Generación de mutantes de eliminación de genes en el marco en Pseudomonas aeruginosa y pruebas para la atenuación de la virulencia en un modelo simple de infección de ratón

Este protocolo es significativo para crear y determinar mutaciones deseadas mente-cuerpo en el genoma de Pseudomonas aeruginosa, así como para probar el efecto de mutaciones en la reducción de la virulencia en un modelo de ratón reproducible. La principal ventaja de esta técnica es la validación de cromo y la reproducibilidad del modelo de infección del ratón. Las bacterias están trabajando constantemente, cambiando continuamente.

Para ralentizar este proceso, usamos una parada congelada, las embolsamos, las cuelguemos en varios peldones en la modificación antes de probarlos en el modelo del ratón. Alguien que no esté familiarizado con estos métodos probablemente tendrá problemas con el desarrollo y la selección de posibles cruces recombinantes para probar. Además, el manejo de los ratones para la infección será difícil para alguien que no está familiarizado con el trabajo animal.

Este método se puede aplicar a la prueba de otros patógenos y sus mutantes, así como la virulencia infectar en ratones. En comparación con los modelos actuales, los procedimientos con reproducibilidad más validación de clones antes y después de la infección pueden beneficiar a otros investigadores en el campo. La demostración visual de este protocolo proporciona información sobre procedimientos extensos que pueden ser difíciles de entender o comprender solos a través de la lectura.

Comience por cultivar colonias de cruce único y recombinantes en el caldo de aislamiento de Pseudomonas o PIB. Inocular y rayar 10 microlitros de cada cultivo en placas de PIA precalejadas, complementadas con 10%sacarosa. Luego incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados.

Al día siguiente, retire las placas de la incubadora e inspeccione para detectar el crecimiento. La colonia resistente a la sacarosa debe ser recombinantes cruzados dobles. Utilice palillos de dientes estériles para parchear al menos 20 colonias en placas precalejadas de PIA, PIA complementado con 10%sacarosa, y PIA complementado con carbenicillina.

Incubar las placas durante la noche y examinarlas para el crecimiento al día siguiente. Los verdaderos recombinantes de doble cruce serán sensibles a la carircillina y a la sacarosa. Pantalla 10 a 20 colonias para su eliminación, utilizando la parte PCR de la colonia.

Recoger el crecimiento de un presunto recombinante de doble cruce con un palillo de dientes estéril y suspenderlo en 50 microlitros de PBS. Hierva la suspensión a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Centrifugar durante tres minutos a las 13.000 veces G y colóquelo sobre hielo.

A continuación, realice la PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Una vez finalizada la PCR, realice la electroforesis de gel de Agarose en los productos. Los productos de amplificación más pequeños indican colonias en las que se ha suprimido la región de interés.

En la mañana de las inyecciones, descongelar los crioviales de las células bacterianas a cuatro grados Celsius durante tres a cuatro horas. Mantenga los viales sobre hielo después de descongelarlos e inyecte los ratones en un plazo de dos horas. Transfiera el contenido de cada criovial a un nuevo tubo de dos mililitros y centrifugarlo a 4.500 veces G durante 10 minutos.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de PBS. Repita la centrifugación y vuelva a suspender las células en PBS a una concentración final de 2,5 veces 10 a la novena colonia formando unidades por mililitro. Tome tres muestras de la suspensión final de cada cepa para validar la concentración, el genotipo y el fenotipo.

Para cada cepa, aliquot 1,5 mililitros de la suspensión celular en un tubo de dos mililitros y preparar el PBS para las inyecciones de control. Reúna los ratones y los materiales necesarios para las inyecciones en una sala quirúrgica animal estéril y limpie todas las superficies con toallitas desinfectantes antes de comenzar. Use dos pares de guantes de látex para limitar el riesgo de pinchazos, si son mordidos, así como una bata de laboratorio, gafas de seguridad y máscara facial.

Retire el ratón de la jaula y pesarlo, marcando la cola con marcador permanente para el seguimiento post-inyección. Abra una nueva jeringa de un mililitro con una aguja de calibre 27 y extraiga 200 microlitros de PBS estéril. Coge el ratón detrás de las orejas, usando el pulgar y el dedo índice, y pellizca para crear un pliegue de piel en la nuca.

Luego, fija la cola en la palma usando el meññero para sostener el ratón plano e inmóvil. Inserte la aguja en un ángulo de 30 grados en la cavidad peritoneal a la izquierda o derecha de la línea media. Levante ligeramente la aguja para asegurarse de que no se insertó en los órganos.

A continuación, inyecte lentamente el PBS y retire la aguja. Un bolo en el lugar de la inyección es típico. Coloque la aguja en el contenedor de eliminación de objetos punzantes designado y mueva el ratón a una jaula separada.

Repita el procedimiento con el ratón siguiente y después de que se inyectan todos los ratones de una jaula, muévalos de nuevo a su jaula original. Después de inyectar el grupo de control, inyecte los grupos de prueba utilizando el mismo procedimiento. Una vez completadas todas las inyecciones, devuelva los ratones a la sala de estar y limpie el área de trabajo con toallitas desinfectizantes.

Para crear imágenes de los animales, prepare el sistema de imágenes ajustando los parámetros de la cámara y calentando el escenario. Establezca el flujo de oxígeno en 1,5 litros por minuto e isoflurano en 3,5% y mueva el ratón a la cámara anestésica, luego a la etapa de temperatura estabilizada, después de la anestesia. Coloque el ratón sobre su espalda con los brazos extendidos y ajuste un cono nasal para la administración de 2.5%isoflurano durante la toma de imágenes.

Cierre la puerta y tome imágenes bioluminiscentes y radiografías del ratón. Cuando se completen las imágenes, devuelva el ratón a su jaula y vigile. Debería recuperar la conciencia en tres a cinco minutos.

Las deleciones genómicas dirigidas fueron confirmadas por pcR de colonia con imprimaciones específicas que amplificaron la región de interés. Las colonias con la eliminación genómica producen una banda de PCR más corta en comparación con las colonias de tipo salvaje. La inyección intraperitoneal de la cepa atenuada de P aeruginosa, PGN cinco, dio lugar a una mortalidad del 0%, equivalente a la mortalidad observada con E.coli BL 21.

La inyección de la cepa principal, sin embargo, fue mortal para el 80% de los ratones. Se realizó un seguimiento de la progresión de la infección utilizando cepas madre y atenuadas con marca bioluminiscencia. La tensión atenuada permaneció localizada en el lugar de la inyección hasta que la bioluminiscencia se desvaneció, lo que probablemente coincidió con el aclaramiento de la infección.

El método presentado sólo examinó la mortalidad producida por la cepa. Más en profundidad se podrían utilizar aspectos inmunológicos y toxicológicos para determinar la dinámica de la infección y el efecto final de la infección que no resulta en la muerte. Lo más importante en el procedimiento es la extensa validación realizada, entre varios pasos desde la identificación inicial hasta las pruebas con animales.

La falta de ciertos pasos de validación podría conducir a un resultado incorrecto, ya que las cepas analizadas pueden someterse a mutaciones y selección, o contaminarse. Con el desarrollo de estas dos técnicas, creemos que esto permitirá a nuestros investigadores en el campo de la inmunología de infecciones investigar más eficazmente cómo la poderosa interacción del paquete conduce al fenotipo extremo, la sepsis y la mortalidad. Diferentes nutrientes'impacto en variantes se pueden comparar a través de la dosificación de tamaño de las bacterias.