Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón
15 de octubre de 2019
Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.
Este es un protocolo para el aislamiento de células madre musculares de ratón primario para el estudio del metabolismo ex vivo. Este protocolo proporciona una población mucho mayor de células madre en comparación con otros protocolos que hemos probado en el pasado. Y lo que es más importante, una vez que diferenciamos estas células madre en miotubos, exhiben fisiología normal, así como cosas como los ritmos circadianos.
Al probar este procedimiento por primera vez, tome notas detalladas y guarde varias imágenes porque cada tejido explant se ve diferente y habrá variación en el crecimiento de los mióblastos. Sin demostración visual, es difícil saber si estás aislando las células correctas. Nos beneficiamos de la generosa ayuda de otras personas que nos mostraron este método cuando lo establecimos en nuestro laboratorio.
Después de preparar el plato para la disección de acuerdo con el manuscrito, prepare una cámara húmeda colocando de dos a tres hojas de papel absorbente grueso en una bolsa de plástico y use una pipeta para mojar la superficie del papel con agua estéril. Coloque la cámara debajo de la luz UV durante cinco minutos para esterilizar. Diseccione el músculo deseado de un ratón de cuatro a ocho semanas de edad y enjuague suavemente en PBS que contiene 40 microgramos por mililitro de gentamicina para esterilizar.
Utilice fórceps estériles para transferir el músculo a una placa estéril de Petri no recubierta de 10 centímetros. Añadir 0,5 a un mililitro de medios de chapado sobre el músculo de modo que el tejido esté húmedo pero no flotante. Usa un bisturí estéril o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente el músculo en pequeños fragmentos.
Utilice fórceps o una pipeta para transferir los fragmentos musculares a la superficie de una placa pre-recubierta de seis centímetros. Superponga muy suavemente 0,8 mililitros de medios de chapado sobre el tejido. Coloque el plato de seis centímetros que contiene los fragmentos musculares dentro de la cámara húmeda y devuélvalo a una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.
Preparar y precalentar medios de mioblast, trippsina y PBS-gentamicina en un baño de agua a 37 grados centígrados. Para recubrir un matraz T25 para cada grupo muscular, agregue dos mililitros de solución de recubrimiento a la superficie del matraz, agite suavemente para crear una capa uniforme en la superficie e incubar el matraz a cuatro grados Centígrados durante una hora. Ahora con una pipeta, retire el medio de chapado de los explantes musculares y enjuague suavemente los explantes musculares con dos mililitros de PBS-gentamicina.
Retire rápidamente el PBS y no deje que la placa se siente en el PBS. A continuación, agregue suavemente un mililitro de PBS-gentamicina y coloque la placa en la incubadora de 37 grados Celsius durante un minuto. Utilice una pipeta P1000 para recoger el PBS con células en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.
A continuación, agregue un mililitro de tripsina al plato y devuélvalo a la incubadora de 37 grados Celsius durante tres minutos. Toque suavemente las placas para desalojar los mioblastos. Recoja la tripina con las células y combínela con la colección PBS.
Agregue ocho mililitros de medios de mioblast al tubo centrífugo e invierta suavemente para mezclar. Superponga suavemente dos mililitros de solución de chapado en las placas musculares y devuelva las placas a la incubadora de 37 grados Celsius. Gire los tubos centrífugos que contienen células en una centrífuga durante tres minutos a 200 veces g.
Aspirar el sobrenadante y mantener aproximadamente un mililitro en el tubo. Agregue suavemente medios de mioblasto, transfiera las células al matraz pre-recubierto y coloque el matraz en la incubadora de 37 grados Celsius. Aspirar los medios de los matraces P0 myoblast T25.
Enjuague brevemente las células con dos mililitros de PBS-gentamicina caliente y luego aspire el PBS del matraz. Pipetear dos mililitros de PBS caliente en cada matraz que contiene mioblastos. Coloque los matraces con PBS en la incubadora de 37 grados Celsius durante tres minutos.
A continuación, toque firmemente el lado del matraz para desalojar las células. Compruebe bajo un microscopio de luz si hay mioblastos flotantes. Coloque los matraces en posición vertical en una capucha de cultivo de tejido y enjuague la parte inferior de los matraces con 10 mililitros de medios de mioblasto de dos a tres veces para asegurarse de que todas las células estén desalojadas.
Recoger la mezcla de medios celulares en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar durante tres minutos a 200 veces g. Aspirar el medio para dejar alrededor de un mililitro en el tubo teniendo cuidado de evitar el pellet celular.
Agregue suavemente un volumen adecuado de medios de mioblast al tubo centrífugo y mezcle suavemente. Distribuya la mezcla celular a los nuevos matraces T75 de seis mililitros cada uno. Agregue 10 mililitros de medios de mioblast a cada nuevo matraz T75.
Agitar suavemente los matraces horizontalmente para distribuir las células y colocarlas en la incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. En este protocolo, las células primarias surgieron de los explantes se observaron bajo un microscopio de luz estándar. Las primeras cosechas de mioblastos aparecieron como pequeñas esferas redondas y brillantes.
La diferenciación de los mioblastos tomó de cuatro a seis días durante los cuales la morfología de las células cambió de esferas redondas únicas a fibras multinómodas largas fusionadas alargadas. Se producieron miotubos totalmente diferenciados que estaban listos para medir las tasas de consumo de oxígeno. Estas células se pueden utilizar para un número de aplicaciones descendentes.
Por ejemplo, con frecuencia los utilizamos para estudiar el flujo de sustrato en instrumentos de caballitos de mar.
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Descripción general
Este protocolo describe el aislamiento de mioblastos primarios a partir de músculos esqueléticos de ratones adultos jóvenes, facilitando el estudio del metabolismo de las células musculares ex vivo. El método proporciona una población mayor de células madre en comparación con técnicas previas, lo que permite estudios fisiológicos detallados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Fisiología muscular
Antecedentes
- Los mioblastos son células precursoras que se diferencian en miotubos y fibras musculares esqueléticas.
- Comprender el metabolismo de las células musculares es fundamental para diversos estudios biológicos.
- Los protocolos anteriores produjeron poblaciones más pequeñas de células madre musculares.
- La demostración visual es esencial para el aislamiento exitoso de las células correctas.
Objetivo del estudio
- Presentar un método eficiente para aislar mioblastos primarios.
- Permitir estudios moleculares y genéticos de células musculares.
- Proporcionar información sobre el metabolismo y la fisiología de las células musculares.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de mioblastos primarios del músculo esquelético de ratón.
- Cultivo de mioblastos para su diferenciación en miotúbulos.
- Documentación visual de los explantes de tejido durante el procedimiento.
- Comparación con protocolos previos de aislamiento.
Resultados principales
- El protocolo produce una población mayor de mioblastos.
- Los miotubos derivados de estas células exhiben características fisiológicas normales.
- La variabilidad en los explantes de tejido requiere una observación y documentación cuidadosas.
- El aislamiento exitoso se mejora mediante la orientación visual de investigadores experimentados.
Conclusiones
- Este método es eficaz para estudiar el metabolismo de las células musculares.
- Proporciona un enfoque confiable para obtener mioblastos primarios.
- Estudios futuros pueden aprovechar este protocolo para diversas investigaciones relacionadas con el músculo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento y diferenciación robustos de mioblastos primarios a partir de explantes de músculo esquelético de ratón permiten modelar de forma reproducible el metabolismo de las células musculares ex vivo para el descubrimiento temprano de fármacos. Este sistema posibilita la investigación de alta fidelidad de las vías metabólicas, la utilización de sustratos y las perturbaciones genéticas en un formato escalable y estandarizado. El enfoque mejora la confianza predictiva para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en programas terapéuticos relacionados con el músculo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la investigación de vías metabólicas y la validación funcional de dianas en células musculares primarias.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al proporcionar modelos de miotúbulos fisiológicamente relevantes con ritmos circadianos normales.
- Facilita estudios basados en hipótesis sobre el metabolismo muscular y la función génica mediante el uso de ADN exógeno o vectores virales.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una fuente reproducible de mioblastos primarios para ensayos metabólicos cuantitativos, incluyendo el análisis de flujo de sustratos.
- Facilita la estandarización y escalabilidad de ensayos para la cribado de compuestos en sistemas de células musculares.
- Permite la preparación de miotubos diferenciados adecuados para lecturas metabólicas de alto contenido.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Ofrece un sistema ex vivo relevante para la enfermedad para estudiar fenotipos metabólicos en diversos modelos de ratón.
- Se alinea con las estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir la medición directa del consumo de oxígeno y de la utilización de sustratos.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la integración de la biología muscular in vitro e in vivo.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta el desarrollo del ensayo y los estudios metabólicos preclínicos.
- Biología de Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en células musculares primarias.
- Selección: Proporciona poblaciones celulares reproducibles y escalables para ensayos metabólicos cuantitativos.
- Análisis: Permite la medición de tasas de consumo de oxígeno y flujo de sustratos para análisis comparativo.
- Investigación Traducida: Ofrece una plataforma ex vivo para alinear hallazgos metabólicos con modelos in vivo.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado para su uso repetido en proyectos de metabolismo muscular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios del metabolismo muscular.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad, escalabilidad y estandarización de los flujos de trabajo con células primarias.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en programas tempranos de dianas musculares.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de activos terapéuticos relacionados con el músculo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de aislamiento y diferenciación de células primarias.
- Necesita acceso a instalaciones estériles de cultivo celular e instrumentación para ensayos metabólicos.
- Exige una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes modelos de ratón u orígenes de tejido muscular.
- La documentación visual y la capacitación son fundamentales debido a la variabilidad en el crecimiento de los explantes.
