Name: Enfoque Experimental para Examinar la Señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Aprende a examinar la señalización de leptina en cuerpos carótidos y su efecto en la respuesta ventilatoria hipóxica usando modelos murinos y pletismografía de cuerpo completo. Este método permite analizar el control respiratorio periférico.

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Todos los protocolos experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (MO18M211).
1. Infusión de leptina
NOTA: Con el fin de examinar el efecto de la leptina en la respiración, infundemos leptina por vía subcutánea en ratones C57BL/6J magros por una bomba osmótica para elevar los niveles de leptina circulante a los observados en ratones obesos.
<ol><li>
Preparación de la bomba osmótica
	<ol>
<li>Pesar la bomba vacía para comprobar el peso neto de la solución cargada.</li>
		<li>Añadir leptina (5 mg/ml) a la bomba osmótica (1 L/h durante 3 días). Llene la bomba con una jeringa pequeña (1 ml). Después de llenar, cierre la bomba con el tubo de llenado del calibre 27 con punta contundente. NOTA: La jeringa y el tubo conectado deben estar libres de burbujas de aire.</li>
		<li>Después de llenar, pesar la bomba de nuevo para comprobar el peso neto de la solución.</li>
		<li>
Inserte la bomba de leptina por vía subcutánea en el área interescapular. NOTA: Si desea iniciar la perfusión inmediatamente, incubar la bomba precargada en la solución salina estéril a 37 oC durante al menos 4 a 6 h (preferiblemente durante la noche).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Respuesta Respiratoria Hipoxica (HVR)
NOTA: Las condiciones termoneutrales eliminan los factores estresantes impuestos por la temperatura ambiente fría y modifican significativamente el metabolismo en ratones. Por lo tanto, todas las mediciones respiratorias deben realizarse en las condiciones termoneutrales (t a 30 oC) utilizando una incubadora neonatal12 (Figura 1A). Toda la cámara de pletimografía corporal (WBP) se ha utilizado para todas las mediciones. Todos los animales deben aclimatarse a la cámara de pletimografía barométrica y a un cuello falso para el registro posterior de oximetría de pulso durante 3-5 días antes de las mediciones de HVR. El HVR se registra entre las 10 a. m. y las 5 p. m. HVR se suprime durante el sueño, por lo tanto, se puede medir por separado durante el sueño y la vigilia silenciosa13. Para garantizar la etapa específica de sueño-vigilia del animal durante la medición de HVR, los electrodos EEG/EMG deben implantarse como un reposacabezas EEG/EMG como se describió anteriormente14. Se debe permitir que los animales se recuperen durante al menos 72 h después de la montura de la cabeza. La puesta en escena del sueño debe realizarse en épocas de 5 s. El sueño NREM es reconocido por la actividad de EEG de onda lenta que ocupa más del 50% de la época. La vigilia silenciosa se manifiesta por la actividad alfa EEG en ausencia de movimientos. El sueño REM se identifica por la actividad predominante alfa y theta EEG en presencia de tono muscular reducido en EMG. Por lo general, el sueño REM no se observa durante los desafíos del gas HVR.
<ol><li>El protocolo de grabación HVR
	<ol>
<li>Utilice la cámara PEP del siguiente tamaño: diámetro interno de 80 mm, altura de 50,5 mm y volumen de 0,4 L. La cámara WBP consta de dos cámaras, cámaras selladas y de referencia, y una plataforma circular para colocar el ratón14 (Figura 1B). La entrada y la salida dentro de la cámara están controladas por fuentes de presión positivas y negativas que mantienen la presión atmosférica. Este control crea un flujo de polarización constante en la cámara y evita la retención de CO2. Para obtener más detalles sobre la configuración de WBP, véase Hernández y sus colegas15.</li>
		<li>Mida la temperatura dentro de la cámara y la humedad relativa en la habitación antes de colocar el ratón en el WBP.</li>
		<li>Mida el peso corporal y la temperatura rectal.</li>
		<li>Coloque el collar del oxímetro alrededor del cuello del ratón (el área debe ser previamente afiada).</li>
		<li>Coloque el ratón dentro del WBP y asegúrese de que la cámara esté completamente sellada para evitar fugas de aire.</li>
		<li>Espere aproximadamente 30 minutos hasta que el ratón esté en silencio y la cámara esté a un volumen constante.</li>
		<li>Normoxia: después de 30 min, si el ratón está en silencio, comience a registrar las señales respiratorias y la saturación periférica de oxígeno (SpO2) en fase normoxia (21% FiO2 a 1 atm de presión) durante 20 min, utilizando LabChart 7 Pro (versión 7.2).</li>
		<li>Hipoxia: después de 20 min de normoxia silenciosa, empezar a registrar el primer ciclo de hipoxia aguda y SpO2. Para la fase de hipoxia, exponga a los animales a un flujo de gas mixto constante compuesto por 10% O2 y 3%CO2 durante 5 min.<ol>
<li>Durante los primeros 30 segundos de hipoxia, el gas mezclado fluye a través de la cámara a través de 2 pequeños puertos laterales en la base permitiendo que el FiO2 caiga del 21% (a 1 atm de presión) al 10%.</li>
			<li>Después de los 30 s iniciales, cierre uno de los pequeños puertos laterales de la cámara WBP y siga grabando en la hipoxia constante al 10% de FiO2 durante 5 min. NOTA: La mezcla de 10% O2 y 3% CO2 en hipoxia se utiliza para mantener el eucapnea11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Después de los 5 minutos de hipoxia, exponga el ratón al aire de la habitación de nuevo (21% FiO2 a 1 atm de presión) cambiando la fuente de entrada.</li>
		<li>Espere al menos 30 minutos hasta el próximo registro de normoxia para recuperarse de la exposición hipoxica anterior para evitar el fenómeno de roll-off ventilatorio (es decir, la supresión central de la respiración durante la hipoxia16). NOTA: Repita los ciclos de normoxia/hipoxia tres veces en cada ratón para asegurar la reproducibilidad de las mediciones. En nuestra experiencia, se deben evitar exposiciones hipoxicas adicionales (más de 3 veces en un día determinado), debido a la adaptación ventilatoria (el fenómeno de roll-off).</li>
		<li>Al final del experimento, calibrar la cámara WBP (con el ratón todavía dentro) inyectando 1 ml de aire de la habitación 3 veces con una jeringa enchufada en uno de los pequeños puertos laterales en la base de la cámara.</li>
		<li>Mida la temperatura en la cámara de nuevo con el animal dentro de ella.</li>
		<li>Abra la cámara y mida la temperatura rectal del ratón antes de colocarlo de nuevo en su jaula de inicio.</li>
	</ol></li>
	<li>Cálculo de HVR
	<ol>
<li>Digitalice todas las señales para el cálculo de HVR a 1.000 Hz (frecuencia de muestreo por canal). NOTA: El análisis del volumen de marea WBP se realiza en el gráfico de laboratorio 7 basado en la ecuación17de Drorbaugh y Fenn. Las variables requeridas comprenden la temperatura rectal del ratón y la temperatura de la cámara (antes y después de la medición de La RVR), la humedad relativa y la constante del gas de la cámara. Esta constante es el resultado de la desviación de la presión WBP después de las inyecciones de 1 ml de aire en la fase de calibración. Para obtener más información, véase Hernández y colegas15.</li>
		<li>Después de calcular la ecuación de Drorbaugh y Fenn, multiplique el canal de la cámara del volumen de marea (Vt) por la constante.</li>
		<li>
Selección de grabaciones para el análisis
		<ol>
<li>Normoxia: seleccione sólo secciones de respiración constante con volumen de marea constante. Evite secciones cercanas a los movimientos del ratón.</li>
			<li>Hipoxia: desechar los primeros 30 s cuando los niveles de O2 están disminuyendo del 21% al 10%, seleccione secciones de 30 s a 2 min de 10% O2 de exposición (un intervalo de 90 s). Dentro de este intervalo, seleccione solo secciones con respiración constante con volumen de marea constante. Evite secciones cercanas a los movimientos del ratón. El análisis es confiable si se seleccionan al menos 10 s de hipoxia en cada ciclo. NOTA: El componente periférico de chemoreflex gobernado por CB predomina durante los primeros 1-2 min de exposición16,18,19. Durante la segunda fase, entre 2 min y 5 min de exposición hipoxica, tanto el componente periférico como el componente central juegan un papel. Finalmente, la tercera fase, > 5 min, se caracteriza por la hipoventilación (el fenómeno de roll-off) gobernada predominantemente por quimiorreceptores centrales. Nuestra experiencia muestra que los ratones a menudo están despiertos durante la exposición hipoxica debido a los interruptores manuales en la fuente de flujo de aire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Después de la selección, calcule la ventilación media minuciosa (VE)en condiciones normoxicia e hipoxica utilizando la fórmula VE - volumen de marea X de la frecuencia respiratoria.</li>
		<li>Calcular la SpO2 media en condiciones de normoxia e hipoxia.</li>
		<li>Calcular el HVR manualmente utilizando la fórmula HVR (VE (10% O2) - VE (21%O2)) / (SpO2 (10% O2) – SpO2 (21% O2)). NOTA: En ratones C57BL/6J, la bomba osmótica para perfusión de leptina puede afectar a la detección precisa de la señal SpO2 por el cuello. En este caso, el HVR se calcula sobre la base de los valores de FiO2 en condiciones normoxic e hipoxicas como HVR - VE / -FiO211.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Denervación del cuerpo carótido o disección del nervio del seno carotídeo (CSND)
NOTA: Realizamos una denervación quirúrgica y química combinada con una semana de diferencia, porque la denervación quirúrgica por sí sola no abolió el chemoreflex hipóxico.
<ol><li>
Preparación quirúrgica
	<ol>
<li>Realizar todos los procedimientos en ratones macho adultos C57BL/6J. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos. Utilice guantes quirúrgicos estériles, jeringas y aplicadores con punta de algodón.</li>
		<li>Anestetizar ratones macho C57BL/6J con 1-2% de isoflurano usando un cono nasal y colocar una manta caliente para prevenir la hipotermia. El isoflurano se valora cuidadosamente para mantener la frecuencia respiratoria a 1 Hz (60 respiraciones/min). La adecuación de la anestesia antes de iniciar las cirugías se evaluará por la frecuencia respiratoria, la ausencia de movimientos y ruidos audibles, la ausencia de respuesta a estímulos táctiles y el reflejo de retirada del pedal de la extremidad delantera o posterior.</li>
		<li>Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía intraperitoneal para prevenir molestias por dolor. Retire el cabello en la región ventral del cuello y desinfecte la zona con betadina y alcohol.</li>
		<li>Para prevenir la desecación corneal, lubrique los ojos de los ratones con un gomita oftálmica estéril durante la anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimientos CSND Etapa 1: Denervación quirúrgica<ol>
<li>Después de la incisión de la línea media, exponga la bifurcación de las arterias carótidas comunes mediante la eliminación de los tejidos conectivos y el tejido adiposo.</li>
		<li>Identifique el nervio hipoglossal, que generalmente es muy prominente, y luego levántelo para exponer el nervio glossofaríngeo inmediatamente debajo. Diseccionar los nervios sinuosos carótidos bilateralmente usando tijeras de micro primavera.</li>
		<li>Cierre la incisión con sutura de seda 6-0.</li>
		<li>Administrar 1 ml de salina normal por vía subcutánea para prevenir la deshidratación.</li>
		<li>Casar a los ratones en una cámara de recuperación y monitorear su comportamiento cada 15 minutos durante 1 h inicial hasta que los ratones recuperen la conciencia para mantener la recumbencia esternal. Devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas después de que estén completamente recuperados. Siga monitoreando a los ratones dos veces al día durante los próximos 3 días. Dar buprenorfina adicional si los ratones muestran algún signo de dolor (por ejemplo, disminución del apetito, inquietud). Etapa 2: Denervación química</li>
		<li>Una semana después de la cirugía, pinte la arteria carótida con una solución de 2% de fenol diluido en etanol en los puntos de ramificación desde el nervio glossofaríngeo hasta el polo craneal del CB. Se debe proporcionar la misma atención postoperatoria después de la denervación química como se describe anteriormente en la sección de denervación quirúrgica. NOTA: Para un grupo de cirugía falsa, se realizan los mismos procedimientos, excepto la disección del nervio seno carótido.</li>
		<li>Deje que los animales se recuperen durante 5-7 días antes de las mediciones de HVR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Expresión de LepRb en el CB utilizando un vector adenoviral (Ad-LepRb) vs control (Ad-LacZ)
<ol><li>
Suspensión Ad-LepRb y Ad-LacZ
	<ol>
<li>Transfectar los ratones con adenovirus (Ad-LepRb-GFP, 2-5x1010 pfu/mL para sobreexpresión, Ad-Lacz, 1 x 1010 pfu/mL para el control) a la zona CB.</li>
		<li>Descongelar la matriz de Matrigel sumergiendo el vial en hielo en un frigorífico de 4 oC durante la noche.</li>
		<li>Suspenda suavemente el adenovirus en la matriz líquida de Matrigel a 1:5 (1 l de matriz matrigel y 4 ml de adenovirus aplicado bilateralmente).</li>
		<li>Mantenga siempre la suspensión viral sobre hielo hasta que se aplique en el CB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación quirúrgica
	<ol>
<li>Utilice los mismos instrumentos quirúrgicos que el protocolo CSND.</li>
		<li>Anestetizar lepRb-deficient db/db ratones con 2-2.5% de isoflurano usando un cono nasal y colocar los animales en una manta caliente para evitar la hipotermia. El isoflurano se valora cuidadosamente para mantener la frecuencia respiratoria a 1 Hz (60 respiraciones/min). La adecuación de la anestesia se evaluará por la frecuencia respiratoria, la ausencia de movimientos y ruidos audibles, la ausencia de respuesta a estímulos táctiles y el reflejo de retirada del pedal de la extremidad delantera o posterior.</li>
		<li>Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía intraperitoneal.</li>
		<li>Retire el cabello en la región ventral del cuello y desinfecte la zona con betadina y alcohol como en el protocolo CSND.</li>
		<li>Para prevenir la desecación corneal, lubrique los ojos de los ratones con un gomita oftálmica estéril durante la anestesia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tratamiento del adenovirus del CB
	<ol>
<li>Exponga los OC como se describe en el protocolo CSND y aplique 5 l de la suspensión viral en el área del CB bilateralmente.</li>
		<li>Espere 2-3 min hasta que la matriz líquida de Matrigel se convierta en un gel. Después de confirmar que la suspensión viral se selló, cierre la incisión con sutura de seda 6.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Después de la cirugía
	<ol>
<li>Casar a los ratones en una cámara de recuperación y monitorear su comportamiento cada 15 minutos durante 1 h inicial hasta que los ratones recuperen la conciencia para mantener la recumbencia esternal. Devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas después de que estén completamente recuperados. Siga monitoreando a los ratones dos veces al día durante los próximos 3 días. Dar buprenorfina adicional si los ratones muestran algún signo de dolor (por ejemplo, disminución del apetito, inquietud).</li>
		<li>Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía intraperitoneal según sea necesario para prevenir molestias durante el período postoperatorio.</li>
		<li>Mida la HVR 9 días después de la transfección del adenovirus.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>O'donnell, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+prevents+respiratory+depression+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin prevents respiratory depression in obesity.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159, 1477-1484 (1999).</li>
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<li>Maffei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+levels+in+human+and+rodent%3A+measurement+of+plasma+leptin+and+ob+RNA+in+obese+and+weight-reduced+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects.</a> Nature Medicine. 1, 1155-1161 (1995).</li>
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</ol>

Los autores no tienen intereses o divulgaciones contradictorias.

El enfoque principal de nuestro estudio fue examinar los efectos respiratorios de la señalización de la leptina en el CB. Se han desarrollado varios protocolos para evaluar el papel de la leptina de manera mecanicista. En primer lugar, se analizó la contribución específica de CB al HVR mediante una cuantificación cuidadosa de la HVR durante los primeros 2 minutos de exposición hipoxica. En segundo lugar, la pertinencia de la cooperación técnica en la regulación ascendente mediada por la leptina del control de la respirac...

Un adipocitos produjo leptina hormona actúa en el hipotálamo para suprimir la ingesta de alimentos y aumentar la tasa metabólica. Los estudios realizados en nuestro laboratorio1,2 y por otros investigadores3,4 mostraron que la leptina aumenta la respuesta ventilatoria hipercapnica (HVR) previniendo la hipoventilación por obesidad en la leptina obesidad deficiente. Sin embargo, la mayoría de los individuos obesenes tienen altos niveles de leptina plasmática y demuestran resistencia a los efectos metabólicos y respiratorios de la hormona5,6,7,8. La resistencia a la leptina es multifactorial, pero la permeabilidad limitada de la barrera hematoencefálica (BBB) a la leptina juega un papel importante. Proponemos que la leptina actúe por debajo de BBB en un órgano clave de sensibilidad hipóxica periférica, los cuerpos carótidos (CB), para defender la respiración en individuos obesos. Los OC expresan la larga isoforma funcional del receptor de leptina, LepRb, pero el papel de LA CB en los efectos respiratorios de la leptina no ha sido suficientemente aclarado9,10.
El objetivo de nuestro método era examinar el efecto de la señalización de la leptina en el CB en el HVR. Nuestra justificación era realizar (a) la pérdida de experimentos de función infundiendo leptina en ratones con cuerpos carótidos intactos y cuerpos carótidos denervados seguidos de mediciones de HVR; (b) ganancia de experimentos de función en ratones db/db carentes de LepRb, en el que medimos el HVR al inicio y después de la expresión de LepRb exclusivamente en CB. La ventaja de nuestras técnicas fue que realizamos todos nuestros experimentos en ratones sin restricciones sin restricciones durante el sueño y la vigilia. Investigadores anteriores realizaron sus experimentos bajo anestesia9 o no midieron los efectos de la leptina durante el sueño10. Además, nuestro estudio es el primero en utilizar un enfoque único de ganancia de función con la expresión lepRb selectiva en CB descrito anteriormente.
En el contexto amplio, nuestro enfoque puede generalizarse a otros receptores expresados en CB y su papel en la sensibilidad hipoxica. Los investigadores pueden infundir un ligando a un receptor de interés y medir el HVR al inicio y después de la denervación del CB. Como enfoque complementario, un receptor de interés se puede sobreexpresar en las mediciones de CB y HVR se puede realizar antes y después de la sobreexpresión utilizando nuestra tecnología descrita en este manuscrito.

<table><tbody><tr><td>1 mL Jeringas de Insulina</td><td>BD Biosciences</td><td>309311</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Ad-Lacz</td><td>Dr. Christopher Rhodes (Universidad de Chicago)</td><td></td><td>1 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Ad-LepRb-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>ADV-263380</td><td>2-5 x 1010 pfu/mL</td></tr><tr><td>Carro anestésico</td><td>Atlantic Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Buprenex)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57Bl/6J</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>000664</td><td>Ratones Cepa</td></tr><tr><td>Esponjas de Gasa de Algodón</td><td>Fisherbrand</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>db/db</td><td>Jackson laboratorio</td><td>000697</td><td>Ratones Etanol de Cepa</td></tr><tr><td>de Ratones</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Vetone</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Lab Chart</td><td>Data Science International (DSI)</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox Plus</td><td>STARR Life Sciences Corp.</td><td></td><td>Software:</td></tr><tr><td>Ratón Ox Plus Sensor de Collar STARR</td><td>Life Sciences Corp.</td><td>015022-2 Clip de</td><td>Collar Mediano Especial 7"</td></tr><tr><td>Cámara de pletismografía de cuerpo entero para ratón</td><td>Data Science International (DSI)</td><td>PLY3211</td><td></td></tr><tr><td>Ohio Care Plus Incubadora</td><td>Ohmeda</td><td>HCHD000173</td><td></td></tr><tr><td>tijeras operativas</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>501753-G</td><td></td></tr><tr><td>Bomba osmótica</td> recta <td>Alzet</td><td>1003D</td><td>1 &mu; L/h, 3 días</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>Proteína recombinante de leptina</td><td>de ratón R& D systems</td><td>498-OB-05M</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>Solución salina</td><td>RICCA Chemical</td><td>7210-16</td><td>Cloruro de sodio al 0,9%</td></tr><tr><td>Sutura quirúrgica estéril</td><td>DemeTech</td><td>DT-639-1</td><td>Seda, tamaño 6-0</td></tr><tr><td>Termómetro</td> Soluciones innovadoras de <td>calibración (INNOCAL)</td><td>EW 20250-91</td><td></td></tr></tbody></table>

enfoque experimental para examinar la señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración

Experimental Approach to Examine Leptin Signaling in the Carotid Bodies and its Effects on Control of Breathing

Una leptina hormonal producida por adipocitos es un potente estimulante respiratorio, que puede desempeñar un papel importante en la defensa de la función respiratoria en la obesidad. Los cuerpos carótidos (CB), un órgano clave de sensibilidad hipóxitica periférica, expresan la larga isoforma funcional del receptor de leptina (LepRb), pero el papel de la señalización de la leptina en el control de la respiración no ha sido completamente aclarado. Examinamos la respuesta ventilatoria hipoxica (HVR) (1) en ratones C57BL/6J antes y después de la perfusión de leptina al inicio y después de la denervación del CB; (2) en ratones db/db con deficiencia de LepRben línea de base y después de la sobreexpresión de LepRb en los C. En ratones C57BL/6J, el aumento de la leptina en la HVR y los efectos de la leptina en la RVR fueron abolidos por la denervación del CB. En ratones db/db, la expresión LepRb en CB aumentó el HVR. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la leptina actúa en CB para aumentar las respuestas a la hipoxia.

La perfusión continua de leptina aumentó significativamente la HVR en ratones C57BL/6J magros de 0,23 a 0,31 ml/min/g/FiO2 (P &lt; 0,001, Figura 2)11. El CSND abolió el aumento inducido por la leptina en la VRH(Figura 2),mientras que no se observaron efectos atenuantes del CSND en la VRH en el grupo de cirugía falsa después de la perfusión de leptina.
La expresión LepRb en el CB de los rat...

Nuestro estudio se centra en los efectos de la señalización de la leptina en el cuerpo carótido (CB) en la respuesta ventilatoria hipoxica (HVR). Realizamos experimentos de "pérdida de función" que miden el efecto de la leptina en la rred hVR después de experimentos de denervación y "ganancia de función" que miden la HVR después de una sobreexpresión del receptor de leptina en CB.

Enfoque Experimental para Examinar la Señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración

An adipocyte-produced hormone leptin is a potent respiratory stimulant, which may play an important role in defending respiratory function in obesity. The ...

Nuestro protocolo se puede utilizar para examinar los efectos respiratorios de la leptina en el cuerpo carótido en el control respiratorio quimiorrestos periférico, y las respuestas fisiológicas a la hipoxia. También podemos evaluar los efectos de la pérdida y ganancia de la función corporal carótida utilizando la denervación quirúrgica y química y la transfección de adenovirus respectivamente. Antes de comenzar el procedimiento, mida la temperatura dentro de una cámara de plastemagrofia de cuerpo entero hecha a medida, y mida la humedad relativa del laboratorio.A continuación, mida el peso corporal y la temperatura rectal del ratón experimental. Coloque el ratón dentro de la cámara y coloque un collar oxímetro alrededor del cuello afeitado del animal. Y asegúrese de sellar completamente la cámara para evitar fugas de aire.Espere aproximadamente 30 minutos hasta que el ratón esté en silencio y la cámara esté a un volumen constante. Antes de comenzar a registrar las señales respiratorias y la saturación periférica de oxígeno en la normoxia. Después de 20 minutos de normoxia, exponga al animal a un flujo de gas mixto constante de 10% de oxígeno y 3%dióxido de carbono.Y comienza a reg

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El propósito es presentar un nuevo método, la respiración de control de la estimulación eléctrica (BreEStim) para la gestión del dolor neuropático y espasticidad.

Respiración controlada por la estimulación eléctrica (BreEStim) para el manejo del dolor neuropático y espasticidad

La señalización vagal aferente transmite información importante al sistema nervioso central desde los receptores ubicados en los órganos del abdomen y el tórax. Los ganglios nodosos de los nervios vagos contienen muchos tipos de receptores que modulan la actividad vagal. Este protocolo describe un método de inyecciones locales de neuroquímicos en los ganglios nodosos.

Un método de nodose Ganglios Inyección en rata Sprague-Dawley

El impulso respiratorio central se encuentra en el tronco encefálico. La salida motora respiratoria espontánea de un tronco encefálico aislado se registra colocando un electrodo en la cuarta raíz ventral. Este enfoque experimental es valioso para las investigaciones farmacológicas o la evaluación de los desafíos respiratorios y las manipulaciones genéticas en el comportamiento motor rítmico.

Electrofisiología en aislados Preparativos Cord-tronco cerebral espinal de roedores recién nacidos permite la grabación de salida de red neuronal Respiratorio

Aquí, presentamos un protocolo basado en la detección inmunohistológica de proteínas c-FOS, una técnica clásica utilizada para la identificación de poblaciones neuronales involucradas en respuestas fisiológicas específicas in vivo y ex vivo.

La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; Ex Vivo</em

El método de transformación rápida de sangre se puede utilizar en los seres humanos y los rendimientos más altos niveles de péptidos, así como permite la evaluación de la forma molecular correcto. Por lo tanto, este método será una herramienta valiosa en la investigación de péptidos.

Un método rápido para el procesamiento de sangre para aumentar el rendimiento de los niveles plasmáticos de péptido en la sangre humana

La incidencia de la obesidad está aumentando y aumenta el riesgo de enfermedades pulmonares crónicas. Establecer los mecanismos subyacentes y estrategias preventivas, el animal bien definido son necesarios modelos. Presentamos tres métodos (prueba de tolerancia a la glucosa, pletismografía corporal y fijación del pulmón) para estudiar el efecto de la obesidad sobre los resultados de pulmonares en ratones.

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

La pletimografía barométrica sin restricciones se utiliza para cuantificar el patrón de respiración en ratones despiertos. Mostramos que los segmentos de 15 s bajo un protocolo estandarizado muestran valores similares a una duración prolongada de respiración silenciosa. Esta metodología también permite la cuantificación de la apnea y las respiraciones aumentadas durante la primera hora en la cámara.

Método para obtener patrón de respiración en ratones senescentes a través de la pletimografía barométrica sin restricciones

El barorreflejo es un mecanismo de regulación de la frecuencia cardíaca por el sistema nervioso autónomo en respuesta a los cambios en la presión arterial. Describimos una técnica quirúrgica para implantar transmisores de telemetría para la medición continua y simultánea del electrocardiograma y la presión arterial en ratones. Esto puede determinar la sensibilidad barorrefleja espontánea, un marcador pronóstico importante para la enfermedad cardiovascular.

Implantación de ECG telemétrico combinado y transmisores de presión arterial para determinar la sensibilidad barorrefleja espontánea en ratones conscientes

Aquí presentamos un protocolo para cultivar subtipos específicos de células hipotalámicas en cultivo. Las células pueden seleccionarse en función de marcadores de membrana oportunos/únicos y utilizarse en muchas aplicaciones, como inmunofluorescencia, ensayos electrofisiológicos y bioquímicos.

Aislamiento de neuronas hipotalámicas diana para estudios de regulación hormonal, metabólica y eléctrica

Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de...

Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el<em&gt; C. elegans</em

Aprende a examinar la señalización de leptina en cuerpos carótidos y su efecto en la respuesta ventilatoria hipóxica usando modelos murinos y pletismografía de cuerpo completo. Este método permite analizar el control respiratorio periférico.

Enfoque Experimental para Examinar la Señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración (Video) | JoVE Journal

Enfoque Experimental para Examinar la Señalización de la leptina en los cuerpos carótidos y sus efectos en el control de la respiración

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