Sistema de matriz 3D derivado de fibroblastos aplicable al ensayo de formación de tubos endoteliales
26 de diciembre de 2019
El objetivo de este método es obtener matrices 3D derivadas de fibroblastos como un andamio natural para ensayos celulares posteriores. Los fibroblastos se sembran en una placa de cultivo pretratada y se estimulan con ácido ascórbico para la generación de matrices. Las matrices se descelularizan y se bloquean para cultivar células relevantes (por ejemplo, células endoteliales).
Este protocolo permite ver diferentes tipos de cultivos y observar sus interacciones con la matriz extracelular. La principal ventaja de este método es que la matriz que se obtiene se regenera mediante fibroblastos y será bastante similar a las generadas in vivo. Creemos que esta enfermedad viene irrelevante cuando se utiliza fibroblasto obtener de hornear platos.
Establecer una matriz a partir de estas células podría iluminarnos cómo puede afectar, por ejemplo, la situación persistente. Estos métodos también se pueden aplicar, por ejemplo, a estudios físicos a sobrevivientes de propiedades matririadas. Visualización de este protocolo es importante observar una técnica de pipeteo de los pasos que tienes que regentar.
Al probar estos métodos por primera vez probablemente tomará más tiempo del esperado. Nuestro consejo es prepararnos tanto como puedas con antelación y usar períodos de duración para prepararte para los próximos pasos. Comience preparando 0.2%gelatina, 1%glutaraldehído y un molar etanolamina soluciones de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Asegúrese de ejecutar cada solución a través de un filtro de 0,22 micrómetros antes de su uso. A continuación, prepare el ácido ascórbico y el tampón de la lesis. Diluir el estreptococo de pluma PBS como se describe en el manuscrito y preparar DMEM con 10%FBS.
Preparar 2%BSA desnaturalizador de calor añadiendo 2 gramos de BSA a 100 mililitros de agua estéril y calentándolo en un baño de agua hirviendo durante siete minutos. Entonces, suplemento FBS con penicilina, estreptomicina, gentamicina, y anfotericina B.Cultura telómeros recombinantes trans infectados fibroblastos humanos inmortalizados foreskin y DMEM con 10%FBS y los mantuvo a 37 grados Celsius y 5%dióxido de carbono. Para establecer el cultivo primario de fibroblastos, corte las muestras de tejido en pequeños trozos de aproximadamente dos a tres mililitros en cubos y sembrarlas en FPS con una alta concentración de antibióticos.
Cuando aparezcan los primeros fibroblastos, sustituya el medio por el medio FBM para el mantenimiento celular. Añadir dos mililitros de 0,2% de solución de gelatina a cada pozo de una placa de seis pozos y incubarlo durante una hora durante 37 grados centígrados o durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, aspirar la gelatina y lavar cada pocólieto con dos mililitros de PBS.
Añadir dos mililitros del 1% de glutaraldehído a cada pozo e incubar la placa a temperatura ambiente durante treinta minutos que cruzará la gelatina. Aspirar el glutaraldehído y lavar los pozos en dos mililitros de PBS durante cinco minutos. Para bloquear el glutaraldehído restante, añadir dos mililitros de un molar etanolamina e incubar la placa a temperatura ambiente durante treinta minutos.
Aspirar la etanolamina y repetir los lavados con PBS. Agregue un mililitro de DMEM con 10%FPS. Si el medio se vuelve inmediatamente rosado, retírelo, lave los pozos una vez con dos mililitros de PBS y agregue otro mililitro de DMEM.
Semilla de un mililitro de suspensión de fibroblastos con 5 x 10 a las quintas células en cada pozo y cultivo de las células hasta que se alcanza el 100% de confluencia. A continuación, retire el medio y reemplácelo por DMEM con 10%FBS y 50 microgramos por mililitro de ácido ascórbico. Reemplace el medio cada dos días durante seis días.
Dos días después del último tratamiento con ácido ascórbico, retira el medio y lava los pozos con dos mililitros de PBS. Después de los lavados, agregue lentamente un mililitro de tampón de lisis precalentada e incubar la placa a temperatura ambiente durante cinco a diez minutos hasta que los fibroblastos estén elliste. Sin quitar el tampón de lelisis, agregue cuidadosamente dos mililitros de PBS a cada pozo y luego aspire aproximadamente 2,5 mililitros.
Repita este proceso dos veces para un total de tres lavados. Después del lavado final, agregue dos mililitros de PBS con pen-strep. Selle la placa con película y manténgala a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres meses.
Cultivar células HUVEC y EMB-2 con 2%FBS hasta la máxima confluencia. A continuación, reemplace el medio por EBM-2 sin FBS durante ocho horas. Para preparar las matrices para la siembra celular, retírelas del refrigerador y déjelas a temperatura ambiente durante una hora.
Bloquear las matrices añadiendo dos mililitros de 2%BSA desnaturalizadora por calor y incubarlas a 37 grados centígrados durante una hora. Luego, aspirar la BSA y lavarlas con dos mililitros de PBS. Semilla 2 x 10 a las quintas células HUVEC a cada pozo de la placa recubierta con matrices derivadas de fibroblastos.
Incubar las células a 37 grados Celsius durante 16 horas y luego examinar las estructuras similares a tubos bajo un microscopio de campo brillante estándar con un aumento de 20-40x. Este protocolo se utilizó para examinar los efectos del tratamiento con PDGF en la formación de matrices derivadas de fibroblastos. Los tercer fibroblastos BGH que fueron incubados con PDGF mostraron una distribución celular más alineada en matrices que las incubadas sin PDGF.
La expresión de la proteína de colágeno 1 y fibronectina se incrementó en matrices derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF y, en consecuencia, se aumentó el grosor de la matriz. Además, los histogramas de direccionalidad demuestran que el colágeno 1 y la fibronectina muestran patrones paralelos. Cuando las células HUVEC se siembran en matrices descelularizadas derivadas de fibroblastos estimulados por PDGF, desarrollaron estructuras más capilares que en ninguna condición estimulada.
Confirmar que las matrices derivadas de los fibroblastos estimulados por PDGF-BB promueven la activación de las células endoteliales. Al realizar este procedimiento, es importante preparar las soluciones con antelación y asegurarse de que las celdas estén listas antes de comenzar. Además de los estudios de células endoteliales, las matrices también se pueden sembrar con células epiteliales y se puede observar la reacción a factores externos como la condición en los medios o los fármacos citotóxicos.
La generación de matriz extracelular es crucial en el diseño de experimentos de macroambiente tumoral.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Resumen
Este protocolo permite la observación de diversos cultivos celulares y sus interacciones con matrices extracelulares. Las matrices derivadas de fibroblastos se asemejan estrechamente a las encontradas in vivo, proporcionando un andamio relevante para ensayos celulares.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Cultivo celular
- Investigación de la matriz extracelular
- Biología de los fibroblastos
Antecedentes
- Los fibroblastos son células clave en la generación de matrices extracelulares.
- Comprender las interacciones entre células y matrices es fundamental para diversos estudios biológicos.
- Las matrices regeneradas pueden proporcionar información sobre condiciones fisiológicas y patológicas.
- Este método permite la visualización de las técnicas de pipeteo esenciales para el protocolo.
Objetivo del estudio
- Crear un andamio natural para ensayos celulares utilizando matrices derivadas de fibroblastos.
- Investigar los efectos de estas matrices sobre diferentes tipos celulares.
- Mejorar la comprensión de condiciones persistentes mediante estudios de matrices.
Métodos Utilizados
- Los fibroblastos se siembran en placas de cultivo previamente tratadas.
- Se utiliza ácido ascórbico para estimular la generación de matriz.
- Se realiza la descelularización de las matrices para prepararlas para el cultivo celular.
- Se cultivan células relevantes, como células endoteliales, sobre las matrices.
Resultados Principales
- Las matrices generadas son similares a las encontradas in vivo.
- Las interacciones celulares con las matrices pueden observarse de manera efectiva.
- El método proporciona un enfoque confiable para estudiar el comportamiento celular en un entorno relevante.
- Las técnicas de visualización mejoran la comprensión de la ejecución del protocolo.
Conclusiones
- Las matrices derivadas de fibroblastos sirven como andamios eficaces para ensayos celulares.
- Este método puede aplicarse a diversos estudios biológicos, incluidos estudios físicos de las propiedades de la matriz.
- Comprender las interacciones entre las células y la matriz extracelular es fundamental para avanzar en la investigación de biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método proporciona un modelo fisiológicamente relevante de matriz extracelular tridimensional derivado de fibroblastos, que permite una evaluación más predictiva de fenotipos angiogénicos y tumorigénicos en investigaciones de descubrimiento. Al imitar la composición y estructura de la matriz in vivo, apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en líneas de desarrollo de fármacos enfocadas en oncología y angiogénesis. El sistema mejora la continuidad traslacional al permitir el estudio de comportamientos celulares mediados por la matriz en condiciones controladas y reproducibles.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los efectos del remodelado de la matriz mediado por fibroblastos sobre la formación de tubos endoteliales como lectura funcional del potencial angiogénico.
- Valor operativo: Facilita la comprobación de hipótesis sobre factores proangiogénicos como PDGF-BB en la composición de la matriz y las respuestas endoteliales posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera matrices descelularizadas estandarizadas con deposición cuantificable de colágeno y fibronectina para la siembra consistente de células endoteliales.
- Valor operativo: Permite la preparación reproducible de andamios bioactivos para imágenes de alto contenido de estructuras tipo tubo mediante microscopía de campo claro.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela alteraciones del matriz extracelular inducidas por fibroblastos asociados al cáncer (CAF) que promueven la angiogénesis asociada al tumor.
- Valor operativo: Permite la evaluación de los efectos de fármacos dependientes de la matriz sobre la morfogénesis de células endoteliales en un sistema relevante para la enfermedad.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo de matriz derivada de fibroblastos se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación de dianas hasta la selección fenotípica, proporcionando un puente entre los resultados moleculares y la respuesta funcional angiogénica antes del compromiso preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa cómo los estados de activación de los fibroblastos modulan la arquitectura de la matriz para influir en el comportamiento de las células endoteliales.
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en imágenes de la formación de tubos para comparar las condiciones de la matriz entre grupos experimentales.
- Análisis: Permite el análisis mediante histogramas de dirección del alineamiento del colágeno y la fibronectina para evaluar fenotipos de remodelación matricial.
- Investigación Traducional: Conecta las propiedades de la matriz derivada de fibroblastos con vías de señalización angiogénica relevantes para la modelización del microentorno tumoral.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar compuestos pro- o antiangiogénicos en un ensayo contextualizado fisiológicamente.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas angiogénicas mediante el uso de una matriz que se asemeja estrechamente a la composición y estructura del ECM in vivo.
- Valor operativo: Proporciona un método estandarizado y escalable para generar matrices tridimensionales bioactivas aplicables a múltiples tipos celulares y condiciones experimentales.
- Valor estratégico: Reduce los falsos positivos biológicos en cribados de angiogénesis al incorporar tempranamente en la cascada de descubrimiento los efectos de la matriz mediados por el estroma.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo de moduladores angiogénicos según sus efectos sobre matrices remodeladas por fibroblastos y las respuestas endoteliales posteriores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de fibroblastos primarios, bioquímica de la matriz extracelular y técnicas de descelularización.
- Depende de la estimulación controlada con ácido ascórbico, reticulación con glutaraldehído y bloqueo con etanolamina para la estabilización de la matriz.
- Necesita bloqueo estandarizado con albúmina sérica bovina (BSA) desnaturalizada por calor y protocolos consistentes de siembra celular para ensayos reproductibles de formación de tubos endoteliales.
- Implica la optimización de la densidad celular y los tiempos de incubación para HUVEC u otros tipos celulares endoteliales a fin de obtener fenotipos angiogénicos cuantificables.
- Está limitado por el proceso intensivo en tiempo de generación de la matriz (más de 6 días de tratamiento con ácido ascórbico) y por la necesidad de reactivos estériles y filtrados para prevenir contaminación.
