, y Co-Cultura Ensayos para Células Endoteliales Derivadas de Células Madre Humanas y Neuronas GABAérgicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende ensayos de migración, co-cultura y quimio-atracción para estudiar interacciones entre células endoteliales periventriculares humanas e interneuronas GABAérgicas. Estos métodos simples permiten medir migración celular a larga distancia y explorar mecanismos de trastornos psiquiátricos.

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Este trabajo fue apoyado por premios del Instituto Nacional de Salud Mental (R01MH110438) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (R01NS100808) a AV.

1. Cultivo y almacenamiento de células endoteliales periventriculares humanas
<ol><li>Mantener las células endoteliales periventriculares humanas en la matriz de membrana del sótano recubiertas (ver Tabla de Materiales) placas de 6 pocillos en medio de células endoteliales periventriculares (medio E6 que contiene 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 y 5 oM GABA) a 37 oC y 5% deCO2. Cambie el medio cada día alterno.</li>
	<li>Descongelar la matriz de membrana del sótano en 4oC y hacer una solución de 1:100 diluyéndola en medio DMEM/F12 frío. Cubra cada pocal de una placa de 6 pocillos con 1 ml de solución de matriz. Incubar placas a 37oC durante al menos 1 h antes de su uso.</li>
	<li>Permita que las células endoteliales periventriculares humanas alcancen una confluencia del 80%-90%. Aspirar medio del pozo. Lave los pozos una vez con 1 ml de PBS estéril 1x por poca.</li>
	<li>Separe las celdas agregando 1 ml de solución de disociación celular (ver Tabla de materiales)por pozo. Incubar a 37oC durante 5 min. Después de 5 min, añadir 1 mL de medio de célula sendotelial periventricular. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 ml. NOTA: Utilizamos Accutase para la disociación celular aquí, a diferencia de TrypLE en las secciones 3 y 4.</li>
	<li>Células centrífugas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 ml de medio celular endotelial periventricular.</li>
	<li>Cuente las celdas vivas usando el método de exclusión azul trypan. Células de semillas en placas recubiertas con matriz fresca a una densidad de 1,2 x 105 celdas/cm2. Incubar a 37oC y 5% CO2.</li>
	<li>Almacenar células endoteliales periventriculares humanas mediante crioconservación en medio de congelación (90% medio de células endoteliales periventriculares y 10% DMSO).<ol>
<li>Disociar y recoger células siguiendo los pasos 1.3 y 1.4 anteriores. Cuente las celdas de la solución mediante el método de exclusión azul trypan.</li>
		<li>Células centrífugas a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular a 5 x 106 células / ml de medio de congelación.</li>
		<li>Dispensar 1 ml de células medianas de congelación más por criovial. Colocar los viales en una cámara llena de isopropanol y enfriar durante la noche en -80 oC a 1 oC/min. Transfiera los viales a un tanque de nitrógeno líquido al día siguiente para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de células endoteliales periventriculares humanas para el ensayo
<ol><li>Permita que las células endoteliales periventriculares humanas alcancen una confluencia del 70%-80%.</li>
	<li>Disociar las células siguiendo los pasos 1.3 a 1.5 como se describió anteriormente. Cuente las celdas mediante el método de exclusión azul trypan.</li>
</ol>3. Preparación de interneuronas GABAérgicas humanas para el ensayo
NOTA: Las interneuronas GABAérgicas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (iPSC) y el medio neuronal se compraron comercialmente (ver Tabla de Materiales). Las neuronas se generan diferenciando una línea iPSC derivada de fibroblastos humanos siguiendo un protocolo desarrollado por el fabricante. Las células fueron desconditadas y cultivadas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
<ol><li>Descongelar las interneuronas GABAérgicas humanas y cultivarlas en placa de 12 pocillos durante dos semanas a una confluencia de 70%-80%.</li>
	<li>El día del ensayo, solución de disociación de células calientes (ver Tabla de Materiales)y una alícuota de medio neuronal a 37oC durante 10 min antes de su uso.</li>
	<li>Aspirar el medio de cada pocal que contiene las células. Lavar las células con 1 ml de PBS estéril 1x por poca.</li>
	<li>Separar las células mediante la adición de 0,5 ml de solución de disociación precalentada por pozo e incubar a 37 oC durante 5 min. Añadir 1 mL de medio neuronal por poca. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 ml. Triturar suavemente para disociar los grumos celulares.</li>
	<li>Células centrífugas a 380 x g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 ml de medio neuronal. Cuente las celdas vivas usando el método de exclusión azul trypan.</li>
</ol>4. Preparación de control de células endoteliales humanas para el ensayo
NOTA: El control de las células endoteliales derivadas de iPSC humanas y el medio celular endotelial se compraron comercialmente(Tabla de materiales). Estas células endoteliales se generan diferenciando una línea iPSC derivada de fibroblastos humanos al destino endotelial siguiendo un protocolo desarrollado por el fabricante. Las células fueron desconectadas y cultivadas en sustrato de fibronectina de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las placas recubiertas de fibronectina se prepararon siguiendo el protocolo del fabricante.
<ol><li>Descongelar las células endoteliales humanas y cultivarlas en placa de 6 pocillos a una confluencia de 80%-90%.</li>
	<li>El día del ensayo, solución de disociación de células calientes (ver Tabla de Materiales)y una alícuota de medio endotelial a 37oC durante 10 min antes de su uso.</li>
	<li>Aspirar el medio de cada pocal que contiene las células. Lavar las células con 1 ml de PBS estéril 1x por poca.</li>
	<li>Separe las células agregando 0,5 ml de solución de disociación precalentada por poca. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 1 mL de medio celular endotelial por poca para neutralizar la solución de disociación. Transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 ml.</li>
	<li>Células centrífugas a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 ml de medio celular endotelial. Cuente las celdas vivas usando el método de exclusión azul trypan.</li>
</ol>5. Preparación de inserciones culturales de un solo pozo
<ol><li>Descongelar 1 mg/ml de solución laminina a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Cubra un número adecuado de platos de 35 mm con una solución de poli-ornitina al 0,01% (1 ml por plato). Incubar los platos a temperatura ambiente durante al menos 1 h.</li>
	<li>Diluir 1 mg/ml de solución de laminina 1:300 en agua estéril a una concentración final de 3,3 g/ml inmediatamente antes de su uso.</li>
	<li>Aspira completamente poli-L-ornitina de cada plato. Enjuague cada plato a fondo 3 veces con agua estéril y aspire completamente para evitar la toxicidad celular inducida por poli-L-ornitina.</li>
	<li>Añadir 1 ml de solución laminina de 3,3 g/ml a cada plato e incubar a 37 oC durante la noche o al menos 1 h. Retire la solución de laminina del plato inmediatamente antes de su uso. NOTA: Alternativamente, guarde los platos que contienen laminina en 4 oC. Equilibrar los platos en una incubadora de cultivo celular de 37oC antes de su uso.</li>
	<li>Corte tres lados de un pozo de un inserto de cultivo de silicona de dos pozos(Figura 1A) utilizando una cuchilla estéril para generar un inserto de un poca(Figura 1B). NOTA: Mantenga el inserto de dos pozos firmemente unido a la superficie del embalaje original durante el corte para garantizar un corte suave y proteger la adherencia de la plaquita.</li>
	<li>Aspirar solución laminina de los platos. NOTA: No lave los platos con PBS estéril o agua después de la incubación de laminina. Las superficies húmedas evitarán una adhesión estrecha de la plaquita de cultivo.</li>
	<li>Retire la plaquita de un pocto con pinzas estériles y colóquela en el centro del plato recubierto de poli-L-ornitina/laminina. Presione a lo largo de los bordes de la plaquita para fijarlo a la superficie del plato.</li>
	<li>Gire cuidadosamente el plato al revés para verificar que la plaquita esté firmemente adherida.</li>
	<li>Mantenga el plato boca abajo y marque el límite del compartimiento de la plaquita con un marcador negro permanente con una punta ultrafina(Figura 1C).</li>
</ol>6. Ensayo de migración a larga distancia
<ol><li>Suspenda las interneuronas GABAérgicas humanas a una concentración de 3 x 104 células/70 L de medio neuronal. Semilla de 70 l de solución celular dentro de cada plaquita de cultivo de un pozo. NOTA: La densidad de sembración de las interneuronas es según la recomendación del fabricante.</li>
	<li>Suspender las células endoteliales periventriculares humanas a una concentración de 3 x 104 células/70 l de medio de células endoteliales periventriculares. Semilla de 70 l de solución celular dentro de cada plaquita de cultivo de un pozo. NOTA: El número de células endoteliales periventriculares humanas se sembraron en una proporción de 1:1 con el número de neuronas sembradas.</li>
	<li>Añadir 1 ml de medio neuronal en el plato de la neurona para llenar el área alrededor de la plaquita y evitar que el recubrimiento se seque. Del mismo modo, añadir 1 ml de medio de células endoteliales periventriculares en la placa de células endoteliales periventriculares. NOTA: Agregue el medio lentamente a lo largo del borde del plato para que la plaquita no se moleste.</li>
	<li>Compruebe bajo un microscopio que las células no se filtren del compartimiento de la plaquita.</li>
	<li>Incubar células durante 24 h a 37oC y 5%CO2. Después de 24 h de incubación, compruebe bajo microscopio que las células se han conectado correctamente y no hay fugas durante la noche.</li>
	<li>Después de 48 h de sembración, retire suavemente el inserto con una pinza estéril. Compruebe bajo el microscopio que la capa celular permanezca intacta (día 0).</li>
	<li>Retire el medio del plato de neuronas y agregue 1 ml de medio neuronal fresco. Del mismo modo, extraer el medio de la placa de células endoteliales periventriculares y agregar 1 ml de medio de célula endotelial periventricular fresca. NOTA: Reserva un número necesario de platos y fija con un 4% de PFA para imágenes de día 0.</li>
	<li>Incubar células durante 5 días a 37oC y 5%CO2. Después de 5 días, retire el medio, fije las células con 4% de PFA durante 10 min y lave 3 veces con 1x PBS.</li>
	<li>Neuronas de mancha con anticuerpo map2 anti-humano o anti-humano, y células endoteliales con anticuerpo CD31 antihumano. Al final de la inmunomancha, añadir 1 ml de medio de montaje antidescolora a cada plato.</li>
</ol>7. Ensayo de migración de cocultura
<ol><li>Co-suspende 3 x 104 interneuronas GABAérgicas y 3 x 104 células endoteliales periventriculares humanas en 70 l de medio de cocultivo (50% medio de mantenimiento periventricular sin GABA y 50% medio neuronal). Selgue esta solución celular dentro del compartimiento de la plaquita de un solo poc. Prepare un número apropiado de platos de ensayo. NOTA: GABA no se agregó en el medio de co-cultivo para excluir el efecto de GABA exógeno en la migración.</li>
	<li>Compruebe bajo un microscopio que las células no se filtren del compartimiento de la plaquita.</li>
	<li>Añadir lentamente 1 ml de medio de cocultivo a lo largo del lado del plato para evitar que el recubrimiento se seque. NOTA: Agregue el medio lentamente a lo largo del borde del plato para que la plaquita no se moleste.</li>
	<li>Como primer control, semilla 3 x 104 interneuronas GABAérgicas humanas sólo en 70 l de medio de cocultivo por un solo inserción de pozo. Prepare un número apropiado de estos platos.</li>
	<li>Como segundo control, co-semilla 3 x 104 interneuronas humanas GABAérgicas con 3 x 104 controlar las células endoteliales humanas en 70 l de medio de cocultivo por un solo inserción de un pocbe. Prepare un número adecuado de platos.</li>
	<li>Incubar los platos durante 24 h a 37oC y 5% CO2. Después de 24 h de incubación, compruebe bajo un microscopio para verificar que las células se han conectado correctamente y no hay fugas.</li>
	<li>Después de 48 h de sembración, retire suavemente el inserto con una pinza estéril. Compruebe bajo el microscopio que compruebe que la capa celular no está perturbada (día 0).</li>
	<li>Retire el medio y agregue 1 ml de medio de cocultivo fresco. NOTA: Reserva un número adecuado de platos para adquirir imágenes del día 0.</li>
	<li>Incubar células durante 5 días a 37oC y 5%CO2.</li>
	<li>Después de 5 días, retire el medio, fije las células con 4% de PFA durante 10 min y lave 3 veces con 1x PBS.</li>
	<li>Mancha con anticuerpo anti-humano-Tubulino o anti-humano MAP2 para etiquetar las neuronas. Al final de la inmunomancha, añadir 1 ml de medio de montaje antidescolora a cada plato.</li>
</ol>8. Ensayo de quimio-atracción
<ol><li>Coloque un inserto de cultivo de tres polos en el centro de un plato recubierto de poli-L-ornitina/laminina utilizando pinzas estériles.</li>
	<li>Dale la vuelta al plato. Marque el límite alrededor del compartimiento central de la plaquita utilizando un marcador negro permanente con punta ultrafina.</li>
	<li>Semilla 3 x 104 interneuronas GABAérgicas humanas en el compartimento medio en 70 l de medio neuronal(Figura 3A).</li>
	<li>Semilla 104 células endoteliales periventriculares humanas en 70 l de medio de células endoteliales periventriculares y 104 células endoteliales de control en 70 ml de medio de células endoteliales de control en los dos compartimentos exteriores respectivamente(Figura 3A).</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio de cocultivo (50% medio de mantenimiento periventricular sin GABA y 50% medio neuronal) a lo largo del lado del plato para evitar que el recubrimiento en el plato se seque.</li>
	<li>Compruebe bajo microscopio que las células no se filtren del compartimiento de la plaquita.</li>
	<li>Incubar células durante 24 h a 37oC y 5%CO2. Después de 24 h de incubación, compruebe bajo un microscopio para verificar que las células se han conectado correctamente y no hay fugas.</li>
	<li>Después de 48 h de sembración, retire suavemente el inserto con una pinza estéril. Compruebe bajo el microscopio que compruebe que la capa celular no está perturbada (día 0).</li>
	<li>Retire el medio y agregue 1 ml de medio de cocultivo fresco. NOTA: Deje a un lado el número necesario de platos para las imágenes del día 0.</li>
	<li>Incubar células durante 36 h a 37oC y 5%CO2. Después de 36 h, aspirar a medio, fijar las células con 4% PFA durante 10 min, y lavar 3x con 1x PBS.</li>
	<li>Interneuronas GABAérgicas de mancha con anticuerpo anti-humano-Tubulino o MAP2 antihumano. Al final del procedimiento de tinción, añadir 1 ml de medio de montaje antidescolora en cada plato.</li>
</ol>9. Imágenes y análisis de datos
<ol><li>Coloque el plato de ensayo inmunomanchado bajo un microscopio con un aumento 4X.</li>
	<li>Mantenga un borde largo del contorno rectangular (hecho en el paso 5.10 anterior) en el campo de visión. Tome imágenes de celdas en el espacio libre de celdas adyacente a ese límite. Adquirir imágenes a lo largo del borde largo derecho y el borde largo izquierdo del límite rectangular(Figura 2B). NOTA: Las celdas colocadas diagonalmente con respecto al rectángulo no se tienen en cuenta debido a la ambiguedad en la selección del borde corto o largo como marca inicial. Además, el número de celdas que migra a través del borde corto a menudo es significativamente menor (posiblemente debido al menor número de celdas iniciales a lo largo del borde corto) y no se consideran.</li>
	<li>Abra las imágenes en ImageJ. Calcule la distancia entre cada celda y la marca de límite(Figura 2D) utilizando ImageJ.</li>
	<li>Para evaluar la migración en términos de números de celda, establezca una distancia específica desde el límite de la imagen adquirida en ImageJ. Cuente el número de celdas que están presentes dentro de esta distancia. Calcule el número promedio, la desviación estándar y la significancia estadística utilizando el software adecuado.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Aquí, describimos tres ensayos in vitro que juntos proporcionan una evaluación cuantitativa de las propiedades específicas de las células endoteliales periventriculares humanas. Estos ensayos serán valiosos para obtener información mecanicista sobre la interacción de las células endoteliales periventriculares humanas con las interneuronas humanas. Los experimentos con ligandos, inhibidores o células con derribo o sobreexpresión específicos de genes identificarán o validarán jugadores moleculares que median la migración i...

Las células endoteliales forman el revestimiento de los vasos sanguíneos y median funciones importantes que incluyen el mantenimiento de la permeabilidad de la pared de los vasos sanguíneos, la regulación del flujo sanguíneo, la agregación plaquetaria y la formación de nuevos vasos sanguíneos. En el cerebro, las células endoteliales forman parte de una barrera hematoencefálica crítica que controla estrechamente el intercambio de materiales entre el cerebro y el torrente sanguíneo1. Nuestros estudios en la última década han identificado nuevos roles neurogénicos de las células endoteliales cerebrales que tienen implicaciones significativas para el desarrollo y el comportamiento cerebral2,3,4,5. Hemos demostrado que el cerebro embrionario del ratón está vascularizado por dos subtipos distintos de vasos, los vasos piales y los vasos periventriculares, que difieren en anatomía, origen y perfil de desarrollo2. Las células endoteliales que recubren estos dos subtipos de recipientes muestran diferencias claras en sus perfiles de expresión génica. Mientras que las células endoteliales piales en su mayoría expresan genes relacionados con la inflamación y la respuesta inmune, las células endoteliales periventriculares se enriquecen de forma única en la expresión de genes comúnmente asociados con neurogénesis, migración neuronal, quimiotaxis y orientación de axón3. Células endoteliales periventriculares también albergan una novedosa vía de señalización GABA que es distinta de la vía de señalización GABA neuronal tradicional5. Concomitante con su expresión génica, se encontraron células endoteliales periventriculares para regular la migración y distribución de las interneuronas GABAérgicas en el neocórtex en desarrollo. Durante el desarrollo embrionario, las células endoteliales periventriculares se someten a migración a larga distancia a lo largo de un gradiente ventral-dorsal para establecer la red vascular periventricular2,3. Esta ruta migratoria es reflejada un día después por las interneuronas. Las interneuronas migratorias interactúan físicamente con la red vascular periventricular preformada y la utilizan como guía para llegar a su destino final en el neocórtex. Además de actuar como un sustrato físico, las células endoteliales periventriculares sirven como la fuente de señales de navegación para las neuronas migratorias. GABA secreto celular endotelial periventricular guía la migración interneurony regula sus patrones de distribución final4. Los defectos en la migración y distribución interneurona se asocian con trastornos neuropsiquiátricos como autismo, epilepsia, esquizofrenia y depresión6,7,8,9,10. Por lo tanto, el estudio de las funciones de las células endoteliales periventriculares y su influencia en la migración interneuronal en el contexto humano se vuelve fundamental para abordar la patogénesis de estos trastornos.
Hemos generado células endoteliales periventriculares humanas a partir de células madre embrionarias humanas en nuestro laboratorio11,utilizando la tecnología inducida de células madre pluripotentes (iPSC)12,13. Para validar si las células endoteliales periventriculares humanas imitan fielmente las células endoteliales periventriculares del ratón, y para evaluar cuantitativamente su influencia en la migración interneuronica, desarrollamos tres ensayos in vitro: un ensayo de migración a larga distancia, un ensayo de migración de cocultivo y un ensayo de quimio-atracción. Aquí describimos los protocolos para estos ensayos en detalle. Los tres ensayos se basan en el uso de inserciones de cultivo de silicona para crear un pequeño parche rectangular de celdas (de dimensiones fijas) rodeados de espacio libre de celdas. La distancia de migración se evalúa midiendo la distancia entre las posiciones finales de las celdas desde el borde del parche rectangular que se ha descrito el día 0. En el ensayo de migración de larga distancia, las células endoteliales periventriculares humanas se sembran como un parche en el centro de un plato de 35 mm, y se calculan las distancias recorridas por las células durante un largo rango de tiempo. En el ensayo de migración de cocultivo, las células endoteliales periventriculares humanas se co-sembran con interneuronas humanas como un parche en un plato de 35 mm. Esta configuración permite examinar el efecto de las interacciones físicas directas de estos dos tipos de células en la tasa de migración de las interneuronas. El ensayo de quimio-atracción mide la migración de las interneuronas en respuesta a las señales quimio-atractivas secretadas por las células endoteliales periventriculares humanas. Las interneuronas se sembran como un parche rectangular, con células endoteliales periventriculares humanas y controlar las células endoteliales no periventriculares sembradas como parches de tamaño similar a ambos lados. Cada uno de los parches celulares están separados por una brecha libre de células de 500 m. La respuesta de las interneuronas se evalúa cuantificando el número de células que han migrado hacia las células endoteliales periventriculares en comparación con el control de las células endoteliales no periventriculares.
Estos ensayos proporcionan una evaluación sólida de las funciones de las células endoteliales periventriculares humanas y su influencia en la migración interneuronal. La novedosa configuración del ensayo de larga distancia y el ensayo de migración de cocultura proporciona espacio libre de células en el rango de centímetros (1-1,5 cm) para permitir la detección de la migración de larga distancia. En la Tabla 1se presenta un resumen de las características de nuestros ensayos en comparación con otros ensayos populares. Colectivamente, los ensayos descritos aquí servirán como plataforma para evaluar las células endoteliales periventriculares "enfermas" y las interneuronas generadas a partir de iPSC s de trastornos cerebrales como la esquizofrenia, el autismo o la epilepsia. Estos ensayos también se pueden utilizar para determinar cómo diferentes condiciones (por ejemplo, inhibidores, ligandos, ARN) afectan la migración celular. Por último, estos ensayos se pueden optimizar para otros tipos de células para medir la migración a larga distancia, la quimioatracción o la migración mediada por células celulares.

<table><tbody><tr><td>Solución de disociación Accutase</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCR005</td><td>Solución de disociación celular (para células endoteliales periventriculares, paso 1.4)</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-humano &beta;-Tubulina</td><td>Biolegend</td><td>802001</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-humano CD31</td><td>Millipore Sigma</td><td>CBL468</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MAP2</td><td>Neuromics</td><td>CH22103</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antiactivo Caspasa 3</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB3623</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales humanas de control</td><td>Cellular Dynamics</td><td>R1022</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de medio de control de células endoteliales</td><td>Cellular Dynamics</td><td>M1019</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEMF/12 medio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>E6 medio</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Thermofisher Scientific PHG0261</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de congelación</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Neuronas GABAérgicas</td><td>Dinámicas Celulares</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>Neuronas GABAérgicas Humanas medio</td><td>base Dinámica Celular</td><td>M1010</td><td></td></tr><tr><td>Neurona GABAérgica Humana Suplemento neuronal</td><td>Dinámica Celular</td><td>M1032</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Matriz de membrana basal</td></tr><tr><td>Medio de montaje Laboratorios</td><td>vectoriales</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-ornitina</td><td>Sigma</td><td>p4957</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Solución de disociación celular (para interneuronas GABAérgicas y células endoteliales, secciones 3 y 4)</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medio Kit completo</td><td>Lifeline Cell Technologies</td><td>LL-0003</td><td>Componente de control de medio de células endoteliales humanas Cultivo de</td></tr><tr><td>silicona de 2 pocillos-Inserto</td><td>ibidi</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>silicona de 3 pocillos Inserto de cultivo</td><td>ibidi</td><td>80369</td><td></td></tr><tr><td>Plato de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>tubo cónico de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-886</td><td></td></tr><tr><td>Solución de PFA al 4%</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> AAJ19943K2 <td></td></tr><tr><td>placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de contraste de fase invertida</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>FSX-100</td><td></td></tr></tbody></table>

migración, chemo-atracción, y co-cultura ensayos para células endoteliales derivadas de células madre humanas y neuronas gabaérgicas

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Papel de la vasculatura cerebral en el desarrollo del sistema nervioso y etiología de los trastornos cerebrales está ganando cada vez más atención. Nuestros estudios recientes han identificado una población especial de células vasculares, las células endoteliales periventriculares, que desempeñan un papel crítico en la migración y distribución de las interneuronas GABAérgicas prefálico durante el desarrollo embrionario. Esto, junto con sus funciones celulares-autónomas, alude a nuevos roles de células endoteliales periventriculares en la patología de trastornos neuropsiquiátricos como la esquizofrenia, la epilepsia y el autismo. Aquí, hemos descrito tres diferentes ensayos in vitro que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares y su interacción con las interneuronas GABAérgicas. El uso de estos ensayos, particularmente en un contexto humano, nos permitirá identificar el vínculo entre las células endoteliales periventriculares y los trastornos cerebrales. Estos ensayos son simples, de bajo costo y reproducibles, y se pueden adaptar fácilmente a cualquier tipo de célula adherente.

Los pasos para configurar una plaquita de cultivo de un solo pozo dentro de un plato de 35 mm se muestran en la Figura 1. El ensayo de migración de larga distancia y el ensayo de migración de cocultivo utilizaron un inserto de un solo pozo para sembrar el número deseado de células en el centro de un plato de 35 mm recubierto de poli-L-ornitina/laminina. En el día 0, las celdas estaban presentes como un parche rectangular(Figura 2...

Presentamos tres ensayos simples in vitro: el ensayo de migración de larga distancia, el ensayo de migración de cocultura y el ensayo de quimio-atracción, que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares derivadas de células madre humanas y sus interacción con las interneuronas GABAérgicas.

Migración, Chemo-Atracción, y Co-Cultura Ensayos para Células Endoteliales Derivadas de Células Madre Humanas y Neuronas GABAérgicas

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Este protocolo describe tres ensayos in vitro que evalúan colectivamente las funciones de las células endoteliales periventriculares humanas y su interacción con las interneurones GABAérgicos humanos. Los resultados de estos ensayos proporcionarán una visión crítica del vínculo entre las células endoteliales periventriculares y los trastornos cerebrales. Estos ensayos son simples, de bajo costo y permiten la medición de la migración celular en el rango de centímetros, lo que no se logra mediante otros ensayos existentes.Los defectos en la migración y distribución de las interneuriones GABAérgicas se asocian con trastornos psiquiátricos, como autismo, epilepsia, esquizofrenia y depresión. Por lo tanto, es fundamental estudiar la interacción de células endoteliales periventriculares con interneuriones GABAérgicos en el contexto humano para abordar la patogénesis de estos trastornos. Comience preparando células humanas para el ensayo.Permita que las células endoteliales periventriculares humanas alcancen entre el 70 y el 80% de confluencia y luego las disocian de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y las cuenten usando el método de exclusión azul trypan. Para preparar interneuriones GABAérgicos humanos, solución de disociación de células cálidas y una alícuota de medio neuronal a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, aspirar el medio de cada pozo que contiene las células y lavarlas con un milímetro de PBS por pozo.Separe las células añadiendo 0,5 mililitros de solución de disociación preadisa por pozo e incubando a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, añadir un mililitro de medio neuronal por pozo y transferir la solución celular a un tubo cónico de 15 mililitros, triturando suavemente a grumos celulares disociados. Centrifugar las células a 380 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en un mililitro de medio neuronal.A continuación, cuente las celdas vivas mediante la exclusión azul trypan. Preparar el control de las células endoteliales humanas calentando la solución de disociación celular y una alícuota de medio endotelial a 37 grados centígrados, 10 minutos antes de su uso. Aspirar el medio de cada pozo y lavarlos con un mililitro de PBS por pozo.Separe las células añadiendo 0,5 mililitros de la solución de disociación preadisa a cada pozo e incubando la placa a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, agregue un mililitro de medio celular endotelial por pozo para neutralizar la solución de disociación, y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 200 veces G durante cinco minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en un mililitro de medio celular endotelial.A continuación, utilice el método de exclusión trypan para contar las celdas. Prepare un inserto de cultivo de pozo cortando tres lados de un pozo de un inserto de cultivo de silicona de dos pozos con una cuchilla estéril. Retire el inserto con pinzas estériles y colóquelo en el centro de una placa recubierta de poli-L-ornitina y laminina, luego presione a lo largo del borde de la plaquita para fijarla a la superficie.Gire cuidadosamente el plato boca abajo para verificar que la plaquita está firmemente adheridas, y marque el límite del compartimiento de la plaquita utilizando un mercado negro permanente con una punta ultra fina. Suspenda las interneurones GABAérgicos humanos en células endoteliales periventriculares medianas neuronales y humanas y el medio celular endotelial a una concentración de 30.000 por cada 70 microlitros, luego sembrar 70 microlitros de la solución celular dentro de cada inserción de cultivo de pozo. Agregue un mililitro de medio neuronal a la antena de neurona para llenar el área alrededor de la plaquita y evitar que el recubrimiento se seque.Del mismo modo, agregue un mililitro de medio celular endotelial a la placa celular endotelial periventricular. Revise las células bajo un microscopio para verificar que no están goteando del compartimiento de la plaquita, luego incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Después de la incubación, revise las células de nuevo bajo el microscopio para verificar que se han adherido correctamente.48 horas después de la siembra, retire suavemente el inserto con pinzas estériles y compruebe las células bajo el microscopio para verificar que la capa celular permanece intacta. Retire el medio de la neurona y de los platos de células endoteliales periventriculares, y agregue un mililitro de medio fresco a cada plato. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante cinco días.Luego, retire el medio, fije las células con 4%PFA durante 10 minutos y lávelas tres veces con PBS. Para realizar el ensayo de co-cultivo, suspenda 30.000 interneuriones GABAérgicos y 30.000 células endoteliales periventriculares humanas en 70 microlitros de medio de co-cultivo, luego sembrar esta solución celular dentro de un compartimiento de inserción de un pozo. Después de 48 horas, retire el inserto.Incubar el co-cultivo a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono durante cinco días. Después de la incubación, retire el medio, fije las células con 4%PFA y lávelas tres veces con PBS. Para realizar el ensayo de atracción de quimio, coloque un inserto de cultivo de tres pozos en el centro de un plato de 35 milímetros recubierto de poli-L-ornitina y laminin, gire el plato boca abajo y marque el límite alrededor del compartimento central de la plaquita usando un marcador permanente con una punta ultra fina.Semilla 30.000 interneurones GABAérgicos en 70 microlitros de medio neuronal en el compartimento medio, luego siembra 10.000 células endoteliales periventriculares y 10.000 células endoteliales de control y 70 microlitros de sus respectivos medios en los dos compartimentos exteriores. Agregue un mililitro de co-cultivo medio a lo largo del lado de la placa para evitar que el recubrimiento en el plato se seque. Después de 48 horas, retire el inserto e incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 36 horas.Después de la incubación, retire el medio, fije las células y lávelas tres veces con PBS. Se utilizaron ensayos de migración de larga distancia y co-cultivo para investigar las interacciones entre las células endoteliales periventriculares y las neuronas GABAérgicas. En el ensayo de migración de larga distancia, las celdas comenzaron como un parche rectangular en el día cero, pero en 48 horas, habían migrado hacia el espacio libre de celdas.La tinción inmunocitoquímica con anticuerpos caspasa-3 antiactivos, un marcador de apoptosis, no mostró ninguna señal apoptótica en las neuronas de las semillas. En el ensayo de migración de co-cultivo, cuando las interneuriones fueron co-sembradas con células endoteliales periventriculares humanas, las neuronas recorrieron distancias más lejos en comparación con cuando las interneurones se siembran solas o cuando se co-sembraron con células endoteliales de control. En el ensayo quimio-atracción, un número significativamente mayor de interneurones migró hacia las células endoteliales periventriculares en comparación con el control de las células endoteliales, confirmando que las interneuriones GABAérgicas responden selectivamente a señales quimio-atractivas secretadas por células endoteliales periventriculares.Estos ensayos se pueden modificar utilizando ligandos, inhibidores o análisis de arenes para obtener información mecanicista sobre las interacciones de las células endoteliales periventriculares humanas con interneuriones humanos. También se pueden utilizar para estudiar la interacción de células endoteliales periventriculares humanas con otras células neuronales según lo informado por nuestro grupo y otros. Al intentar este procedimiento, es importante fijar la plaquita firmemente en el plato y mantenerla intacta durante todo el ensayo, de lo contrario puede conducir a fugas de celda, desprendimiento de celdas o desalineación de la plaquita con el límite dibujado.Nuestro trabajo ha indicado el papel autónomo celular de las células endoteliales periventriculares humanas en la patogénesis de trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia, la epilepsia y el autismo. Por lo tanto, estos ensayos permitirán evaluar las células endoteliales periventriculares enfermas derivadas de pacientes con estos trastornos que utilizan la tecnología IPSC.

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Migración, Chemo-Atracción, y Co-Cultura Ensayos para Células Endoteliales Derivadas de Células Madre Humanas y Neuronas GABAérgicas (Video) | JoVE Journal

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