Name: Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende a transformar raíces de tomate e inocular con Ralstonia solanacearum para análisis genético directo del marchitamiento bacteriano. Este método versátil permite estudios rápidos de patología vegetal con equipamiento mínimo.

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Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Macho por sus útiles debates, a Alvaro López-García por el asesoramiento estadístico y a Xinyu Jian por su asistencia técnica y administrativa durante este trabajo. Agradecemos a la instalación central de Biología Celular del PSC por la asistencia con la imagen por fluorescencia Este trabajo fue apoyado por el Programa Estratégico de Investigación Prioritaria de la Academia China de Ciencias (concesión XDB27040204), el Centro de Shanghai para biología del estrés vegetal (chino Academia de Ciencias) y el programa chino 1000 Talents.

NOTA: Las partes importantes de este método implican la manipulación de materiales vegetales in vitro, y por lo tanto es importante mantener las condiciones estériles durante todos estos procedimientos, incluida la visualización de la fluorescencia DsRed. Durante todo el proceso de transformación, las plántulas de tomate crecen a 25 o28 oC y 16 h/8 h de luz/oscuridad (130 mmol fotones m-2s-1 luz). Las placas están selladas con cinta adhesiva de microporos para facilitar el intercambio y la transpiración de gas.
1. Preparación de plantas de tomate y Agrobacterium rhizogenes
<ol><li>Esterilizar las semillas de tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker, LA2706, Centro de Recursos de Genética del Tomate, TGRC) con 5% (v/v) hipoclorito de sodio durante 5 min. Lavar 4-5 veces con agua estéril destilada y mantener las semillas lentamente temblando en agua estéril durante la noche para facilitar la germinación.</li>
	<li>Transfiera las semillas de tomate al medio de Murashige y Skoog (1/2 MS) sin sacarosa (2,21 g/L MS, 8% p/v agar). Mantener las semillas en la oscuridad a 25-28 oC durante tres días(Figura 1A). NOTA: Por lo general, se necesitan alrededor de 40 semillas para cada construcción.</li>
	<li>Autoclave 8,5 cm2 papeles de filtro cuadrados. Coloque los papeles de filtro cuadrados dentro de 9 cm2 platos de petri cuadrados que contengan medio MS (coloque el papel encima del agar) y coloque seis semillas de tomate germinadas en cada plato(Figura 1B). Sellar la placa con cinta adhesiva de microporoe e incubar las semillas germinadas a 25 o 28 oC durante 3 x 4 días.</li>
	<li>Cultivar Agrobacterium rhizogenes MSU440 en medio sólido de LB (con antibióticos apropiados) a 28 oC dos días antes de la transformación de la planta. NOTA: A. rhizogenes es proporcionado por el Dr. Juan Antonio López Ráez, EEZ-CSIC, Granada, España. En el experimento descrito en este artículo, se utilizó A. rhizogenes que contienen pK7GWIWG2_II-RedRoot::CESA6 o un vector vacío, como control. pK7GWIWG2_II-RedRoot contiene un gen reportero, DsRed, impulsado por el promotor de la ubiquitina Arabidopsis thaliana (pAtUBQ10), y confiere resistencia a la espectromicina (50 g/ml). Es posible utilizar otros vectores para la sobreexpresión genética, como se informó antes de5. En este trabajo, la amplificación del fragmento específico para el silenciamiento SlCESA6 se obtuvo mediante transcripción inversa (RT) PCR utilizando ARN aislado de tomate (S. lycopersicum cv. Moneymaker) y ligado en vector p-ENTR/D-TOPO (Tabla 1). Posteriormente, el fragmento SlCESA6-RNAi fue clonado en el vector binario pK7GWIWG2_II-RedRoot.</li>
</ol>2. Transformación y selección de plantas
<ol><li>Usando un bisturí estéril, corte el radio y la parte inferior del hipocotículo de las plántulas de tomate(Figura 1C,D).</li>
	<li>Cosecha A. rhizogenes biomasa de la superficie del medio LB utilizando puntas de plástico o una cuchilla de bisturí y sumerja cuidadosamente las plántulas de tomate cortadas en la biomasa bacteriana (Figura 1E).</li>
	<li>Después de la inoculación con A. rizogenes, cubra las plántulas de tomate con un papel de filtro semicircular de 2 cm x 4 cm(Figura 1F),con el fin de mantener una alta humedad y facilitar la supervivencia y el desarrollo de nuevas raíces.</li>
	<li>Almacene las plántulas de tomate transformadas durante 6-7 días. Luego, utilice un bisturí estéril para cortar las nuevas raíces peludas emergentes(Figura 1G,H; en este paso, las raíces aún no se transforman) y permitir que las plántulas produzcan nuevas raíces peludas.</li>
	<li>Una vez que aparezca la segunda generación de nuevas raíces peludas(Figura 1I),retire el papel de filtro en la parte superior de las plántulas y vuelva a sellar la placa con cinta adhesiva de microporo. NOTA: En este punto, la presencia del marcador fluorescente DsRed en el vector de transformación permite visualizar la eficiencia de transformación en las nuevas raíces.</li>
	<li>Para visualizar la fluorescencia DsRed, utilice un estereomicroscopio o cualquier otro equipo para la obtención de imágenes en vivo(Figura 1J). Marque las raíces transformadas positivas (fluorescencia roja) y elimine las raíces negativas no transformadas (sin fluorescencia roja) utilizando un bisturí estéril.</li>
	<li>Transferir las plántulas que muestren fluorescencia roja a una nueva placa que contenga un medio MS, con el fin de facilitar el desarrollo de la raíz transformada como raíz principal(Figura 1K). Conservar las plántulas que no muestran fluorescencia roja en la misma placa para comprobar la aparición de raíces fluorescentes(Figura 1L)en puntos de tiempo posteriores.</li>
	<li>Método alternativo basado en la selección de antibióticos<ol>
<li>Alternativa al paso 2.5, preparar placas cuadradas de 9 cm2 semicargadas que contengan medio DeM con el antibiótico adecuado. Incline las placas aproximadamente 5o durante el proceso de preparación para generar un espacio vacío sin medio(Figura 2A),permitiendo que los brotes crezcan evitando el contacto con el antibiótico.</li>
		<li>Alternativa al paso 2.6, después de cortar las primeras raíces peludas no transformadas emergieron (paso 2.4), transfiera las plántulas sin raíces a las placas semicargadas utilizando papeles de filtro con el tamaño adecuado(Figura 2B). NOTA: Como control positivo, se recomienda transformar varias plántulas con un plásmido que contenga la misma resistencia a los antibióticos y un gen reportero (en este protocolo, pK7GWIWG2_II-RedRoot; kanamicina 50 g/ml).</li>
		<li>Alternativamente al paso 2.7, deje que las plántulas desarrollen nuevas raíces peludas y corten aquellas raíces que no están en contacto directo con la superficie de los papeles de sándwich de filtro, ya que estas raíces pueden evitar la selección de antibióticos. NOTA: Debido al efecto antibiótico, el desarrollo de la raíz puede ser más lento que en placas sin antibióticos. Nuevas raíces peludas transformadas aparecen dentro de 14 a 18 días después de transferir las plántulas sin raíces a las placas semillenas (paso 2.8.2)(Figura 2C-E).</li>
	</ol></li>
	<li>Cubra las plántulas con un papel de filtro semicírculo de 2 cm x 4 cm, selle la placa e incubar las plántulas para dejarlas desarrollar nuevas raíces peludas. NOTA: No es necesario eliminar el A. rizogenes usando antibióticos. El papel filtrante en la parte superior del medio MS y la falta de sacarosa inhiben la propagación de la A. rizogenes en la placa5.</li>
	<li>Cinco a siete días después de la primera selección de raíz, repita el proceso de selección para seleccionar nuevas raíces transformadas y eliminar raíces no transformadas. Transfiera las plántulas que contienen raíces transformadas a una placa nueva que contenga un medio MS.</li>
</ol>3. Transferencia a macetas de inoculación
<ol><li>Preparar macetas de inoculación donde la superficie de las raíces estará expuesta al inóculo bacteriano: remojar las ollas de inoculación con agua, verter cualquier exceso de agua y colocarlas en una bandeja de plantación de plástico. Transfiera las plántulas seleccionadas con raíces transformadas a macetas de inoculación utilizando pinzas(Figura 3A).</li>
	<li>Cubra la bandeja con una envoltura de plástico o una tapa transparente y manténgala a 25 o28 oC y 65% de humedad (16 h/8 h de luz/oscuridad; 130 mmol fotones m-2s-1 luz), para mantener un alto nivel de humedad Figura 3B). Retire la cubierta después de cinco o seis días. NOTA: Las plantas de tomate transformadas están listas para la inoculación de dos a tres semanas después de transferirlas al suelo(Figura 3C). Durante el crecimiento en el suelo, las plantas de tomate pueden producir nuevas raíces que no se transforman. Para determinar el alcance de este fenómeno, la fluorescencia roja se visualizó en las raíces de las plantas de tomate transformadas de 3 semanas de edad. La mayoría de las raíces (80%-100%) mostraron fluorescencia roja, lo que indica que efectivamente se transforman(Figura 3D,E).</li>
</ol>4. Inoculación de desgranación del suelo
<ol><li>Crecer R. solancearum (strain GMI1000 en este protocolo) en medio líquido phi(Tabla 211) en un agitador orbital (200 rpm) a 28oC hasta la fase estacionaria.</li>
	<li>Determinar los números bacterianos midiendo la densidad óptica del cultivo bacteriano a 600 nm (OD600). Diluir el cultivo bacteriano con agua a una Do6600 de 0,1 (en las condiciones utilizadas aquí, esto corresponde a aproximadamente 108 unidades formadoras de colonias [CFU]/mL).</li>
	<li>Colocar macetas de inoculación de 16 a 20 que contengan plantas de tomate transformadas en una bandeja de inoculación (29 cm x 20 cm; Figura 4A).</li>
	<li>Vierta 300 ml (15 ml por planta) de inóculo bacteriano (OD600 de 0,1) en la bandeja que contiene las ollas de inoculación. Dejar los empaparse en el inóculo durante 20 min(Figura 4B).</li>
	<li>Prepare una nueva bandeja con una capa de tierra para macetas. Mover las macetas inoculadas en la nueva bandeja(Figura 4C)y colocar las bandejas en una cámara de crecimiento con 75% de humedad, 26 x 28 oC, y un fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad (130 mómicos de luz m-2s-1).</li>
</ol>5. Determinación de parámetros de infección y análisis estadístico
<ol><li>Puntuar los síntomas de la enfermedad como se describió anteriormente12,13, utilizando una escala que va desde 0 (sin síntomas) a 4(marchitamientocompleto) ( Figura 4D-H), cada día después de la inoculación de Ralstonia durante dos semanas. NOTA: Los datos del índice de enfermedad se recopilan de la misma unidad experimental (cada planta) a lo largo del tiempo.</li>
</ol>6. Análisis de la expresión génica
NOTA: La expresión del transgén o el silenciamiento del gen objetivo puede determinarse mediante RT-PCR o por RT-PCR cuantitativo (qRT-PCR).
<ol><li>Recoger muestras y extraer ARN de una parte representativa del sistema radicular transformado (para evaluar el efecto sobre el gen objetivo) y hojas (como control interno).</li>
	<li>Sintetice el ADNc utilizando 1 g de ARN total tratado con DNase.</li>
	<li>Analizar la expresión génica de los genes diana por qRT-PCR. Calcule los niveles de transcripción relativos utilizando el método 2--CT 14, utilizando SlIF-1 como gen de limpieza15. NOTA: Las secuencias de imprimación se enumeran en la Tabla 1.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Wilt+in+China%3A+History%2C+Current+Status%2C+and+Future+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives.</a> Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+plant+pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Elphinstone, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElphinstone%2C+JG+%22The+current+bacterial+wilt+situation%3A+a+global+overview.+In%3A+Bacterial+Wilt+Disease+and+the+Ralstonia+solanacearum+Species+Complex%22">The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex</a>. Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. , American Phytopathological Society Press. St Paul, MN. 9-28 (2005).</li>
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<li>Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+tomato+suitable+for+the+study+of+arbuscular+mycorrhizal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis.</a> Plant Methods. 14, 34(2018).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+of+homogalacturonan%2C+rhamnogalacturonan+I+and+arabiogalactan+protein+in+xylem+cell+walls+of+tomato+gentoypes+in+reaction+to+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).</li>
<li>Wydra, K., Beri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+changes+in+methyl-ester+distribution+of+homogalacturonan+and+side+chain+composition+of+rhamnogalacturonan+I+as+possible+components+of+basal+resistance+in+tomato+inoculated+with+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).</li>
<li>Hernández-Blanco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+cellulose+synthases+required+for+Arabidopsis+secondary+cell+wall+formation+enhances+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance.</a> Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).</li>
<li>Denancé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+wat1+%28walls+are+thin1%29-mediated+resistance+to+the+bacterial+vascular+pathogen%2C+Ralstonia+solanacearum%2C+is+accompanied+by+cross-regulation+of+salicylic+acid+and+tryptophan+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism.</a> Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).</li>
<li>Digonnet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+route+of+Ralstonia+solanacearum+colonization+in+Arabidopsis+thaliana+roots+during+a+compatible+interaction%3A+focus+at+the+plant+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall.</a> Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).</li>
<li>Sang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ralstonia+solanacearum+type+III+effector+RipAY+targets+plant+redox+regulators+to+suppress+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).</li>
<li>Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+the+GALA+type+III+effector+family+contributes+to+Ralstonia+solanacearum+adaptation+on+different+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts.</a> New Phytologist. 192, 976-987 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assignment+to+positively+selected+sites+in+the+core+type+III+effector+RipG7+from+Ralstonia+solanacearum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum.</a> Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2-%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+activation+of+the+9-oxylipin+pathway+during+arbuscular+mycorrhiza+formation+in+tomato+and+its+regulation+by+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).</li>
<li>Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retire+statistical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retire statistical significance.</a> Nature. 567, 305-307 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Ralstonia solanacearum representa una amenaza importante para la agricultura; sin embargo, su interacción con los huéspedes naturales de importancia agrícola todavía se entiende mal en comparación con otros patógenos bacterianos, especialmente en especies de plantas de cultivo. En la mayoría de los casos, el análisis genético se ve obstaculizado por el tiempo y los gastos necesarios para modificar genéticamente las plantas anfitrionas. Para abordar este problema y facilitar el análisis genético de la infección p...

Ralstonia solanacearum, agente causal de la enfermedad bacteriana de wilt, es un patógeno vascular devastador transmitido por el suelo con una distribución mundial que puede infectar una amplia gama de especies vegetales, incluyendo papa, tomate, tabaco, plátano, pimienta y berenjena, entre otros1,2. Las pérdidas de rendimiento causadas por Ralstonia pueden alcanzar el 80-90% de la producción en tomate, patata o plátano, dependiendo del cultivar, clima, suelo y otros factores3. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae o Xanthomonas spp. Además, la mayoría de los estudios en interacciones entre plantas y microbios se centran en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Aunque la investigación utilizando estos modelos ha contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las interacciones entre plantas y bacterias, no abordan la necesidad actual de entender estas interacciones en las plantas de cultivo. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción. Particularmente, el tomate, un huésped natural de Ralstonia,es el segundo cultivo vegetal más importante a nivel mundial y se ve afectado por una plétora de enfermedades4,incluida la enfermedad bacteriana de wilt. En este trabajo, hemos desarrollado un método fácil para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia del tomate. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, utilizando la fluorescencia DsRed como marcador de selección5,seguido de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI.
Una limitación potencial de este método consiste en el crecimiento residual de raíces no transformadas. Esto es particularmente importante en los casos en que el plásmido utilizado carece de un gen reportero que permita la selección de raíces transformadas. Para resolver este problema, hemos desarrollado un método alternativo basado en la selección de antibióticos, que inhibe el crecimiento de raíces no transformadas al tiempo que permite el crecimiento de raíces transformadas sanas resistentes a los antibióticos. Dado que A. rhizogenes no induce la transformación de los brotes, son susceptibles al antibiótico y, por lo tanto, deben mantenerse separados del medio que contiene antibióticos.
Aunque la resistencia de las plantas contra Ralstonia no se entiende bien, varios informes han asociado alteraciones de la pared celular a una mayor resistencia a la marchitabacteriana6,,7,8,9. Se ha sugerido que estas alteraciones de la pared celular afectan el desarrollo vascular, un aspecto esencial para el estilo de vida de Ralstonia dentro de la planta10. Se ha demostrado que las mutaciones en genes que codifican las sinteas de celulosa CESA4, CESA7 y CESA8 en Arabidopsis thaliana afectan la integridad de la pared celular secundaria, causando una mayor resistencia a Ralstonia,que parece estar vinculada a la señalización ABA8. Por lo tanto, como prueba de concepto para nuestro método, realizamos silenciamiento de genes mediado por ARNi de SlCESA6 (Solyc02g072240), una celulosa de pared celular secundaria sintasa, y ortolog de AtCESA8 (At4g18780). La posterior inoculación de drenado del suelo con Ralstonia mostró que silenciar SlCESA6 mejoró la resistencia a los síntomas de marchitamiento bacteriano, lo que sugiere que la resistencia mediada por la pared celular a Ralstonia probablemente se conserva en el tomate, y validando nuestro método para llevar a cabo análisis genéticos de la resistencia bacteriana a la marchitamiento en las raíces del tomate. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.

<table><tbody><tr>Placas <td></td><td></td><td></td><td>de Petri cuadradas de 90 mm</td></tr><tr><td>Polvo de agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD (Becton y Dickinson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácidos Casamino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Sistema de imagen de plantas in vivo NightShade LB 985</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jiffy</td><td>pots Jiffy Products International A.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta de microporos</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige y medio Skoog (M519)</td><td>Phytotechlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sustrato Pindstrup</td><td>Pindstrup Mosebrug A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturí y cuchilla</td> Hipoclorito de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco de limpieza</td><td></td><td></td><td></td> estéril</tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de papel Wahtman Wahtman</td><td>International Ltd. Maldstone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>OXOID</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transformación de raíz de tomate seguida de inoculación con ralstonia solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de wilt

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum es un patógeno vascular devastador que puede infectar a una amplia gama de especies vegetales, causando una amenaza importante para la agricultura. Sin embargo, el modelo Ralstonia está considerablemente infraexplorado en comparación con otros modelos que involucran patógenos vegetales bacterianos, como Pseudomonas syringae en Arabidopsis. La investigación dirigida a comprender la interacción entre Ralstonia y las plantas de cultivo es esencial para desarrollar soluciones sostenibles para luchar contra la enfermedad bacteriana de la inejique, pero actualmente se ve obstaculizada por la falta de ensayos experimentales sencillos para caracterizar los diferentes componentes de la interacción en las plantas anfitrionas nativas. En este escenario, hemos desarrollado un método para realizar análisis genéticos de la infección por Ralstonia de tomate, un huésped natural de Ralstonia. Este método se basa en la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenesde las raíces de tomate, seguida de la inoculación de Ralstonia soil-drenching de las plantas resultantes, que contiene raíces transformadas que expresan la construcción de interés. La versatilidad del ensayo de transformación de raíz permite realizar una sobreexpresión genética o un silenciamiento de genes mediado por el ARNI. Como prueba de concepto, utilizamos este método para demostrar que el silenciamiento mediado por ARNi de SlCESA6 en raíces de tomate confirió resistencia a Ralstonia. Aquí, describimos este método en detalle, permitiendo enfoques genéticos para entender la enfermedad de marchitamiento bacteriano en un tiempo relativamente corto y con pequeños requisitos de equipo y espacio de crecimiento de la planta.

La Figura 5 muestra el desarrollo de síntomas de enfermedad de plantas de tomate con raíces transformadas con un vector vacío (EV), y plantas con raíces transformadas con una construcción de ARNi dirigida a SlCESA6 (Solyc02g072240). Los datos del índice de la enfermedad(Figura 5A)se recopilan de la misma unidad experimental (cada planta) a lo largo del tiempo de acuerdo con una escala arbitraria...

Aquí, presentamos un método versátil para la transformación de la raíz de tomate seguido de la inoculación con Ralstonia solanacearum para realizar un análisis genético sencillo para el estudio de la enfermedad bacteriana de la enfermedad de wilt.

Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Este protocolo es significativo porque permite a los científicos realizar análisis genéticos sencillos de la enfermedad bacteriana de marchitamiento en el tomate. La principal ventaja de esta técnica es que la manipulación de la expresión génica y los ensayos posteriores se pueden realizar en poco tiempo y con los pequeños requisitos de equipos y espacio de crecimiento de la planta. Este método es muy versátil, y se puede aplicar a otras plantas de cultivo para realizar tanto la inoculación de patógenos y otros ensayos fisiológicos.Para mantener la esterilidad durante la manipulación de plántulas in vitro, es importante mantener las placas cerradas cuando están fuera de la campana de flujo. Esta es una técnica fácil, pero requiere varios pasos para la manipulación. La visualización de este método ayudará a ver pequeños trucos que son difíciles de explicar en el manuscrito, ayudando a otros investigadores a implementar el método en sus laboratorios.Ayudar a demostrar este procedimiento será Achen Zhao, un estudiante graduado. Después de esterilizar y lavar las semillas de tomate, transfiéralas a media fuerza Murashige y Skoog medio sin sacarosa. Mantenga las semillas en la oscuridad a una temperatura entre 25 y 28 grados Celsius durante tres días.Coloque filtros autoclavedos de 8,5 centímetros cuadrados dentro de platos Petri de nueve centímetros cuadrados que contengan Murashige de media fuerza y medio Skoog, y coloque seis semillas de tomate germinadas en cada plato. Selle la placa con cinta de micropore e incubar las semillas germinadas a 25 a 28 grados centígrados durante tres o cuatro días. Cultivar el Agrobacterium rhizogenes MSU440 en medio LB sólido con antibióticos adecuados durante dos días a 28 grados Celsius antes de la transformación de la planta.Usando un bisturí estéril, corta el radio y la parte inferior del hipocotilo de las plántulas de tomate. Utilice puntas de plástico o una cuchilla de bisturí para cosechar biomasa A.rhizogenes de la superficie del medio LB, y sumerja cuidadosamente las plántulas de tomate cortadas en la biomasa bacteriana. Después de esto, cubra las plántulas de tomate con un papel de filtro semicircular de dos centímetros por cuatro centímetros con el fin de mantener una alta humedad y facilitar la supervivencia y el desarrollo de nuevas raíces.Es importante mantener las plántulas en alta humedad en un ambiente que permita la transpiración. Para ello, cubra las plántulas con papel de filtro y cierre la placa con cinta Micropore. Almacene las plántulas de tomate transformadas durante seis a siete días en una cámara de crecimiento a una temperatura de entre 25 y 28 grados centígrados.Luego usa un bisturí estéril para cortar las nuevas raíces peludas emergentes, y deja que las plántulas produzcan nuevas raíces peludas. Una vez que aparezca la segunda generación de nuevas raíces peludas, retire el papel de filtro en la parte superior de las plántulas y selle la placa con cinta de microprés de nuevo. Para visualizar la fluorescencia DsRed o cualquier otro equipo para la toma de imágenes in vivo de la planta, marque las raíces transformadas positivas, que pueden ser identificadas por la fluorescencia roja.Usa un bisturí para eliminar las raíces negativas no transformadas, que pueden ser identificadas por su falta de fluorescencia roja. Transfiera las plántulas que muestran fluorescencia roja a una nueva placa que contenga medio Murashige y Skoog de media resistencia para facilitar el desarrollo de la raíz transformada como raíz principal. Mantenga las plántulas que no muestran fluorescencia roja en la misma placa para comprobar la aparición de raíces fluorescentes en puntos de tiempo posteriores.Cubra las plántulas con un papel de filtro semicírculo de dos centímetros por cuatro centímetros, selle la placa e incubar las plántulas para que desarrollen nuevas raíces peludas. Preparar las ollas de inoculación donde la superficie de las raíces se expondrá al inóculo bacteriano remojando primero las ollas de inoculación con agua, vertiendo cualquier exceso de agua, y luego colocándolas en una bandeja de siembra de plástico. Con pinzas, transfiera las plántulas seleccionadas con raíces transformadas a las macetas de inoculación.Cubra la bandeja con una envoltura de plástico o una tapa transparente, y manténgala a 25 a 28 grados centígrados con 65% de humedad. Retire la cubierta después de cinco o seis días. Cultivar Ralstonia en cinco LB medio líquido en un agitador orbital a 28 grados Celsius, con temblor a 200 rpm, hasta la fase estacionaria.Mida la densidad óptica a 600 nanómetros para determinar los números bacterianos. Diluir el cultivo bacteriano con agua a un OD600 de 1. Coloque de 16 a 20 ollas de inoculación que contengan plantas de tomate transformadas en una bandeja de inoculación.A continuación, vierta 300 mililitros de inóculo bacteriano diluido en la bandeja, y deje que las plantas se empapen en el inóculo durante 20 minutos. Después de esto, preparar una nueva bandeja con una capa de tierra para macetas. Mueva las ollas inoculadas a la nueva bandeja y coloque las bandejas en una cámara de crecimiento con 75% de humedad, una temperatura entre 26 y 28 grados centígrados, y un fotoperiodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.Aquí, las raíces de tomate se transforman e inoculan con Ralstonia para realizar análisis genéticos sencillos para el estudio de la enfermedad bacteriana. El desarrollo de los síntomas de la enfermedad se rastrea en plantas de tomate con raíces transformadas con un vector vacío y las transformadas con una construcción RAI dirigida al tomate CESA6. Los datos del índice de enfermedades se recopilan de la misma unidad experimental a lo largo del tiempo de acuerdo con una escala arbitraria de cero a cuatro y no siguen una distribución gaussiana, descartando el uso de pruebas estándar para datos paramétricos.Como enfoque estándar, se utiliza una prueba U Mann-Whitney, de dos colas y no paramétrica para comparar las curvas de control e infección. Según este análisis, la diferencia entre las medianas de ambas curvas parece no ser significativa. También es posible cuantificar el área bajo la curva de progreso de la enfermedad, lo que permite combinar múltiples observaciones del progreso de la enfermedad en un solo valor.El área bajo la curva de progreso de la enfermedad muestra un mayor valor para las plantas de control en comparación con las plantas de tomate CESA6 RNAi al final del proceso de infección, lo que indica que las plantas silenciadas por CESA6 de tomate son más resistentes a la infección por Ralstonia que las plantas de control. Los intervalos de confianza ofrecen una forma de estimar, con alta probabilidad, un rango de valores en el que se encuentra el valor poblacional de una variable determinada. Como se ve aquí, el área del intervalo de confianza del 95% para las curvas de control e infección estima una mayor probabilidad de resistencia cuando se silencia CESA6.Los valores del índice de enfermedad se pueden transformar en datos binarios, teniendo en cuenta un índice de enfermedad inferior a dos correspondiente a cero y un índice de enfermedad igual o superior a dos correspondiente a uno. Esto permite la representación de una curva de supervivencia después de la inoculación de Ralstonia. Las diferencias en la tasa de supervivencia entre el control y las plantas infectadas no son estadísticamente significativas según la prueba estadística Gehan-Breslow-Wilcoxon.La expresión de CESA6 se analiza en dos raíces transformadas seleccionadas aleatoriamente antes del paso de inoculación, mostrando que la resistencia mejorada a Ralstonia se correlaciona con la expresión reducida de CESA6. Después de dos rondas de selección, se puede obtener una tasa de transformación de 35 a 40%, y este valor se puede aumentar realizando rondas de selección adicionales. Al realizar este procedimiento, es importante mantener las plántulas cubiertas con un pedazo de papel de filtro para mantener una alta humedad y sellar las placas con Micropore para garantizar el intercambio de gas.Después de la transformación de la raíz, muchos de los tratamientos se pueden aplicar para estudiar la respuesta vegetal mediante la observación de la fisiología de la raíz o utilizando biología molecular, biología celular, o bioquímica. Principalmente, esta técnica permitirá a los investigadores con recursos limitados realizar análisis genéticos de la infección bacteriana en las raíces de tomate.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Fuente: Hassan, J. A., et al. Identificación de alto rendimiento de resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas. J. Vis. Exp. (2020).Este video demuestra un método para detectar resistencia bacteriana en diferentes cepas de tomate utilizando plántulas de diez días inoculadas con una suspensión bacteriana. Explica cómo las bacterias invaden a través de los estomas, entregan proteínas efectoras para suprimir la inmunidad de las plantas y...

Ensayo de inundación de plántulas para detectar la resistencia bacteriana en tomates

Fuente: Matthysse, A. G. Adherencia de bacterias a superficies vegetales medida en laboratorio. J. Vis. Exp., (2018)Este vídeo demuestra un protocolo para medir la colonización radicular de plántulas de tomate por bacterias patógenas silvestres y deficientes en celulosa. Los recuentos viables de bacterias que se adhieren estrechamente muestran una mayor adhesión y formación de microcolonias por parte de la cepa silvestre, lo que pone de manifiesto el papel de la celulosa en la colonización...

Evaluación de la colonización radicular de plántulas de tomate por una bacteria patógena utilizando recuentos celulares viables

Usando el montaje de ADN, múltiples vectores de CRISPR pueden ser construidos en paralelo en una única reacción de clonación, por lo que la construcción de un gran número de vectores de CRISPR una tarea simple. Tomate raíces peludas son un excelente sistema modelo para validar vectores de CRISPR y generar materiales mutantes.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

El objetivo del protocolo presentado aquí es estudiar la respuesta de transcriptómicos de endosphere aislado de Bacillus mycoides a exudados de raíces de papa. Este método facilita la identificación de genes bacterianos importantes implicados en interacciones planta-microorganismo y es en principio aplicable a las plantas, con ajustes menores y otros endófitos.

Interacción planta-microorganismo: Respuesta transcripcional de Bacillus Mycoides a exudados de raíces de papa

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

El ensayo de inundación de plántulas facilita el cribado rápido de las adhesiones de tomate silvestre para la resistencia a la bacteria pseudomonas de las siestas. Este ensayo, utilizado junto con el ensayo de crecimiento bacteriano de plántulas, puede ayudar a caracterizar aún más la resistencia subyacente a la bacteria, y se puede utilizar para examinar las poblaciones de mapeo para determinar la base genética de la resistencia.

Identificación de alto rendimiento de la resistencia a Pseudomonas syringae pv. Tomate en tomate usando el ensayo de inundación de plántulas

Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.

Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

El protocolo describe la infección de las raíces de Solanum tuberosum con nematodos parásitos de plantas en condiciones de invernadero in vivo y las raíces transgénicas de papa in vitro para el análisis histoquímico de la estructura de la raíz mediante microscopía óptica.

Infección in vivo e in vitro de raíces de papa con nematodos parásitos de plantas para la evaluación de cambios estructurales inducidos

Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Aprende a transformar raíces de tomate e inocular con Ralstonia solanacearum para análisis genético directo del marchitamiento bacteriano. Este método versátil permite estudios rápidos de patología vegetal con equipamiento mínimo.

Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt (Video) | JoVE Journal

Transformación de raíz de tomate Seguida de inoculación con Ralstonia Solanacearum para el análisis genético directo de la enfermedad bacteriana de Wilt

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