Name: Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a evaluar la carga tumoral mediante detección de GFP e imagen de bioluminiscencia en un modelo ortotópico de cáncer de mama. Este protocolo mejora la precisión en la cuantificación de micrometástasis y la eficacia terapéutica.

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Los autores desean reconocer el apoyo del Programa de Investigación Intramuros de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer, bethesda MD, el Programa de Cáncer e Inflamación, y el Laboratorio Nacional Frederick - Programa de Imágenes de Animales Pequeños, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, Estados Unidos.

El análisis del crecimiento tumoral se llevó a cabo utilizando protocolos aprobados por el Comité para la Etica de Los Experimentos Animales del Instituto Nacional del Cáncer y se adhirieron a las recomendaciones de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio", la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" del Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos, y la "Política sobre el Cuidado y Uso Humano de Animales de Laboratorio".
1. Preparación de células para la implantación
NOTA: Las células de adenocarcinoma mamario humano MDA-MB-231 (adquiridas comercialmente) fueron establemente infectadas con el gen de la luciferasa III y el marcador mejorado de proteína fluorescente verde (GFP) por lentivirus y se cultivaron en presencia del antibiótico de selección (puromicina) .
<ol><li>Inicie el cultivo celular con 1 x 106 células MDA-MB-231-Luc/GFP y agregue 15 ml de medio RPMI 1640 precalentado (37 oC) con suero bovino fetal (FBS) al 10% en un matraz de cultivo T75. Mantenga las células creciendo en una incubadora de cultivo celular con temperatura controlada a 37 oC con un 5% deCO2. Reemplace el medio completo al menos 2 veces a la semana. NOTA: No moleste el crecimiento celular y siga comprobando las condiciones de crecimiento celular diariamente. Las células necesitan ser subcultivadas cuando alcanzan una confluencia del 85%-90% para mantener la fase de proliferación.</li>
	<li>Una semana antes de la implantación celular, retire la puromicina del matraz de cultivo celular retirando primero todo el medio en el matraz de cultivo, luego enjuagándose 2x con 10 ml de solución salina tamponada de fosfato 1x (PBS), y finalmente reemplazando el medio por medio completo sin la puromicina. Durante los pasos de adición y ensado medio, no moleste las células. Recuerde no utilizar el medio completo con los antibióticos de selección a partir de ahora para todos los pasos de reabastecimiento medio.</li>
	<li>El día de la preparación de las células para la implantación, retire todo el medio completo antes de la trippsinización para evitar desactivar la trippsina. Añadir 5 ml de tripsina al matraz para trippsiizar las células. Supervise las células y compruebe que se desprenden del matraz de cultivo.</li>
	<li>Una vez que la mayoría de las células se separan, agregue 10 mL de medio completo para neutralizar la actividad de la trippsina. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de 50 ml y centrífuga a 150 x g para peletizar las células. Retire el sobrenadante después de la centrifugación y luego agregue 10 ml de 1pbS para resuspender las células y prepararse para el recuento celular.</li>
	<li>Cuente las células con un contador celular y ajuste la concentración celular a 20 x 106 células/ml en frío 1x PBS que contiene 25% matriz de membrana sótano. Inyectar 2 x 106 células en 0,1 ml 1x PBS con 25% de matriz de membrana de sótano en la cuarta almohadilla de grasa mamaria de cada ratón. Traiga agujas y jeringas adicionales para la implantación celular y mantenga la mezcla de matriz de membrana de sótano celular en hielo antes de la implantación. NOTA: Hay espacio muerto en la jeringa y la aguja. Dependiendo de la elección de la longitud, el tipo y el tamaño de la aguja y la jeringa, una jeringa de tuberculina con una aguja de 0,5 en 26 G puede tener hasta 70 ml de espacio muerto10. Prepare una mezcla de implantación celular de 40%-50% más para compensar el espacio muerto y cualquier otra pérdida accidental.</li>
</ol>2. Modelo de cáncer de mama ortotópico y medición del tamaño del tumor
<ol><li>Permita que los ratones desnudos atímicos femeninos de 6 semanas de edad se aclimaten a la instalación de alojamiento durante al menos 1 semana antes de la implantación celular. NOTA: El uso de ratones de la misma edad reducirá la variación de datos.</li>
	<li>Para cada ronda, anestetiza cinco ratones con isoflurano al 4% con aire filtrado (0,2 m) a un caudal de 1 L/min durante 3 x 4 minutos. Una vez que ya no se muevan, retire un ratón y coloque un cono nasal sobre su nariz y boca con la misma anestesia.</li>
	<li>Swab la glándula mamaria izquierda 4con alcohol. Usando fórceps dientes de rata finas, levante ligeramente la glándulamamaria 4 para insertar la aguja de 25 G. Asegúrese de que la aguja esté biselada hacia arriba y luego tire ligeramente del émbolo para asegurarse de que la aguja no golpee ningún vaso sanguíneo. Si no entra sangre en la jeringa, continúe inyectando lentamente 100 l de la mezcla de matriz de membrana de sótano de células en la almohadilla de grasa mamaria. NOTA: Un área redonda y elevada aparecerá debajo de la piel.</li>
	<li>Espere de 10 a 15 s para que la matriz de membrana del sótano se endurezque y, a continuación, retire la aguja. Repita el proceso con los ratones restantes en la cámara de inducción. Coloque todas las agujas y jeringas usadas en una caja afilada.</li>
	<li>Utilice el mismo lugar de inyección de la glándula mamaria para todos los ratones. Vigile de cerca el lugar de la inyección y observe cualquier mezcla de implantación celular que se escape del lugar de inyección. NOTA: En pocos minutos, el ratón comenzará a recuperar la conciencia.</li>
	<li>Permita que el xenoinjerto crezca libremente sin ninguna interrupción durante 7 a 10 días antes de cualquier medición del tamaño del tumor.</li>
	<li>Examine todos los ratones para el tamaño del xenoinjerto. Mida el tamaño del tumor con una pinza. Determine el volumen del tumor (mm3) con la siguiente ecuación: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq1.jpg"> donde L es la dimensión más larga y W es la dimensión más corta perpendicular a L.</li>
	<li>Identifique y elimine los valores atípicos que superen una desviación estándar de la media. Utilice ratones con tamaños de tumor comparables para experimentos. Divida aleatoriamente a los ratones en diferentes grupos de tratamiento y comience los tratamientos.</li>
	<li>Mida el tamaño del tumor por pinza 2 veces a la semana. Tenga en cuenta todos los cambios físicos de los xenoinjertos (es decir, necrosis, laceración).</li>
</ol>3. Bioluminiscencia in vivo e imágenes de fluorescencia ex vivo
NOTA: En este estudio, tanto la bioluminiscencia bidimensional como la fluorescencia se llevan a cabo en el punto final del experimento. La imagen de bioluminiscencia (BLI) se realizó utilizando un escáner óptico preclínico comercial equipado con una cámara CCD refrigerada de 16 bits y una etapa de imagen calentada.
<ol><li>Antes de la toma de imágenes, anestetiza hasta cinco ratones con tumores en la cámara de inducción estableciendo isoflurano al 3% con aire filtrado (0,2 m) a un caudal de 1 L/min durante 3 x 4 minutos. Asegúrese de que la cámara de inducción se mantiene dentro de una campana ventilada para minimizar la exposición del personal al isoflurano.</li>
	<li>Administrar D-luciferina (150 mg/kg) a los ratones anestesiados por una vía intraperitoneal utilizando una aguja de 27 G, y transferir un ratón anestesiado a la cámara de imágenes. En la cámara de imágenes del escáner, mantenga el isoflurano en 2% a 2,5% con O2 como portador con un caudal de 1 L/min. NOTA: Mantenga la temperatura corporal del ratón a 37 oC durante el procedimiento manteniendo una almohadilla calentada debajo de la cámara de inducción de anestesia, una tabla de imágenes (si la etapa no está calentada) y una jaula de recuperación postprocesal.</li>
	<li>Antes de tomar imágenes de los ratones del estudio, obtenga la cinética de luciferina mediante la toma de imágenes de tres ratones portadores de tumores adicionales (animales no asignados a ningún grupo de estudio) a intervalos de 2 minutos durante un total de 40 minutos utilizando los siguientes parámetros: filtro de excitación bloqueado, filtro de emisión abierta, f/stop 1, FOV-D, binning medio (8 x 8) y exposición automática. Utilice la señal de bioluminiscencia máxima medida para definir la ventana de tiempo de adquisición de imagen óptima para todos los puntos de tiempo posteriores.</li>
	<li>Mientras realiza imágenes de metástasis, proteja la señal DE BLI alta del tumor primario cubriéndola con una manga cortada de un guante negro. Adquiera la imagen utilizando los mismos parámetros descritos en el paso 3.3 con el lado ventral del ratón mirando hacia la cámara para obtener imágenes de metástasis pulmonar y el lado dorsal del ratón frente a la cámara para la toma de imágenes de metástasis cerebral. NOTA: Es esencial probar algunas marcas diferentes de guantes negros para elegir el que tiene una luminiscencia automática mínima.</li>
	<li>Usando un escáner y un software de análisis de datos, dibuje una región de área de interés (ROI) de forma estándar sobre la cavidad torácica o el cerebro asegurando que todo el órgano de interés esté cubierto para evaluar la carga metastásica. Cuantificar la salida de bioluminiscencia (BL) como flujo total (fotones/segundo).</li>
	<li>Inmediatamente después de BLI, eutanasia el ratón a través de la asfixia por CO2 (según las directrices de la ACUC y los protocolos animales aprobados por la institución) y extraiga el pulmón y el cerebro con tijeras y fórceps disecantes para la toma de imágenes ex vivo. NOTA: El pulmón extraído para imágenes ex vivo y para el recuento de nódulos de metástasis pulmonares no se puede realizar con el mismo ratón debido a procedimientos incompatibles.</li>
	<li>Enjuague rápidamente todos los órganos con 1 x PBS para eliminar cualquier mancha de sangre superficial y colocar los órganos en una placa de plástico negro de baja autofluorescencia. Transporte órganos a un escáner de fluorescencia multiespectral equipado con capacidad de desmezcla espectral (ajuste de longitud de onda de cristal líquido de estado sólido) con una cámara CCD de 12 bits para la detección de GFP.</li>
	<li>Adquirir imágenes multiespectrales de GFP (filtro de excitación a 457 x 23 nm; filtro de emisión a 490 nm de paso largo) de los órganos extraídos y ratones de control de rodamientos no tumorales escaneando a través de 500 a 720 nm con un tamaño de paso de 10 nm. Utilice órganos extirpados de ratones de control de rodamientos no tumorales para corregir la autofluorescencia.</li>
	<li>Después de la creación de imágenes GFP multiespectrales, determine la configuración de imagen óptima. Realizar la adquisición de imágenes de todos los órganos diana y realizar análisis de imágenes (es decir, generar una biblioteca espectral para autofluorescencia y GFP para el procedimiento de desmezcla espectral) de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
</ol>4. Detección molecular de células de cáncer de mama metastásica
<ol><li>Después de la toma de imágenes ex vivo, el chasquido congela todo el cerebro en nitrógeno líquido y guárdalo a -80 oC en un congelador hasta que esté listo para la extracción de ADN.</li>
	<li>Para la extracción de ADN, poner todo el cerebro en un tubo homogeneizador de 5 ml con 2 ml de tampón de lisis de ADN. Utilice un homogeneizador con el ajuste de potencia a 50 para homogeneizar el tejido cerebral entero congelado. Una vez que el tejido cerebral esté totalmente homogeneizado, transfiera la suspensión de 1 ml (lysate) a un tubo de microcentrífuga de 2 ml libre de DNase y libre de RNase y continúe aislando el ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. NOTA: Para minimizar la contaminación del ADN de arrastre, limpie a fondo el homogeneizador después de cada muestra enjuagándolo primero con etanol al 75% en agua libre de DNase y sin RNase, luego enjuagando con una solución NaOH de 1 M, seguido de un enjuague con 75% de etanol en sin DNase y sin DNase y Agua libre de RNase para reducir y destruir eficazmente cualquier residuo de ADN.</li>
	<li>Añadir 0,5 ml de etanol 100% de tampón de lisis de ADN al lisado. Mezclar la muestra por inversión y almacenar a temperatura ambiente durante 3 min. NOTA: No invierta demasiadas veces o con demasiada fuerza. El ADN será visible como un precipitado similar a la lana.</li>
	<li>Utilice una punta de pipeta para transferir el ADN a un tubo de microcentrífuga de 2 ml libre de DNase y sin RNase. Dejar secar al aire la muestra durante 1 min. Añadir 1 ml de etanol 75% e invertir el tubo de microcentrífuga 3 x 6x para lavar la muestra de ADN. Deseche el etanol después de cada lavado pipeteando. Repita el paso de lavado 2x.</li>
	<li>Seque al aire la muestra de ADN durante 10 s. A continuación, añadir 52 l de NaOH de 8 mM para disolver la muestra de ADN. Pipet 2-L de la muestra de ADN para la cuantificación del ADN, y utilice los 50 l restantes para un ensayo de PCR en tiempo real después del ajuste de la concentración. NOTA: NaOH ayuda a solubilizar completamente la muestra de ADN.</li>
	<li>Cantidad de 2 ml de cada muestra de ADN con un espectrofotómetro y utilice una relación de absorción entre A260/280 como referencia de control de calidad. Calcule la concentración de ADN con esta fórmula: <img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq2.jpg">
</li>
	<li>Ajustar la concentración de ADN a 50 ng /L. Para cada muestra de ADN, utilice 50 ng de ADN como plantilla de inicio para un ensayo de PCR en tiempo real. Utilice la solución NaOH de 8 mM o agua libre de DNase y libre de RNase para diluir la muestra de ADN.</li>
	<li>Diseñe internamente el par de imprimación específico para la secuencia de proteína de fluorescencia verde exógena (GFP) utilizando un portal web de diseño de imprimación de código abierto para la detección de PCR en tiempo real de la etiqueta GFP en las células metastásicas que invadieron y colonizaron sitios distales. NOTA: Este estudio utilizó F: 5'-AGAACGGCATCAAGGTGAAC-3', R: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'.</li>
	<li>Utilice un reactivo de PCR en tiempo real rápido y una máquina PCR en tiempo real que admita un protocolo de PCR en tiempo real rápido. Además de los pasos de amplificación regulares de 30 ciclos, añada un paso de curva de disociación al final de la ejecución para la detección de cualquier amplificación inespecífica. NOTA: Se utilizaron las siguientes condiciones para la detección molecular: arranque en caliente de 95 oC 2 min, 40 ciclos de 95 oC 5 s, 60 oC 15 s y, por último, un análisis de curva de fusión. El gampín GFP tiene un tamaño de 135 bp.</li>
	<li>Utilice un ADN cerebral de ratón ingenuo (no un implante celular MDA-MB-231) como un control negativo. Utilice EL ADN extraído de las células MDA-MB-231-GFP/Luc como control positivo. Agregue todos los reactivos PCR sin ninguna plantilla de ADN como un control sin plantilla (NTC). NOTA: Se necesita un control de PCR para cada ensayo de PCR.</li>
</ol>5. Detección de células de cáncer de mama metastásica en pulmón
<ol><li>Para el subgrupo de ratones elegido para el recuento de nódulos pulmonares metastásicos, anestetiza ratones con isoflurano (como en el paso 2.2) inmediatamente después de la toma de imágenes ex vivo, realizar una punción cardíaca para la recolección de sangre, y luego eutanasia por luxación cervical.</li>
	<li>Abra la cavidad torácica con tijeras dislindantes y corte más allá del corazón y el timo para exponer la tráquea.</li>
	<li>Inserte una jeringa de 10 ml con una aguja de 22 G que contenga la solución de Bouin en la tráquea. Empuje el émbolo de la jeringa hasta que los pulmones colapsados estén hinchados con 2 ml de la solución de Bouin. Retire la jeringa y la aguja una vez que los pulmones se hayan inflado.</li>
	<li>Coloque todo el pulmón en un tubo de 15 ml que contenga la solución de Bouin, invierta suavemente el tubo unas cuantas veces y deje en remojo durante 24 horas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Después de 24 h, retire la solución de Bouin del tubo, enjuague el pulmón con agua y luego colóquelo de nuevo en el tubo con 70% de etanol. Recuento de metástasis (parches blancos o nódulos) en las superficies de los pulmones mediante un microscopio de disección.</li>
</ol>6. Recopilación y análisis de datos
<ol><li>Registre los datos del volumen del tumor, así como los datos de imágenes in vivo y ex vivo, en una hoja de cálculo electrónica para facilitar la entrada, recopilación y gestión de datos.</li>
	<li>Al final del experimento, transfiera todos los datos a la hoja de cálculo electrónica y al software estadístico para el trazado de datos y los análisis estadísticos.</li>
</ol>

<ol><li>Abramson, V. G., Lehmann, B. D., Ballinger, T. J., Pietenpol, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtyping+of+triple-negative+breast+cancer%3A+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Subtyping of triple-negative breast cancer: implications for therapy.</a> Cancer. 121, 8-16 (2015).</li>
<li>Zhuang, X., Zhang, H., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+and+Microenvironment+Plasticity%3A+Double-Edged+Swords+in+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cancer and Microenvironment Plasticity: Double-Edged Swords in Metastasis.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (6), 419-429 (2019).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
<li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (56), e3175(2011).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54903(2016).</li>
<li>Lim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumor+metastases+and+osteolytic+lesions+with+bioluminescence+and+micro+CT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2775(2011).</li>
<li>Bauerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-modal+imaging+of+angiogenesis+in+a+nude+rat+model+of+breast+cancer+bone+metastasis+using+magnetic+resonance+imaging%2C+volumetric+computed+tomography+and+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-modal imaging of angiogenesis in a nude rat model of breast cancer bone metastasis using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.</a> Journal of Visualized Experiments. (66), e4178(2012).</li>
<li>Katsuta, E., Oshi, M., Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+a+Murine+Orthotopic+Metastatic+Breast+Cancer+Model+and+Performing+Murine+Radical+Mastectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57849(2018).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model?</a> Journal of Thoracic Disease. 5, 385-392 (2013).</li>
<li>Bhambhani, V., Beri, R. S., Puliyel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inadvertent+overdosing+of+neonates+as+a+result+of+the+dead+space+of+the+syringe+hub+and+needle%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%3A+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Inadvertent overdosing of neonates as a result of the dead space of the syringe hub and needle.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90, F444-F445 (2005).</li>
<li>Zhang, G. L., Zhang, Y., Cao, K. X., Wang, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Injection+of+Breast+Cancer+Cells+into+the+Mice+Mammary+Fat+Pad%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58604(2019).</li>
<li>Tavera-Mendoza, L. E., Brown, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+less+invasive+method+for+orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A less invasive method for orthotopic injection of breast cancer cells into the mouse mammary gland.</a> Laboratory Animals. 51, 85-88 (2017).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Orthotopic+Mouse+Model+of+Spontaneous+Breast+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Kocaturk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Fletcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+breast+adipose+tissue%3A+characterization+of+factors+that+change+during+tumor+progression+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human breast adipose tissue: characterization of factors that change during tumor progression in human breast cancer.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36, 26(2017).</li>
<li>Giuliano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axillary+dissection+vs+no+axillary+dissection+in+women+with+invasive+breast+cancer+and+sentinel+node+metastasis%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 305, 569-575 (2011).</li>
<li>Rummel, S., Hueman, M. T., Costantino, N., Shriver, C. D., Ellsworth, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+location+within+the+breast%3A+Does+tumour+site+have+prognostic+ability%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Ecancermedicalscience%22%5BJournal%5D)">Tumour location within the breast: Does tumour site have prognostic ability?</a> Ecancermedicalscience. 9, 552(2015).</li>
<li>Kroman, N., Wohlfahrt, J., Mouridsen, H. T., Melbye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+tumor+location+on+breast+cancer+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of tumor location on breast cancer prognosis.</a> International Journal of Cancer. 105, 542-545 (2003).</li>
<li>Bao, J., Yu, K. D., Jiang, Y. Z., Shao, Z. M., Di, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+laterality+and+primary+tumor+site+on+cancer-specific+mortality+in+breast+cancer%3A+a+SEER+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of laterality and primary tumor site on cancer-specific mortality in breast cancer: a SEER population-based study.</a> PLoS One. 9, e94815(2014).</li>
<li>Faustino-Rocha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+rat+mammary+tumor+volume+using+caliper+and+ultrasonography+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements.</a> Lab Animal. 42, 217-224 (2013).</li>
<li>Mullen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Matrigel+to+facilitate+the+establishment+of+human+cancer+cell+lines+as+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of Matrigel to facilitate the establishment of human cancer cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 287-292 (2004).</li>
<li>Jensen, R. L., Leppla, D., Rokosz, N., Wurster, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+augments+xenograft+transplantation+of+meningioma+cells+into+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Matrigel augments xenograft transplantation of meningioma cells into athymic mice.</a> Neurosurgery. 42, 130-136 (1998).</li>
<li>Mullen, P., Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+in+the+establishment+of+ovarian+carcinoma+cell+lines+as+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel in the establishment of ovarian carcinoma cell lines as xenografts.</a> Methods in Molecular Medicine. 39, 199-203 (2001).</li>
<li>Fliedner, F. P., Hansen, A. E., Jorgensen, J. T., Kjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+matrigel+has+no+influence+on+tumor+development+or+PET+imaging+in+FaDu+human+head+and+neck+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">The use of matrigel has no influence on tumor development or PET imaging in FaDu human head and neck cancer xenografts.</a> BMC Medical Imaging. 16, 5(2016).</li>
<li>Mullen, P., Ritchie, A., Langdon, S. P., Miller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Matrigel+on+the+tumorigenicity+of+human+breast+and+ovarian+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of Matrigel on the tumorigenicity of human breast and ovarian carcinoma cell lines.</a> International Journal of Cancer. 67, 816-820 (1996).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Institute+for+Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> Journal of the Institute for Laboratory Animal Research. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Troy, T., Jekic-Mullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Comparison+of+the+Sensitivity+of+Detection+of+Fluorescent+and+Bioluminescent+Reproters+in+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative Comparison of the Sensitivity of Detection of Fluorescent and Bioluminescent Reproters in Animal Models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para el estudio de TNBC en animales, se han desarrollado dos modelos murinos: las células de adenocarcinoma de mama seres humanos MDA-MB-231 en ratones inmunes comprometidos (es decir, ratones desnudos atímicos, ratones NSG) y el 4T1 en ratones BALB/c inmuno-competentes. Ambos modelos tienen sus ventajas. La elección del modelo animal para un estudio depende de los objetivos de investigación. Por ejemplo, el modelo MDA-MB-231 es una línea celular TNBC humana cultivada en ratones inmunocomprometidos que imita a los pacientes inmunosuprimidos de cáncer de mama humano. Por otro lado, el fenotipo invasivo de las células de cáncer de mama murina ortotópica 4T1 triple negativa en ratones BALB/c imita de cerca el proceso metastásico como ocurre en pacientes con cáncer de mama humano en estadio IV. A diferencia del enfoque de inyección de células intravenosas, las células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231 se inyectaron de manera similar en la almohadilla de grasa mamaria11,,12 en el cáncer de mama ortotópico modelo11,13. El crecimiento tumoral más largo y la capacidad metastásica adquirida es más relevante fisiológicamente, por lo que no es un cáncer metastásico artificial modelo4,,14. Este modelo de metástasis espontánea imita de cerca el desarrollo del cáncer de mama humano, excepto en la etapa de iniciación. Este es un modelo crucial para la detección de fármacos in vivo y la evaluación terapéutica de la eficacia en el cáncer de mama metastásico.
El sitio de implantación del tumor en el ratón juega un papel crucial en proporcionar un microambiente que sustenta el crecimiento tumoral y la selección de fenotipo metastásico similar al que ocurre en los seres humanos. El ganglio linfático proximal y la presencia de tejido adiposo son los factores clave que afectan la progresión de la enfermedad del cáncer de mama15,16. En un paciente humano, el ganglio linfático y el tejido adiposo son factores interactuadores clave que afectan la neoplasia maligna y la incidencia de cáncer de mama17,,18,,19. Por lo tanto, la selección de la ubicación anatómica correcta para el lugar de inyección puede afectar en gran medida la relevancia del modelo tumoral en comparación con la enfermedad humana. Este estudio utilizó la cuarta glándula mamaria como el sitio de implantación principalmente debido a los requisitos antes mencionados y que es anatómicamente más accesible y más fácil de manipular.
Diferentes métodos de cálculo del volumen del tumor están disponibles, y un investigador puede elegir los que consideren adecuado. El algoritmo seleccionado para este estudio se basa en los hallazgos de Faustino-Rocha et al., quienes compararon diferentes fórmulas de cálculo del volumen tumoral y concluyeron que la fórmula siguiente es la más precisa20.
<img src="/files/ftp_upload/60316/60316eq3.jpg">
La matriz de membrana de sótano es una importante matriz extracelular utilizada en varios ensayos in vitro21 e in vivo22,,23. Hay informes contradictotivos22,24,25 con respecto a la influencia de la matriz de membrana del sótano en la neoplasia maligna de xenoinjerto. Parece que sólo afecta al establecimiento inicial del xenoinjerto y no tiene ningún efecto adicional sobre el crecimiento del xenoinjerto25. Para la implantación de xenoinjerto descrita, la matriz de membrana del sótano se mezcló con las células cancerosas para aumentar la viscosidad de la solución de mezcla de células/gel antes de la implantación. La presencia de la matriz de membrana del sótano reduce la pérdida de solución de mezcla desde el lugar de inyección y mantiene la solución de mezcla en el lugar de implantación, aumentando así la uniformidad del volumen de xenoinjerto implantado.
La línea celular MDA-MB-231 es una línea celular de adenocarcinoma de mama humano inmortalizada malignamente y es una herramienta popular en la investigación del cáncer de mama debido a su estado triple negativo. El uso de la línea celular de reporteros duales (luciferasa y GFP) permite una mayor flexibilidad en el manejo de las imágenes in vivo y ex vivo. Está bien establecido que la señal de bioluminiscencia posee una mayor sensibilidad, detección de profundidad y contraste superior (relación señal-ruido) que las señales GFP. Debido a esto, es una modalidad de imagen ampliamente utilizada para imágenes de todo el cuerpo. Desafortunadamente, la detección de bioluminiscencia está limitada por una ventana de tiempo estrecho (15 x 20 minutos después de la inyección de luciferina) durante la cual la detección de señal es lineal. La señal BLI disminuye rápidamente cuando los animales son eutanasiados. Esto se convierte en un problema de diseño experimental si muchos ratones necesitan ser eutanasiados y se requiere la cosecha de múltiples tejidos u órganos. En estos estudios, se extrae sangre por punción cardíaca directa, el cerebro, el tumor primario, el pulmón y el ganglio linfático afectado en 40 ratones. En el momento en que los órganos fueron cosechados y listos para la toma de imágenes ex vivo, la señal de bioluminiscencia era indetectable. Por lo tanto, la detección GFP es más adecuada en estas situaciones. La emisión de la señal GFP está en el rango visible, y en estas longitudes de onda, la absorción de la señal debido a la sangre (es decir, la hemoglobina) es significativamente mayor. Además, la autofluorescencia en el rango visible debido a NADH, lipopigmentos y flavinas da como resultado un fondo significativo que hace difícil distinguir entre una señal GFP de bajo nivel y un fondo de autofluorescencia. El uso de un enfoque de imágenes de fluorescencia multiespectral en lugar de imágenes tradicionales de pares de filtros y el uso de algoritmos de desmezcla espectral ayuda a identificar la verdadera señal GFP en el órgano de interés. Por lo tanto, al combinar las fortalezas de la imagen de bioluminiscencia en la detección in vivo de todo el cuerpo y la imagen multiespectral de GFP en las evaluaciones ex vivo organ/tejido, los datos cuantificables pueden maximizarse en una gran cohorte de ratones.
No importa qué enfoque se selecciona para un estudio en animales, extraer toda la sangre antes de la recuperación de órganos / tejidos es muy recomendable, especialmente para los estudios dirigidos a la carga metastásica. Este protocolo detecta señales GFP de muestras de sangre enteras obtenidas de los ratones (datos no mostrados) en el modelo de cáncer de mama ortotópico mediante ensayos de PCR en tiempo real. Minimizar el volumen sanguíneo en órganos/tejidos reducirá la señal falsa positiva en los órganos diana.
En conclusión, el modelo ortotópico de cáncer de mama que utiliza las células MDA-MB-231-Luc/GFP es un modelo animal muy relevante que imita de cerca la condición humana del paciente TNBC. Este modelo es esencial para estudiar, monitorear y evaluar la eficacia terapéutica en un microambiente tumoral similar a los seres humanos. El uso de líneas celulares de reportero dual mejora aún más la practicidad de este modelo de cáncer de mama ortotópico.

Aproximadamente una de cada ocho mujeres en los Estados Unidos desarrollará cáncer de mama invasivo durante su vida, y entre el 10% y el 20% de estas mujeres serán diagnosticadas con el subtipo agresivo de cáncer de mama triple negativo (TNBC). Si bien las lesiones primarias se pueden extirpar quirúrgicamente en la mayoría de los casos, la micrometastasis subclínica y la quimiorresistencia la convierten en una enfermedad intratable. Es importante destacar que la mayoría de los pacientes con TNBC metastásica eventualmente recaen, incluso si se sometieron a tratamiento en la etapa temprana1. Por lo tanto, la heterogeneidad del cáncer, la micrometastasis y la resistencia terapéutica son tres desafíos principales que limitan el éxito del resultado clínico de los pacientes con TNBC. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de comprender mejor los antecedentes moleculares polimórficos de TNBC y desarrollar agentes terapéuticos eficaces que limiten la enfermedad metastásica.
La metástasis tumoral es un proceso de múltiples pasos en el que la célula tumoral controla y usurpa su microambiente para promover su propia diseminación a través de la degradación de la membrana y la fuga de células tumorales de la lesión primaria, a través de la entrada a (es decir, la intravasión) y la salida de (es decir, la extravasación) de la vasculatura, y en última instancia la colonización de adaptación y corrección dentro de los lechos de tejido distal2. Se han desarrollado modelos animales para estudiar la metástasis del cáncer de mama, donde se implementan comúnmente dos metodologías: inyección directa de circulación sanguínea e implantación ortotópica. Métodos comúnmente empleados para la inyección de circulación sanguínea directa incluyen la inyección de vena de cola, mientras que otros enfoques incluyendo inyección cardíaca directa3, inyección directa del cerebro4, y la inyección directa de hígado5 también se han empleado. La inyección directa de circulación sanguínea se conoce a menudo como un modelo de metástasis artificial, que es rápido y fácil pero menos fisiológicamente preciso porque elude la fuga tumoral de la lesión primaria y la intravasación6,7,8. En comparación con los modelos de inyección directa, el modelo de cáncer de mama ortotópico toma más tiempo para la aparición de lesiones metastásicas detectables en órganos remotos como el pulmón, pero es más relevante fisiológicamente porque imita de cerca el proceso metastásico multipaso como ocurre en los seres humanos. Es importante destacar que un estudio de 20139 comparó la inyección de la vena de cola y los modelos ortotópicos y encontró que las células de cáncer de mama inyectadas en la vena de la cola y las aisladas de lesiones metastásicas pulmonares después de la inyección de la vena de cola mostraron perfiles de expresión génica globalsimilares. Por el contrario, el perfil global de expresión génica de las células de cáncer de mama inyectadas ortotópicamente fue dramáticamente diferente al de las lesiones metastásicas pulmonares derivadas de células inyectadas ortotópicamente9. Estas observaciones sugieren que el modelo ortotópico es más relevante fisiológicamente, porque las lesiones metastásicas se someten a un proceso de selección similar al proceso de metástasis de varios pasos como ocurre en los seres humanos.
Este trabajo describe un modelo de cáncer de mama ortotópico (MDA-MB-231-Luc/GFP) en ratones desnudos que fue optimizado en nuestro laboratorio para técnicas de detección de imágenes, así como la identificación de nuevos biomarcadores y el desarrollo de agentes quimioterápicos dirigidos.

<table><tbody><tr><td>Solución Bouins</td><td>Sigma</td><td>HT10132-1L</td><td>Tinción de nódulos metastásicos pulmonares</td></tr><tr><td>D-Luciferina, Sal de potasio GoldBio</td><td></td><td>LUCK-1G</td><td>Sustrato de luciferasa</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>ThermoFisher</td><td>10503027</td><td>Kit de extracción de ADN Excel</td></tr><tr><td></td><td>Microsoft</td><td></td><td>Hoja de cálculo de software</td></tr><tr><td>homogeneizador</td><td>Virtis</td><td>Cyclone Virtishear</td><td>Para la homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Escáner IVIS SPECTRUM</td><td>Sistema de imágenes de fluorescencia y BLI</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de fluorescencia Maestro GNIR-FLEX</td><td>Sistema de imágenes de fluorescencia</td><td>Perkin Elmer</td><td></td></tr><tr><td>MatriGel Matrix</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Almacene a -20 ° C y manténgalo viejo (4 ° C) cuando esté en uso.</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 / Luciferasa-2A-GFP Línea celular estable</td><td>GenTarget</td><td>SC044</td><td>Dual Reporter línea celular de cáncer de mama humano</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS</td><td>Captura de imágenes histológicas</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>tampón de enjuague</td></tr><tr><td>Primer3</td><td>MIT</td><td></td><td>Primer Diseño</td></tr><tr><td>de imprimación Prisma</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Software de análisis estadístico</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>ThermoFisher A1113803</td><td></td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios</td><td>ThermoFisher</td><td>61870127</td><td>Medios</td></tr><tr><td>de cultivo SeniFAST SYBR Lo-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-94020</td><td>Reactivo de PCR rápida en tiempo real</td></tr><tr><td>StepOne Plus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Máquina de PCR en tiempo real</td></tr></tbody></table>

estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

El cáncer de mama triple negativo (TNBC) es un subtipo de cáncer de mama agresivo con opciones terapéuticas limitadas. En comparación con los pacientes con tumores de mama menos agresivos, la tasa de supervivencia de 5 años de los pacientes con TNBC es del 77% debido a su fenotipo resistente a los medicamentos característicos y a su carga metastásica. Con este fin, se han establecido modelos murinos destinados a identificar nuevas estrategias terapéuticas que limitan el crecimiento tumoral de TNBC y la propagación metastásica. Este trabajo describe una guía práctica para el modelo ortotópico TNBC donde las células de cáncer de mama MDA-MB-231 suspendidas en una matriz de membrana del sótano se implantan en la cuarta almohadilla de grasa mamaria, que imita de cerca el comportamiento de las células cancerosas en los seres humanos. Se discuten la medición de tumores por pinza, la evaluación de la metástasis pulmonar a través de imágenes in vivo y ex vivo, y la detección molecular. Este modelo proporciona una excelente plataforma para estudiar la eficacia terapéutica y es especialmente adecuado para el estudio de la interacción entre el tumor primario y los sitios metastásicos distales.

La medición del volumen tumoral por pinza es un método bien establecido para evaluar la eficacia del tratamiento(Figura 1). El número de células implantadas, el uso de la matriz de membrana del sótano, el microbioma, la limpieza de las instalaciones y el lugar de inyección son los factores clave que afectan la tasa de crecimiento del tumor.
A diferencia de las imágenes GFP, BLI requirió la administración de sustrato de luciferasa al menos 15 a 20 minutos antes de la toma de imágenes BLI. Además, la tensión del ratón, la línea celular, los tratamientos y el reportero de luciferasa afectan todos los niveles de señal de bioluminiscencia. Por lo tanto, para obtener señales comparables entre los grupos de estudio, se debe realizar un estudio cinético BLI preimagenpara determinar el mejor marco de tiempo de imagen(Figura 2).
Debido a la relación señal-fondo superior26,27, todo el cuerpo in vivo imágenes de bioluminiscencia fue bastante sensible en la detección de la señal de metástasis de bajo nivel en comparación con el enfoque GFP(Figura 3). Además, la señal de bioluminiscencia proporcionó una penetración más profunda que gFP por unos pocos milímetros. Sin embargo, la producción de señales de bioluminiscencia requiere ATP, que es un factor limitante en la evaluación de muestras de tejido ex vivo. Si los animales se procesan rápidamente, entonces BLI podría ser un enfoque viable para obtener resultados cuantitativos en metástasis. Una manera de lograr esto es procesando un animal a la vez. Sin embargo, este enfoque no era factible para este estudio porque se utilizó una gran cohorte de ratones. La señal BLI no se detectó cuando los órganos fueron imágenes alrededor de 45 min después de la inyección de luciferina. El uso de una línea celular de reportero dual es útil en esta situación. Debido a la naturaleza estable de la molécula de GFP, los investigadores tendrían tiempo suficiente para procesar la carcasa antes de capturar las señales GFP de los órganos diana(Figura 4).
La Figura 5 proporciona un ejemplo real de cómo las mediciones del tamaño del tumor de la pinza podrían distorsionar la interpretación de los datos, porque el xenoinjerto perdió la mayor parte del contenido viable de células tumorales, pero todavía mantenía su gran masa y forma. El examen histopatológico de esos xenoinjertos indicó necrosis dentro de la masa(Figura 5B).
Para los investigadores que desafían los resultados de la imagen con respecto a la metástasis cerebral en el modelo de cáncer de mama ortotópico, la detección molecular por PCR en tiempo real puede proporcionar evidencia convincente(Figura 6). En este caso, la secuencia de ADN gFP exógena era la mejor manera de abordar este problema, porque la secuencia de ADN GFP transotrofito no existe naturalmente en humanos o roedores.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig1.jpg"> Figura 1: Medición del volumen del tumor. La medición del volumen/carga del tumor con una pinza comenzó el día 10 después de la implantación del xenoinjerto y luego se midió 2 veces a la semana hasta el final del experimento. Las barras de error se calculan por valor SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig2.jpg"> Figura 2: Determinación de la ventana de adquisición de imagen óptima. Izquierda: Un ratón con un gran xenoinjerto y un ratón con un pequeño xenoinjerto fueron seleccionados para la determinación óptima del rango cinético de luciferina. Derecha: Curva cinética de Luciferin obtenida mediante la adquisición de las imágenes cada 2 min durante 40 min. Se observó una meseta entre 15 y 22 minutos, que se utilizó como un tiempo óptimo de adquisición de imágenes para todas las imágenes posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig3.jpg"> Figura 3: Imagen BLI de todo el cuerpo. L: Imagen BLI de todo el cuerpo. M: Vista ventral con la parte inferior del cuerpo cubierta con una manga de guante negro. R: Vista dorsal con la parte inferior del cuerpo cubierta con una manga de un guante negro. La metástasis de los ganglios linfáticos axilares se detecta en la vista ventral mediante imágenes BLI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig4.jpg"> Figura 4: Detección de señal EX vivo BLI/GFP. Las señales GFP se detectaron en el cerebro y el pulmón desde el mismo ratón 20 minutos después de que el ratón fue sacrificado. No se detectó una señal BLI 45 minutos después de la inyección de luciferina. No se detectó ninguna señal de GFP en el cerebro y el pulmón del ratón ingenuo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig5.jpg"> Figura 5: Ventajas de las técnicas de imagen óptica sobre las mediciones de la pinza. (A) Imagen representativa que muestra la detección de señal GFP in vivo en un tumor primario. Sólo una porción menor del xenoinjerto mostró señal de GFP, lo que sugiere que una porción significativa de la masa era estroma. Esto no puede ser determinado por las mediciones tradicionales de la pinza y puede conducir a una conclusión inexacta. Este ejemplo destaca la importancia de las imágenes ópticas para el estudio del modelo animal. (B) Sección de histopatología del mismo ratón que muestra que la región necrótica (es decir, la región interna) también contribuyó al cálculo del tamaño del tumor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60316/60316fig6.jpg"> Figura 6: Análisis de curva de fusión. La gráfica de curva de fusión que muestra la especificidad de los amplicons GFP. Se ensayó el ADN del cerebro obtenido de los ratones implantados en MDA-MB-231-Luc/GFP y el ADN aislado de las células MDA-MB-231-Luc/GFP cultivadas en cultivo (control positivo). El ensayo de PCR en tiempo real se realizó para evaluar el contenido de GFP en el tejido cerebral. (A,B) Las curvas de fusión del control positivo y el ADN extraído del cerebro del ratón, respectivamente. (C) Las curvas superpuestas de los paneles A y B, que indican que las señales máximas de los DNA del cerebro del ratón son específicas para la secuencia gFP exógena. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60316/60316fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este trabajo preestablece un protocolo avanzado para evaluar con precisión la carga del tumor mediante la detección de señales de proteína fluorescente verde y bioluminiscencia, así como la integración de la técnica de detección molecular cuantitativa.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Nuestro protocolo supera la limitada ventana de imágenes de bioluminiscencia al incluir una etiqueta GFP que también facilita la detección y cuantificación de la micrometastasis mediante el análisis de PCR. Debido a que la etiqueta GFP elude la ventana limitada de adquisición de bioluminiscencia, se pueden tener imágenes de más sujetos sin la pérdida de señal y el potencial de resultados negativos falsos es limitado. Este estudio será útil para los investigadores para la evaluación de la eficacia terapéutica de los agentes contra el cáncer.Esta metodología proporciona un modelo útil para los investigadores interesados en EMT, resistencia a los medicamentos y mecanismos de células madre cancerosas relacionados con el proceso metastásico, así como para el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal, frote la cuarta glándula mamaria izquierda con alcohol y use fórceps finos de dientes de rata para levantar ligeramente la cuarta glándula mamaria. Asegúrese de que la punta esté biselada, inserte una aguja de calibre 25 unida a una jeringa de un mililitro que contenga 100 microlitros de la mezcla de matriz de membrana del sótano celular y retraiga ligeramente el émbolo para asegurarse de que la aguja no entre en contacto con ningún vaso sanguíneo.Para obtener resultados comparativos, el lugar de inyección de células tumorales debe ser coherente entre todos los animales receptores. Si no entra sangre en la jeringa, inyecte lentamente todo el volumen de solución en la almohadilla de grasa mamaria. Una masa elevada redonda aparecerá debajo de la piel.Espere de 10 a 15 segundos para que la matriz de membrana del sótano se endurezca antes de extraer la aguja y permita que el xenoinjerto crezca libremente sin interrupción durante siete a 10 días antes de realizar una medición del tamaño del tumor. A continuación, utilice pinzas para medir el tamaño del xenoinjerto en todos los ratones y determinar el volumen tumoral utilizando la ecuación como se indica. Antes de tomar imágenes de los animales del estudio, imagine tres ratones con rodamientos de tumores adicionales durante 40 minutos a intervalos de dos minutos utilizando los parámetros indicados para obtener la cinética de luciferina para el estudio.Utilice la señal de bioluminiscencia medida de pico para definir la ventana de tiempo de adquisición de imagen óptima para todos los puntos de tiempo posteriores. Para realizar imágenes de metástasis, cubra el tumor primario con una manga cortada de un guante negro y coloque un ratón anestesiado en el escáner y luego imagine la señal de luciferina utilizando los mismos parámetros que acabamos de demostrar con el lado ventral del ratón frente a la cámara para imágenes de metástasis pulmonares y el lado dorsal del ratón frente a la cámara para obtener imágenes de metástasis cerebrales. Utilizando un escáner y un software de análisis de datos, dibuje una región de interés sobre el área de imagen para asegurarse de que todo el órgano de interés está cubierto para permitir la evaluación de la carga metastásica y cuantificar la producción de bioluminiscencia como el flujo total y fotones por segundo.Inmediatamente después de la cuantificación de la señal de bioluminiscencia, cosechar el cerebro y el tejido pulmonar y enjuagar rápidamente los órganos en PBS para eliminar cualquier mancha superficial de sangre. Coloque los órganos en una placa de plástico negro de baja fluorescencia automática y transporte las muestras a un escáner de fluorescencia multiespectral equipado con capacidad de desmezcla espectral para la detección de GFP. Para adquirir imágenes GFP multiespectrales de los órganos extraídos, escanee los órganos de 500 a 720 nanómetros con un tamaño de paso de 10 nanómetros.Para obtener el perfil de fluorescencia automática de tejidos, escanee los órganos extirpados de ratones de control no inyectados. Además, la imagen de los tejidos positivos de GFP, como el tumor primario, para adquirir perfil de GFP mixto de fluorescencia automática. Procesar estos espectros según el protocolo del fabricante para establecer una biblioteca espectral con perfiles de fluorescencia automática y GFP puros.Después de confirmar la precisión de la biblioteca espectral y separar la señal GFP del fondo de fluorescencia automática de tejidos, utilice la misma biblioteca para desmezclar todas las imágenes en el estudio. Para la extracción de ADN después de congelarse, coloque todo el cerebro en un tubo homogeneizador de cinco mililitros que contenga dos mililitros de tampón de lysis de ADN y utilice un homogeneizador establecido en 50 para homogeneizar el tejido. Cuando el tejido se haya homogeneizado por completo, transfiera un mililitro del lisolato a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros libre y aísle el ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.Añadir 500 microlitros de 100% etanol al aislado y mezclar la muestra por inversión. Después de tres minutos a temperatura ambiente, utilice una pipeta para transferir el precipitado de ADN similar a la lana a un nuevo tubo libre de dos mililitros DNAse y RNAse. Deje que la muestra se seque al aire durante un minuto antes de añadir un mililitro de 75% de etanol al tubo e invertir el tubo de tres a seis veces para lavar la muestra.Deseche el etanol después de la última inversión antes de lavar el ADN dos veces más con etanol fresco por lavado como acaba de demostrar. Después del último lavado, seque al aire la muestra durante 10 segundos antes de disolver el ADN en 52 microlitros de hidróxido de sodio milimotora. Transfiera una alícuota de dos microlitros de ADN a un vial de espectrofotómetro y cuantifique la concentración de ADN en la muestra utilizando una relación de absorbancia entre A260 y 280 según la fórmula.Ajuste la concentración de ADN de la muestra a 50 nanogramos por microlitro con hidróxido de sodio de ocho mililitros adicionales y diseñe el par de imprimación específico para la secuencia de GFP verde exógena internamente utilizando un portal web de diseño de imprimación de código abierto para la detección de PCR en tiempo real de la etiqueta GFP y las células metastásicas que han invadido y colonizado los sitios distales del tumor. A continuación, utilice un reactivo PCR rápido en tiempo real y una máquina pcR en tiempo real que admita un protocolo PCR rápido en tiempo real para el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de la muestra. Para la detección de células de cáncer de mama metastásicas en el pulmón, utilice tijeras diseccionadas para abrir la cavidad torácica y corte más allá del corazón y el timo para exponer la tráquea.Inserte una aguja de calibre 22 unida a una jeringa de 10 mililitros que contenga solución de Bouin en la tráquea y presione el émbolo hasta que los pulmones colapsados se hinchen con aproximadamente dos mililitros de la solución. Retire la jeringa y la aguja una vez que los pulmones se hayan inflado y transfiera todo el pulmón a un tubo de 15 mililitros que contenga solución fresca de Bouin. Invierta suavemente el tubo unas cuantas veces antes de dejar el tejido en remojo durante 24 horas a temperatura ambiente.Al día siguiente, enjuague el pulmón con agua y coloque la muestra en un tubo de 70%etanol. Luego usa un microscopio diseccionado para contar el número de manchas blancas metastásicas y nódulos en las superficies de los pulmones. La medición del volumen tumoral por pinza es un método bien establecido para evaluar la eficacia del tratamiento.Para obtener señales comparables entre los grupos de estudio, se debe realizar un estudio de cinética BLI pre-imágenes para determinar el mejor período de tiempo de diagnóstico por imágenes. Debido a la relación señal-fondo superior, todo el cuerpo in vivo BLI es bastante sensible en la detección de señales de metástasis de bajo nivel en comparación con el enfoque GFP. Sin embargo, debido a la naturaleza estable de la molécula GFP, los investigadores tienen tiempo suficiente para procesar la carcasa antes de capturar las señales de la GFP de los órganos diana en estudios de reportero dual.Este ejemplo de la vida real demuestra cómo las mediciones del tamaño del tumor de la pinza pueden distorsionar la interpretación de los datos, ya que este xenoinjerto perdió la mayor parte del contenido viable de células tumorales mientras mantenía su gran masa y forma. La detección molecular por PCR en tiempo real también puede proporcionar evidencia convincente de metástasis cerebral en el modelo ortotópico de cáncer de mama utilizando la secuenciación exógena de ADN GFP, ya que la secuencia de ADN transfectivo GFP no existe naturalmente en humanos o roedores. El lugar de implantación debe estar relacionado fisiológica y anatómicamente con la neoplasia maligna del cáncer.Tanto el gen tumoral como la expresión de proteínas se pueden evaluar en sitios primarios y distales, y las células metastásicas se pueden aislar para una caracterización adicional.

studying-triple-negative-breast-cancer-using-orthotopic-breast-cancer

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

El video muestra la técnica de inoculación ortotópica del cáncer de mama en un modelo de ratón. Esta técnica produce una alta tasa de tumorigénesis con menos variabilidad en el tamaño y la forma del tumor en comparación con la inyección subcutánea o no quirúrgica.

Inyección ortotópica: implantación de células cancerosas específicas de tejido en un ratón adulto

El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Presentamos un modelo de cáncer de mama Murino ortotópico y mastectomía radical modelo con tecnología de bioluminiscencia para cuantificar la carga del tumor para imitar la progresión del cáncer de mama humano.

Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino

Aquí, presentamos un protocolo para implantar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, menos forma invasiva y fácil de manejar, y este modelo Murino ortotópico mama cáncer con un entorno de almohadilla de grasa mamaria adecuada puede utilizarse para investigar diversos aspectos de la cáncer.

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

Los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón genéticamente modificados trasplantables recapitulan fielmente la enfermedad humana y son modelos preferidos para la investigación básica y traslacional del cáncer de mama. Aquí, se describe un método para trasplantar ortotópicamente fragmentos de tumores de mama en la almohadilla de grasa mamaria para estudiar la biología del tumor y evaluar la respuesta al fármaco.

Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.

Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia

El presente protocolo describe la inyección de células de osteosarcoma intratibia para generar modelos de ratón con osteosarcoma ortotópico y lesiones de metástasis pulmonar.

Inyección de células de osteosarcoma intratibial para generar osteosarcoma ortotópico y metástasis pulmonar modelos de ratón

Este protocolo describe un método eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama en ratones. La técnica consiste en la disociación enzimática del tumor seguida de una inyección directa en las almohadillas de grasa mamaria, lo que permite una implantación de alto rendimiento. La validación exhaustiva garantiza la fidelidad del modelo, lo que facilita estudios rigurosos en varios subtipos de cáncer de mama.

Disociación de alto rendimiento e implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama

La identificación de nuevos objetivos farmacológicos que pasan de las pruebas preclínicas a los ensayos en humanos es una prioridad científica. Con ese fin, aquí describimos un enfoque de genómica funcional para examinar el impacto del agotamiento de genes en esferoides de líneas celulares cancerosas, que modelan más adecuadamente los cánceres humanos in vivo.

La utilización de la genómica funcional de selección para identificar dianas farmacológicas potencialmente nueva en la celda cáncer culturas Esferoide

Aprenda a evaluar la carga tumoral mediante detección de GFP e imagen de bioluminiscencia en un modelo ortotópico de cáncer de mama. Este protocolo mejora la precisión en la cuantificación de micrometástasis y la eficacia terapéutica.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

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