Name: Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a evaluar la actividad de NF-kappa-B y AP-1 en macrófagos reporteros cultivados sobre capas de proteínas adsorbidas en superficies poliméricas. Este ensayo enzimático simple permite analizar rápidamente la señalización mediada por receptores Toll-like en biomateriales.

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Los autores agradecen la financiación operativa de Canadian Institutes of Health Research Project (PTJ 162251), el Comité asesor de investigación del Senado de la Universidad de Queen y el apoyo a la infraestructura de la Fundación Canadiense para la Innovación del Fondo de Liderazgo john Evan (Proyecto 34137) y el Fondo de Investigación de Ontario del Ministerio de Investigación e Innovación (Proyecto 34137). L.A.M. fue apoyado por una beca R. Samuel McLaughlin de la Universidad de La Reina, un Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá Canadian Graduate Scholarship's Award y una Beca de Posgrado de Ontario. Los autores quieren agradecer al Dr. Myron Szewczuk por su generoso don de la línea celular de los macrófagos de reportero NF-B/AP-1 y a los doctores Michael Blennerhassett y Sandra Lourenssen por el uso de su sistema de imágenes de gel y lector de placas.

Los autores no tienen nada que revelar.

Un enfoque principal de nuestro laboratorio es la respuesta del huésped a los implantes de tejido blando biomaterial sólido, y en particular cómo el daño celular incurrido durante el procedimiento de implantación afecta la respuesta del huésped. El trabajo presentado aquí describe experimentos preliminares utilizando una línea celular de macrófagos de reportero y un lisato celular que contiene DAMP generado in vitro, para investigar la influencia de las moléculas liberadas durante el daño celular (es decir, de la cirugía...

La reacción del cuerpo extraño (FBR) es una respuesta crónica del huésped que puede afectar negativamente el rendimiento de un material o dispositivo implantado (por ejemplo, dispositivos de administración de medicamentos, biosensores), a través de la liberación persistente de mediadores inflamatorios y al impedir la integración entre el material implantado y el tejido circundante1. Esta respuesta inmune innata se inicia por el procedimiento de implantación y se caracteriza por la presencia a largo plazo de células inmunitarias innatas y la formación de cápsulas fibrosas alrededor del implante1. En el contexto de las respuestas materiales del huésped, las interacciones entre macrófagos y materiales tienen un impacto significativo en la progresión de la respuesta del huésped y el desarrollo de un FBR1. Los macrófagos son una población de células inmunitarias innatas diversas, reclutadas en el sitio del implante, ya sea de poblaciones de macrófagos residentes en tejidos o de la sangre como macrófagos derivados de monocitos. Comienzan a acumularse en el sitio del implante poco después de la implantación, y en cuestión de días se convierten en la población celular predominante en el microambiente del implante. Los macrófagos adherentes a los materiales, junto con las células gigantes de cuerpo extraño (FBGC) formadas a través de la fusión de macrófagos, pueden persistir en la superficie del material durante la vida útil del implante2,3. En consecuencia, los macrófagos se consideran actores clave en la respuesta del cuerpo extraño debido a sus funciones orquestando los pasos característicos de la FBR: respuesta inflamatoria aguda, remodelación tisular y formación de tejido fibroso1.
Los receptores similares a los peajes (TLR) son una familia de receptores de reconocimiento de patrones que son expresados por muchas células inmunitarias, incluyendo macrófagos, y se ha demostrado que juegan un papel importante en la inflamación y la cicatrización de heridas. Además de los ligandos derivados de patógenos, los TLR son capaces de unir moléculas endógenas, conocidas como patrones moleculares asociados al daño (DAPP), que se liberan durante la necrosis celular y activan las vías de señalización inflamatoria que resultan en la producción de citoquinas proinflamatorias4. Nosotros y otros hemos propuesto que el daño incurrido durante los procedimientos de implantación de biomateriales de tejido blando libere a los DAMPs, que luego se adsorbe a las superficies biomateriales además de las proteínas de la sangre y modulalas las interacciones entre células y materiales subsiguientes5,6. Cuando los macrófagos interactúan con la capa de proteína adsorbida en un implante, sus TDR de superficie pueden reconocer los DPR adsorbidas y activar cascadas de señalización proinflamatoria, lo que conduce a la activación del factor de transcripción NF-B y AP-1 y a la producción de citoquinas proinflamatorias. Hemos demostrado anteriormente que los macrófagos murinos han aumentado significativamente la actividad de NF-B/AP-1 y el factor de necrosis tumoral (TNF-- secreción proinflamatoria de citoquinas) en respuesta a las capas de proteína adsorbida que contienen DAMP en una variedad de superficies poliméricas en comparación con superficies con suero o plasma adsorbida solamente (es decir, no hay DAPP presentes), y que esta respuesta está mediada en gran medida por TLR2, mientras que TLR4 desempeña un papel menor5.
La línea celular de macrófagos de reportero NF-B/AP-1utilizadaen este protocolo es un método conveniente para medir la actividad relativa NF--B y AP-1 en macrófagos5,7,8. En combinación con los inhibidores de la vía TLR, esta línea celular es una herramienta útil para investigar la activación de TLR y su papel en la inflamación en respuesta a una variedad de estímulos5,7,8. Las células reporteras son una línea celular modificada similar a un macróforo de ratón que puede producir establemente fosfatasa alcalina embrionaria secreta (SEAP) sobre la activación del factor de transcripción NF-B y AP-19. El ensayo fosfatasa alcalina colorimétrica enzimática(Tabla de materiales) se puede utilizar para cuantificar las cantidades relativas de expresión SEAP como una medida indirecta de la actividad NF-B/AP-1. Como NF-B y AP-1 son aguas abajo de muchas vías de señalización celular, se pueden utilizar anticuerpos e inhibidores neutralizantes dirigidos a TlR específicos (por ejemplo, TLR2) o moléculas de adaptador TLR (por ejemplo, MyD88) para verificar el papel de una vía específica. La metodología descrita en este artículo proporciona un enfoque sencillo y rápido para evaluar la contribución de la señalización TLR en las respuestas de macrófagos murinos a una variedad de superficies poliméricas con capas de proteínas adsorbidas que contienen proteínas de la sangre y DAPP como modelo in vitro de biomateriales implantados.

<table><tbody><tr><td>Reactivos de cultivo celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-ratón/humano CD282 (TLR2)</td><td>Biolegend</td><td>121802</td><td></td></tr><tr><td>CLI-095 (inhibidor de TLR4)</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-CLI95</td><td></td></tr><tr><td>C57 complemento plasma K2 EDTA 10ml, grado innovador Origen estadounidense</td><td>InnovativeResearch</td><td>IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml</td><td>Plasma de ratón</td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)</td><td>Fisher Scientific 14190250</td><td></td><td>Sin calcio, sin magnesio</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS), grado de investigación</td><td>Wisent</td><td>98150</td><td></td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-EKLPS</td><td>Lipopolisacárido de Escherichia coli K12</td></tr><tr><td>NIH/3T3 fibroblastos</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Pam3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>Lipopéptido triacilado sintético - ligando TLR1/2</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocina</td><td>Invivogen</td><td>ANT-MPP</td><td>Reactivo de eliminación de micoplasmas</td></tr><tr><td>RAW-Células azules</td><td>Invivogen</td><td>raw-sp</td><td>NF-&kappa; Línea celular de macrófagos reporteros B/AP-1</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0,4 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Enzima expresa TrypLE (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>enzima de disociación celular recombinante libre de origen animal</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td>ANT-ZN-1</td><td></td></tr><tr><td>Kits y ensayos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas prerrevestidas de ELISA, placa prerrevestida de ratón IL-6</td><td>Biolegend</td><td>B213022</td><td></td></tr><tr><td>ELISA, TNF-y alfa de ratón;</td><td>Biolegend</td><td>B220233</td><td></td></tr><tr><td>Endotoxina (Escherichia coli) - Endotoxina estándar de control (CSE)</td><td>Asociados de Cape Cope Inc.</td><td>E0005-5</td><td>Endotoxina para curva estándar en ensayo de endotoxinas cromogénicas</td></tr><tr><td>Agua LAL, 100 mL</td><td>Associates of Cape Cope Inc.</td><td>WP1001</td><td>Utilizado con ensayo de endotoxinas cromogénicas</td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas Micro BCA</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23235</td><td></td></tr><tr><td>Limulus amebocyto lisado (LAL) Kit de prueba de endotoxinas</td><td>pirocromáticas Associates of Cape Cope Inc.</td><td>C1500-5</td><td>Reactivo de ensayo de endotoxinas cromogénicas</td></tr><tr><td>Medio de detección de fosfatasa alcalina QUANTI-Blue Ensayo de fosfatasa</td> alcalina <td>Rep-qb2</td><td>Invivogen</td> para <td>medir indirectamente NF-&kappa; B/AP-1 actividad</td></tr><tr><td>Reactivos de recubrimiento polimérico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform, anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico anhidro</td><td>Alcoholes comerciales</td><td>P006EAAN</td><td>Sigma: Alcohol reactivo, anhidro, 676829-1L</td></tr><tr><td>Pinzas rectas de punta fina cónica Fisher</td><td>Scientific</td><td>16-100-113</td><td></td></tr><tr><td>Disolvente fluorado FC-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9755-100ML</td><td>Disolvente fluorado para fPTFE</td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular (libre de endotoxinas)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> SH30529LS <td></td></tr><tr><td>Poli(metacrilato de metilo) (PMMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>182230-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit de elastómero</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 50822180 <td></td></tr><tr><td>Teflón-AF (fPTFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>469610-1G</td><td>Poly[4,5-difluoro-2,2-bis(trifluorometil)-1,3-dioxole-co-tetrafluoroetileno]</td></tr><tr><td>Consumibles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juntas de placas adhesivas</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Microtubos Axygen, 1,5</td><td>mL Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo de vidrio de borosilicato, con tapas de polipropileno blanco</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Placa transparente PS de 48 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-52</td><td></td></tr><tr><td>Placa transparente TCPS de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>Placa transparente TCPS de 48 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1C</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos, círculos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81</td><td></td></tr><tr><td>Matraces tratados para cultivo de tejidos Falcon, T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-10</td><td></td></tr><tr><td>sticky-Slide 8 Well</td><td>Ibidi</td><td>80828</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Matraces tratados para cultivo de tejidos, T150</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-48</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización nf-kb/ap-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas

A Macrophage Reporter Cell Assay to Examine Toll-Like Receptor-Mediated NF-kB/AP-1 Signaling on Adsorbed Protein Layers on Polymeric Surfaces

La persistente respuesta inflamatoria del huésped a un biomaterial implantado, conocido como reacción del cuerpo extraño, es un desafío significativo en el desarrollo e implementación de dispositivos biomédicos y construcciones de ingeniería de tejidos. Los macrófagos, una célula inmune innata, son actores clave en la reacción del cuerpo extraño porque permanecen en el sitio del implante durante la vida útil del dispositivo, y se estudian comúnmente para obtener una comprensión de esta respuesta perjudicial del huésped. Muchos investigadores de biomateriales han demostrado que las capas de proteínas adsorbidas en materiales implantados influyen en el comportamiento de los macrófagos y, posteriormente, afectan la respuesta del huésped. Los métodos de este artículo describen un modelo in vitro utilizando capas de proteínas adsorbidas que contienen moléculas de daño celular en superficies de biomaterial espolimérico para evaluar las respuestas de los macrófagos. Se utilizaron como método rápido para examinar indirectamente la actividad del factor de transcripción NF-B/AP-1 en respuesta a complejas capas de proteínas absorbentes que contienen proteínas sanguíneas y patrones moleculares asociados al daño, como modelo de las complejas capas de proteínas adsorbidas formadas en superficies biomateriales in vivo.

Se probaron métodos de limpieza para las superficies recubiertas de polímero para garantizar que no hubiera interrupción del recubrimiento, lo que se vería como un cambio en el ángulo de contacto del agua a un revestimiento de vidrio sin recubrimiento(Figura 2). Se encontró que el remojo de los portaobjetos recubiertos con PMMA en etanol 70% durante 1 h elimina el recubrimiento de PMMA(Figura 2, panel izquierdo), probablemente debido a la solubilidad de PMMA en ...

Este protocolo proporciona a los investigadores un método rápido e indirecto para medir la actividad del factor de transcripción NF--B/AP-1 dependiente de TLR en una línea celular de macrófagomur en respuesta a una variedad de superficies poliméricas y capas de proteínas adsorbidas que modelan el microambiente de implantes de biomaterial.

Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas

The persistent inflammatory host response to an implanted biomaterial, known as the foreign body reaction, is a significant challenge in the development ...

Este protocolo permite la evaluación rápida de la actividad NF-kappa-B y AP-1 en macrófagos reporteros cultivados en capas de proteínas adsorbidas y la contribución de vías de señalización celular, como receptores similares a peajes, a esa respuesta. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad, permitiendo que los sobrenadantes de cultivo celular sean analizados rápidamente para la actividad NF-kappa-B y AP-1 utilizando un ensayo enzimático sencillo. Comience disolviendo PMMA en cloroformo a una concentración final de 20 miligramos por mililitro en un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros en una campana de humo.Coloque una barra de agitación magnética en el vial y revuelva la mezcla durante al menos dos horas. Cuando todos los sólidos se hayan disuelto, transfiera 400 microlitros de la solución PMMA al centro de cada diapositiva de microscopio de vidrio borosilicato por condición planificada en una recubridora de centrifugado, y gire el PMMA a la diapositiva durante dos minutos a 3.000 rotaciones por minuto. A continuación, guarde los portaobjetos recubiertos de espín en una caja limpia pulverizada con 70% de etanol.A continuación, en un gabinete de seguridad biol

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El ensayo sialidasa es un enfoque simple técnica que dilucidar nuevo mecanismo molecular (s) de los sensores de TLR de las infecciones microbianas y la participación en las enfermedades inflamatorias a nivel del receptor en la superficie celular de los macrófagos en vivo.

Detección de actividad sialidasa Neu1 en la regulación de Toll-like receptor de activación

Fuente: Barbero, A. M., et.al. Ensayos de fluorescencia para el estudio de la interacción de Mycobacterium tuberculosis con el receptor inmunitario SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Este vídeo muestra un ensayo basado en fluorescencia para estudiar la interacción entre un receptor de macrófagos y antígenos de Mycobacterium tuberculosis . Los antígenos marcados con fluorescencia en un abrigo se incuban con extractos de proteínas de macrófagos, se reticulan, se marcan con anticuerpos y se visualizan...

Ensayo basado en fluorescencia para investigar las interacciones de los receptores de macrófagos con antígenos bacterianos

Este video muestra un ensayo para examinar la actividad dependiente del receptor tipo Toll (TLR) de los factores de transcripción factor nuclear kappa-B (NF-κB) y proteína activadora-1 (AP-1) en macrófagos. Los TLRs desencadenan una cascada de señalización proinflamatoria al reconocer los patrones moleculares asociados al daño (DAMPs), activando NF-κB y AP-1. Los macrófagos reporteros modificados producen la enzima fosfatasa alcalina embrionaria (SEAP) secretada tras la activación de NF-κB y...

Un ensayo para la señalización del factor de transcripción NF-&kcy;B/AP-1 dependiente de TLR en macrófagos

Este video muestra un ensayo basado en células reporteras para la detección de posibles nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización del receptor tipo Toll (TLR). El ensayo consiste en introducir lipopolisacáridos (LPS) mezclados con híbridos de nanopartículas de péptido y oro a macrófagos reporteros que expresan las proteínas reporteras: fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) y luciferasa. La reducción de la señal TLR inducida por LPS mediada por los híbridos se determina...

Un ensayo para examinar nanopartículas bioactivas para la inhibición de la señalización de receptores tipo Toll

Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β.

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

La señalización de receptores de tipo Toll-like (TLR) juega un papel importante en la fisiopatología de muchas enfermedades inflamatorias humanas y se anticipa que la regulación de las respuestas de TLR por nanopartículas bioactivas es beneficiosa en muchas afecciones inflamatorias. Las células informadoras basadas en células THP-1 proporcionan una plataforma de cribado versátil y robusta para identificar nuevos inhibidores de la señalización de TLR.

Proyección de nanopartículas bioactivas en células inmunológicas fagocíticas para inhibidores de la señalización de receptores de tipo Toll

Aprende a evaluar la actividad de NF-kappa-B y AP-1 en macrófagos reporteros cultivados sobre capas de proteínas adsorbidas en superficies poliméricas. Este ensayo enzimático simple permite analizar rápidamente la señalización mediada por receptores Toll-like en biomateriales.

Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas (Video) | JoVE Journal

Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas

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