Name: Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprende a aislar microglia de regiones cerebrales en ratón adulto mediante FACS para secuenciación de ARN de célula única. Este método revela la heterogeneidad molecular de microglia en condiciones de salud y enfermedad.

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Agradecemos a Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno y Spyros Darmanis por su ayuda durante el desarrollo de este protocolo. También agradecemos el Stanford Shared FACS Facility, particularmente Meredith Weglarz y Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein y Nucleic Acid Facility (PAN) por su gran apoyo al rodaje. Este trabajo está financiado por la Fundación JPB y la Fundación Vincent J. Coates.

Todos los procedimientos que involucran roedores se ajustan a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplen con las leyes y políticas nacionales y estatales. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Panel Administrativo de La Universidad de Stanford sobre Cuidado de Animales de Laboratorio.
NOTA: Todas las composiciones de solución y tampón se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Preparación en el Día del Aislamiento Celular
<ol><li>Preparar los siguientes reactivos y enfriarlos en hielo: medio A (50 ml), tampón de clasificación de células activada sormicas magnéticamente (MCS) (30 ml), tampón FACS (25 ml), solución salina con fosfato (PBS; 30 ml), DNase (320 l) e inhibidor de la rnasa (30 l). NOTA: Los volúmenes proporcionados aquí son suficientes para aislar la microglia de 4 regiones cerebrales (por ejemplo, corteza, cerebelo, hipocampo y estriado) de un solo hemisferio cerebral de ratón. Escalar verticalmente si se utilizan más tejidos.</li>
	<li>Colocar cuatro homogeneizadores de Dounce limpios de 2 ml sobre hielo y añadir 2 ml de medio A con 80 ml de DNase (12.500 unidades/ml) y 5 ml de inhibidor de la rnalosa en cada homogeneizador Dounce. Enfríe los pistones en tubos de 15 ml.</li>
	<li>Etiquetar cuatro platos Petri de 6 cm con regiones cerebrales para la recolección de tejidos y añadir 200 ml de medio frío A en cada plato sobre hielo. Añadir unos 5 ml de medio A en una placa Petri de 6 cm para la disección. NOTA: Antes de su uso, asegúrese de que todos los reactivos sean estériles y adecuados para aplicaciones de ARN. Las herramientas de banco y disección deben limpiarse y rociarse con la solución de descontaminación RNase(Tabla de materiales).</li>
</ol>2. Disección de la región cerebral
NOTA: Este paso debe tomar 30 min.
<ol><li>Inyectar 400 a 500 l de ketamina/xilazina (24 mg/ml de ketamina y 2,4 mg/ml de xilazina) en el peritoneo de un ratón de etapa de menor a adulto (>1 mes de edad). NOTA: Un ratón macho se utiliza aquí para la ilustración, pero cualquiera de los dos géneros es adecuado.</li>
	<li>Espere 5 minutos y pellizca una pata trasera para asegurar la falta de retracción.</li>
	<li>Utilice inmediatamente una aguja de 26 G x 3/8 para realizar perfusión transcardial con 20 a 30 ml de PBS helado hasta que el tampón se agote sin sangre visible.</li>
	<li>Decapita el ratón con un par de tijeras quirúrgicas. Usa tijeras pequeñas para abrir la piel para exponer el cráneo debajo, y luego corta a través de la sutura sagital, sutura lambdoidal y sutura coronal. Use fórceps para extraer ambos lados del hueso parietal y el hueso interparietal sin dañar el tejido, y mueva cuidadosamente el cerebro a la disección Petri plato con medio A.</li>
	<li>Usa una hoja preenfriada para cortar el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios. NOTA: Las cuatro regiones cerebrales descritas aquí desde un solo hemisferio producen un número suficiente de microglia para aplicaciones de ARN-seq de una sola célula o a granel. El otro hemisferio se puede utilizar para inmunohistoquímica o validación in situ de ARN.</li>
	<li>Separe el cerebelo del lóbulo cortical y el tallo cerebral con #55 fórceps y transfiera el tejido a una placa Petri de colección.</li>
	<li>Use #55 fórceps para diseccionar cuidadosamente el hipocampo y el estriado de la corteza y transferir cada tejido a una placa Petri de colección.</li>
</ol>3. Disociación mecánica de tejidos
NOTA: Mantenga las células y los reactivos frescos todo el tiempo, excepto durante los pasos de tinción. Este paso debe tomar 30 min.
<ol><li>Pica cada tejido cerebral con una cuchilla de afeitar en <1 mm3 piezas finas.</li>
	<li>Utilice una pipeta de 1 ml (con las puntas cortadas) para transferir piezas de tejido a los homogeneizadores Dounce pre-enfriados, cada uno de los cuales contiene 2 ml de medio A con DNase e inhibidor de la RNase.</li>
	<li>Homogeneizar el tejido girando lentamente el pistón dentro y fuera del homogeneizador Dounce para 6 x 10 trazos completos, hasta que no haya trozos visibles presentes. NOTA: Douncing mata las neuronas y la mayoría de las otras células gliales, pero deja las células microgliales bastante intactas. Tanto la insuficiencia como el exceso de douncción pueden conducir a un bajo rendimiento de las células.</li>
	<li>Transfiera los tejidos disociados a tubos de 50 ml a través de coladores de 70 m.</li>
	<li>Enjuague cada homogeneizador y pistón Dounce con un total de 6 ml de medio frío A y filtre la solución de enjuague a través del mismo colador en el tubo correspondiente.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones de una sola célula (alrededor de 8 ml cada una) en tubos cónicos de 15 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC con freno 5.</li>
</ol>4. Eliminación de mielina
NOTA: Este paso debe tomar 60 min.
<ol><li>Preparar 1 columna de agotamiento grande (LD) (para corteza) y 3 columnas de selección grande (LS) (para las otras 3 regiones) en un separador magnético(Tabla de materiales). Enjuague cada columna con 3 ml de búfer MCS.</li>
	<li>Una vez finalizada la centrifugación, descarte y deseche el sobrenadante sin molestar el pellet. Para los tejidos de corteza y cerebelo, resuspendan las células en 850 ml de tampón de MCS con 1,8 ml de inhibidor de la RNase. Para los tejidos del hipocampo y del estriado, resuspenda las células en 400 ml de tampón de MCS con 0,9 ml de inhibidor de la RNase. NOTA: Las columnas (LD vs LS) y el volumen utilizado para la resuspensión se optimizan en función de la cantidad de mielina presente en el tejido. Si se ensayan otras regiones cerebrales, estas condiciones pueden necesitar ser ajustadas dependiendo del tamaño del tejido y la cantidad de mielina puede existir. Eficacia de la eliminación de mielina se puede estimar en el paso 4.9.</li>
	<li>Añadir 100 s l de cuentas de eliminación de mielina cada una en las células de la corteza y el cerebelo y añadir 50 s de cuentas de eliminación de mielina cada una en las células del hipocampo y el estriado.</li>
	<li>Mezclar suavemente las células con cuentas e incubar los tubos sobre hielo durante 10 min.</li>
	<li>Lleve el volumen del tubo con células corticales a 2 ml con tampón MCS, y todos los demás a 1 ml (es decir, agregue 1 ml para las células corticales; 500 l para las células hipocampales y estriales; no hay necesidad de agregar tampón a las células cerebelosas).</li>
	<li>Una vez que las columnas estén vacías de tampón de enrteo, coloque un tubo de 15 ml debajo de cada columna. Cargue las células corticales (2 mL) en la columna LD, y todas las demás (1 mL cada una) en las columnas LS. Utilice inmediatamente 1 ml de búfer MCS cada uno para lavar los tubos originales y cargar la solución en las columnas correspondientes.</li>
	<li>Lave la columna LD una vez con 1 mL del buffer MCS y lave cada columna LS dos veces con 1 mL del buffer MCS cada lavado. Continúe recogiendo la solución de flujo a través durante el lavado.</li>
	<li>Filtre las células en tubos FACS de fondo redondo a través de tapas de colador de 35 m. NOTA: Cada tubo debe recoger unos 4 ml de suspensión de una sola célula agotada de mielina.</li>
	<li>Opcionalmente, tome 10 s de la suspensión celular y mezcle con 10 sL de solución azul trypan al 0,4%. Examine las células bajo un microscopio de campo brillante 10x para estimar el rendimiento, la tasa de supervivencia y el nivel de mielina residual. NOTA: Una preparación exitosa debe generar más del 90% de células vivas (redondas en forma y excluyendo el tinte azul) con poco o ningún residuo de mielina.</li>
	<li>Células de pelet en los tubos FACS a 400 x g durante 5 min a 4oC, con freno a 5. Vierta lentamente el sobrenadante y aterve el borde del tubo en papel tisú. Resuspenda las células de cada tubo con 300 ml de tampón FACS. NOTA: Si se prefiere la clasificación MCS, se pueden utilizar perlas CD11b para seleccionar microglia y otras células mieloides después de la eliminación de mielina. Estas células se pueden utilizar para scRNA-seq no a base de placas, así como ARN-seq a granel. La advertencia de este enfoque alternativo es que las cuentas CD11b no separan la microglia de otras células inmunitarias relacionadas que también son positivas para este antígeno.</li>
</ol>5. Tinción para clasificación celular activada por fluorescencia
NOTA: Este paso debe tomar 40 min.
<ol><li>Añadir 5 l de reactivo de bloque de receptores Fc de ratón(Tabla de materiales)en cada tubo. Incubar durante 5 minutos sobre hielo.</li>
	<li>Añadir 1 l de CD45-PE-Cy7 y 1 l de CD11b-BV421 en cada tubo. NOTA: Se pueden utilizar anticuerpos con otros fluoróforos conjugados. También se pueden incluir anticuerpos contra TMEM119, un marcador específico para la microglia homeostática9,pero se recomienda utilizar junto con CD45 y CD11b, ya que ciertas subpoblaciones de microglia pueden perder la expresión superficial TMEM119.</li>
	<li>Incubar los tubos en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Agregue 2 mL de tampón FACS para lavar.</li>
	<li>Células de pelet a 4 oC, 400 x g durante 5 min. Vierta lentamente el sobrenadante y vierta el borde del tubo en papel tisú. Resuspender las células en cada tubo utilizando 400 ml de tampón de FACS con 1 l de inhibidor de la RNase y 0,5 ml de yoduro de propidio (PI, 1:1.000 dilución).</li>
</ol>6. Clasificación de FACS de índice
NOTA: Este paso debe tomar 1 h.
<ol><li>Siguiendo el procedimiento FACS estándar, dibuje compuertas basadas en dispersión (excluyendo desechos), celdas individuales, células vivas (PI negativo), células microglia y células mieloides (CD45+, CD11b+). NOTA: Las células microgliales típicas expresan CD45 a niveles más bajos en comparación con otros macrófagos asociados a los fronteras, como los macrófagos perivasculares y meningeales, y por lo tanto la medición de CD45 bajo CD11b+ debería ser suficiente si el enfoque de la investigación son los perfiles de expresión génica en estas microglia clásicas1,2. Sin embargo, ciertos subconjuntos de microglia pueden tener una expresión CD45 más alta y esto es particularmente cierto durante el desarrollo o en condiciones de enfermedad. Para garantizar un análisis imparcial de la expresión génica microglial, se pueden registrar inmunofenotipos altos cd45 y CD45 bajos a través de la clasificación de índices y ambas poblaciones recopiladas para la secuenciación y el análisis posterior. Además, la expresión superficial TMEM119 puede utilizarse para dirigirse a la población microglial homeostática (véase el paso 5.2) y analizarse junto con los niveles de CD45 y los resultados de la secuenciación.</li>
	<li>Ordenar una sola microglia (con una boquilla de 100 m) en placas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 96 pocillos, que contengan 4 ml de tampón de lisis cada pocil (consulte el protocolo publicado14 para obtener más información). NOTA: El mix de espiga de ARN del Consorcio de Control de ARN Externo (ERCC)(Tabla de Materiales) se puede añadir a 1:2.4 x 107 en el tampón de lisis para fines de control de calidad y normalización2.</li>
	<li>Reórtca brevemente las placas y gire hacia abajo usando una centrífuga de sobremesa.</li>
	<li>Congele inmediatamente las muestras en hielo seco. Conservar las placas a -80oC hasta la preparación de la biblioteca. NOTA: Alternativamente, se pueden recolectar más células en tubos de 1,5 ml con tampón de extracción de ARN para ARN-seq a granel. Según la experiencia de los autores, 3.000 celdas son suficientes para generar bibliotecas de buena calidad siguiendo el protocolo publicado2,14.</li>
</ol>7. Preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN de una sola célula
NOTA: Aquí, el protocolo publicado14 se sigue para generar bibliotecas scRNA-seq con la ayuda de la robótica de manipulación de líquidos y algunas modificaciones. En este artículo, el procedimiento solo se describe brevemente y se resaltan las diferencias. El procesamiento de 4 placas simultáneamente toma alrededor de 2,5 días.
<ol><li>Descongelar las placas sobre hielo y realizar la transcripción inversa con imprimación Oligo-dT30VN (en el tampón de lisis) para generar ADNc cDNA con ciclodores térmicos(Tabla 1): 42 oC 90 min; 70 oC 5 min; 4 oC de espera. A continuación, amplifique el ADNc con un paso adicional de digestión exonucleasina al principio(Tabla 2) utilizando la mezcla maestra de PCR y las imprimaciones de PCR in situ (ISPCR)(Tabla de materiales)y la siguiente condición de PCR: 37 oC 30 min; 95 oC 3 min; 23 ciclos de 98 oC 20 s, 67 oC 15 s, 72 oC 4 min; 72oC 5 min.</li>
	<li>Purificar el ADNC usando 18 s de perlas magnéticas por pozo (relación 0.7:1). Incubar la placa en un soporte magnético durante 5 minutos y lavar las muestras dos veces con etanol recién hecho 80%, 80 ol por pocal cada vez. Después de secar la placa durante 15-20 min, eluda elAD con 20 s de tampón de elución por pocal. NOTA: Para el control de calidad, utilice un analizador de fragmentos (análisis de fragmentos de secuenciación de próxima generación de alta sensibilidad [NGS], 1 a 6.000 bp) para comprobar las distribuciones de tamaño y las concentraciones de ADNc, y solo otras muestras de proceso con un frotis entre 500 a 5.000 bp y superior a 0,05 ng/L.</li>
	<li>Para generar bibliotecas, mezcle 0,4 ml de cada muestra de ADNc con 1,2 l de reactivos de etiquetado Tn5 a partir del kit de preparación de la biblioteca(Tabla de materiales)en una placa de 384 pocillos con la ayuda de una máquina de pipeteo de nanolitros, a 55 oC 10 min. NOTA: Aquí, se añade 1/12.5 del volumen de reacción sugerido (muestra de 5 l y 15 l de reactivos de etiquetado) con el fin de reducir el costo y mientras tanto aumentar el rendimiento. Una máquina de pipeteo de nanolitros(Tabla de materiales)se utiliza para transferir reactivos (este y los siguientes pasos) desde y hacia 384 placas de pozos.</li>
	<li>Añadir 0,4 l de búfer de neutralización para detener la reacción de etiquetación en RT durante 5 min.</li>
	<li>Añadir 384 índices(Tabla de Materiales, 0,4 l hacia delante y 0,4 l hacia atrás), 1,2 ml de mezcla de PCR a muestras (2 l cada una) y amplificar las bibliotecas utilizando la siguiente condición: 72 oC 3 min; 95 oC 30 s; 10 ciclos de 95 oC 10 s, 55 oC 30 s, 72 oC 1 min; 72oC 5 min.</li>
	<li>Agrupe todas las bibliotecas individuales (tome 1 l cada una) de la misma placa de 384 pocillos, y utilice cuentas magnéticas(Tabla de materiales,proporción 0.7:1) para purificar las bibliotecas agrupadas finales.</li>
	<li>Utilice un fluorómetro(Tabla de materiales)para medir las concentraciones y un bioanalizador(Tabla de materiales)para examinar las distribuciones de tamaño de las bibliotecas agrupadas antes de la secuenciación. Apunte a la profundidad de secuenciación en 1 millón de lecturas sin procesar por celda.</li>
	<li>Siga los procedimientos bioinformáticos estándar para filtrar y recortar las lecturas de secuenciación y realizar la alineación2. Utilice la tabla de recuento y los metadatos como entradas para realizar el análisis de agrupación en clústeres con el paquete Seurat15.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Microglia interactúa activamente con otros tipos de células en el SNC, y son muy sensibles a los estímulos ambientales. Con el fin de minimizar las respuestas inflamatorias y los cambios aberrantes en su expresión génica durante el proceso de aislamiento, este protocolo se ha simplificado a partir de un método publicado previamente9,y ahora es adecuado aislar la microglia de múltiples regiones de un solo hemisferio cerebral de ratón en paralelo. Los tejidos y reactivos se mantienen a temperatura f...

Microglia, que representa el 5% al 10% de todas las células neuronales, son macrófagos residentes dispersos por todo el sistema nervioso central (SNC)1. Protegida detrás de la barrera hematoencefálica, la microglia típica en un cerebro adulto sano contiene muchos procesos finos que se extienden y se retraen rápidamente para interactuar con las neuronas y otras células gliales en el parénquima. Microglia también puede adoptar la morfología amoeboides asociada con el aumento de la función fagocítica durante etapas específicas del desarrollo o ante los desafíos inmunológicos en lesiones y enfermedades1,2,3,4. Descubrimientos emocionantes recientes han demostrado claramente que la microglia no son de ninguna manera transeúntes pasivos a señales derivadas del cerebro o patológicas, pero desempeñan un papel fundamental en el control del desarrollo cerebral y la homeostasis, por ejemplo, apoyando la supervivencia neuronal, podando sysese inmaduros, promoviendo la diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos, así como la angiogénesis1. A medida que se aclaran más funciones de la microglia, la excitación se alimenta aún más de estudios de genética humana, que mostraron que muchos genes de riesgo de enfermedades neurodegenerativas, como TREM2, se expresan predominante o exclusivamente por microglia5,6,7. Dada su importancia en el desarrollo y los roles plausibles de conducción de enfermedades, recientemente se ha hecho un enorme esfuerzo para nuestra comprensión de la regulación y función de los genes microgliales con la esperanza de encontrar nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades neurodegenerativas1,8.
La secuenciación de ARN (RNA-seq) permite la caracterización imparcial de la expresión génica específica del tipo de célula, que a su vez guía a los científicos para investigar las funciones genéticas en redes celulares densas7. ARN-seq se había hecho principalmente en muestras a granel, lo que llevó al descubrimiento de una firma de genes microgliales homeostáticos que las distingue de otras células neuronales e inmunitarias9. Sin embargo, este enfoque podría pasar por alto las diferencias moleculares y funcionales entre la microglia, especialmente las presentes transitoriamente en el desarrollo, o asociadas con el envejecimiento y la enfermedad. De hecho, el ARN-seq de una sola célula (scRNA-seq) ofrece la sensibilidad y la resolución que han revolucionado el campo al revelar la heterogeneidad previamente poco apreciada de la microglia en una variedad de contextos2,3,10. Además, debido a la presencia de otras células inmunitarias similares en la interfaz de circulación del SNC, scRNA-seq proporciona información que ayuda al diseño de nuevas herramientas para separar y diseccionar funcionalmente estas células relacionadas con poco conocimiento previo2,11.
Se ha inventado una amplia gama de plataformas scRNA-seq, cada una adecuada para ciertas aplicaciones12. En general, los métodos basados en gotas, como 10x Genomics, son mayores en rendimiento con (decenas de) miles de celdas secuenciadas en cada ejecución, y son menos selectivos para la entrada que puede contener poblaciones de células mixtas que requieren una categorización amplia. Los métodos basados en placas proporcionan una mayor sensibilidad y profundidad de lectura13,14, por lo general dirigidos a poblaciones específicas de la clasificación celular para revelar diferencias sutiles o transcripciones raras. Dado el pequeño porcentaje de células microglia, en particular las subpoblaciones asociadas al desarrollo o a la enfermedad, entre todos los tipos de células del SNC, a menudo es deseable aislar la microglia de una región específica de interés y obtener información transcriptomica profunda y completa para comprender su heterogeneidad.
Aquí, proporcionamos detalles sobre cómo aislar la microglia de diferentes regiones cerebrales de ratón diseccionadas de un solo hemisferio, que se utilizan para ARN-seq de una sola célula (o a granel) siguiendo un procedimiento de preparación de biblioteca ssemi-automatizado basado en placas. El otro hemisferio se puede utilizar para la validación histológica. Simplificado a partir de un método publicado anteriormente9, este protocolo de aislamiento tiene como objetivo maximizar el rendimiento de una pequeña cantidad de materiales de partida, y mientras tanto mantener perfiles de expresión génica microglial endógenos. Utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer la microglia (u otras células inmunitarias relacionadas de interés) en placas de 96 pocillos y miniaturizar los volúmenes de reactivos para la preparación de la biblioteca con el fin de aumentar el rendimiento. Destacamos esta plataforma sensible scRNA-seq, aunque se pueden aplicar otras estrategias basadas en placas. Este método se puede adaptar fácilmente para aislar la microglia de otros tejidos diseccionados, como lesiones o focos de enfermedad, y la edad del ratón puede variar en casi cualquier etapa postnatal. El aislamiento eficiente de la microglia regional para estudios de transcriptomica de una sola célula facilitará una mejor comprensión de sus funciones en salud y enfermedades.

<table><tbody><tr><td>5 M Betaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B0300-5VL</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>mix Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R0192</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15575020</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks' Solución salina equilibrada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix</td><td>Kapa Biosciences</td><td>Cat# KK2602</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de poliestireno de fondo redondo, con tapa de filtro de celdas</td><td>Corning</td><td>Cat# 352235</td><td></td></tr><tr><td>AATI, kit de análisis de fragmentos NGS de alta sensibilidad (1 bp &ndash; 6.000 pb)</td><td>Analítica Avanzada</td><td>Cat# DNF-474-1000</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A8806</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Worthington</td><td>Cat# LS002007</td><td>Solución de trabajo: 12500 unidades/ml</td></tr><tr><td>DTT, Grado Molecular</td><td>Promega</td><td>Cat# P1171</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA Spike-In Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 índices)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2001</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 índices)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2002</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 índices)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2003</td><td></td></tr><tr><td>Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 índices)</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-2004</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Exonucleasa (5 U/&mu; l)</td><td>New England BioLabs</td><td>Cat# M0262S</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Fc bloque</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat# 553142</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas de eliminación de mielina</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>Cat# 130-096-433</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Kit de preparación de muestras de ADN</td><td>Illumina</td><td>Cat# FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 ciclos)</td><td>Illumina</td><td>Cat# 20024907</td><td></td></tr><tr><td>PBS ( 10X), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Cat# 70011044</td><td></td></tr><tr><td>PCRClean DX perlas</td><td>Aline Biosciences</td><td>Cat# C-1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P3566</td><td>Tinción: 1:1000</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Thermal Fisher Scientific</td><td>Cat# Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Rata monoclonal anti ratón/humano CD11b, Violeta Brillante 421 (clon M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>Gato# 101236; RRID: AB_11203704</td><td>Tinción: 1:300</td></tr><tr><td>Rata monoclonal anti ratón CD45, PE/Cy7 (clon 30-F11)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625</td><td>Tinción:</td></tr><tr><td>Inhibidor de RNasa recombinante</td> 1:300 <td>Takara Bio</td><td>Cat# 2313B</td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Transcriptasa inversa (100 U/&mu; l)</td> <td>Clontech</td><td>Cat # 639538</td><td>Contiene 5x tampón</td></tr> <tr><td>>de primera cadena<Oligonucleótidos fuertes< / fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1 &mu; M ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>Oligo-dT30VN cebador: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3'</td><td></td><td></td><td>(Picelli et al., 2014)</td></tr><tr><td>TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" es para ribobases y "+" es para una base LNA)</td>(Picelli et al.,<td></td><td></td><td> 2014)</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS</td><td></td><td></td><td>Receta: 1% FBS filtrado estérilmente, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES en 1X tampón</td></tr><tr><td></td><td></td><td>PBS MCS</td><td>Receta: 0,5% BSA filtrado estérilmente, 2 mM EDTA en 1X PBS</td></tr><tr><td>Medium A</td><td></td><td></td><td>Receta: 15 mM HEPES, 0,5% de glucosa en 1X HBSS sin fenol rojo</td></tr><tr><td><fuerte>Placas</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microplacas de PCR Rigi-Plate de 384 pocillos, Axygen Scientific</td><td>VWR</td><td>89005-556</td><td></td></tr><tr><td>Placas de PCR rígidas de 96 pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Others</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pinzas Dumont #55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de onzas, 2 ml</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td>357422</tr><tr><td>Columna de agotamiento</td><td>grande Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Columna de selección grande</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separador QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>RNAzap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Colador (70 &mu; m)</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_cell_sorter_brochure.pdf" target="_blank">http://www.bdbiosciences.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de fragmentos</td><td>Agilent</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Mosquito HTS robot de pipeteo de nanolitros</td><td>TTP Labtech</td><td><a href="https://www.ttplabtech.com/products/liquid-handling/mosquito-hts/" target="_blank">https://www.ttplabtech.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33226</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del arn de una sola célula

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

Como macrófagos residentes en el sistema nervioso central, la microglia controla activamente el desarrollo cerebral y la homeostasis, y sus disfunciones pueden impulsar enfermedades humanas. Se han realizado avances considerables para descubrir las firmas moleculares de la microglia homeostática, así como las alteraciones de su expresión génica en respuesta a los estímulos ambientales. Con el advenimiento y la maduración de metodologías genómicas de una sola célula, se reconoce cada vez más que la microglia heterogénea puede subyacen a las diversas funciones que desempeñan en diferentes condiciones de desarrollo y patológicas. La disección adicional de dicha heterogeneidad puede lograrse mediante el aislamiento eficiente de la microglia de una región determinada de interés, seguido de perfiles sensibles de células individuales. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento rápido de la microglia de diferentes regiones cerebrales en un solo hemisferio cerebral de ratón adulto. También demostramos cómo utilizar estas microglia ordenadas para la secuenciación de ARN de una sola célula profunda a base de placas. Discutimos la adaptabilidad de este método a otros escenarios y proporcionamos directrices para mejorar el sistema para adaptarse a estudios a gran escala.

Este protocolo describe un método para aislar y clasificar la microglia de diferentes regiones cerebrales en un hemisferio cerebral perfundido adulto, seguido de scRNA-seq. Utilizamos la douncing para crear una suspensión de una sola célula y también como un primer paso para enriquecer la microglia. Insuficiente o excesivamente douncing reduce el rendimiento. Además, los cerebros adultos del ratón contienen altos niveles de mielina, que también pueden reducir la eficiencia de clasificación y el rendimiento si no se elimi...

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Este método permite la captura imparcial de la expresión génica de microglia a un nivel de una sola célula, lo que puede ayudar a dilucidar la heterogeneidad molecular de la microglia en un cerebro sano y enfermo. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un procedimiento detallado para el aislamiento rápido de la microglia de diferentes regiones cerebrales y muestra cómo generar eficientemente la base de juego de las bibliotecas RA6 de una sola célula para la secuenciación profunda. Para comenzar este procedimiento, prepare todos los búferes y soluciones necesarios como se describe en el protocolo de texto y enfríelos en hielo.Después de eutanasiar y decapitar al ratón, usa tijeras pequeñas para abrir la piel de la cabeza para exponer el cráneo debajo. Luego, corte a través de la sutura sagital, sutura lambdoidal y sutura coronal. Use fórceps para extraer ambos lados del hueso parietal y el hueso interparietal sin dañar el tejido y mueva cuidadosamente el cerebro a una disección de petri plato que contenga el medio A.Usando una cuchilla pre-enfriada, corte el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios.Utilice fórceps número 55 para separar el cerebelo del lóbulo cortical y el tallo cerebral. Luego, usa fórceps número 55 para diseccionar cuidadosamente el hipocampo y el estriado de la corteza y transferir cada tejido a una colección separada de Petri. En primer lugar, usa una cuchilla de afeitar para cortar cada región del cerebro en trozos finos que sean menos de un milímetro cúbico.Usando una pipeta de un mililitro con la punta cortada, transfiera las piezas de tejido en homogeneizadores Dounce pre-enfriados. Homogeneizar el tejido girando lentamente el pistón dentro y fuera del homogeneizador Dounce durante seis a 10 trazos completos hasta que no haya trozos visibles. Luego, transfiera los tejidos disociados a tubos de 50 mililitros a través de coladores de 70 micrómetros.Enjuague cada homogeneizador y pistón Dounce con el total de seis mililitros de medio frío A y luego transfiera el enjuague a un tubo de 15 mililitros para centrifugación. Centrifugar la suspensión de una sola célula a 400 g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos con un descanso a las cinco. Enjuague una columna de agotamiento grande y tres columnas de selección grandes en un separador magnético con tres mililitros de MCS.Cuando la centrifugación de las muestras de tejido esté completa, pipetee y deseche el sobrenadante sin alterar el pellet. Resuspender las células en el búfer MCS que contiene inhibidor de la Ródana. Añadir 100 microlitros de perlas de extracción de mielina a cada tubo que contenga células re-suspendidas de la corteza y el cerebelo y añadir 50 microlitros de perlas de eliminación de mielina a cada uno de los tubos que contienen células re-suspendidas del hipocampo y el estriado.Incubar los tubos sobre hielo durante 10 minutos. Después de esto, agregue MCS al tubo que contiene células corticales para llevar su volumen hasta dos mililitros y a los tubos restantes para llevar cada uno de sus volúmenes hasta un mililitro. Una vez que las columnas estén vacías de búfer de enjuague, cargue dos mililitros de celdas corticales en la columna de agotamiento grande y un mililitro de la suspensión de celdas entre sí en columnas de selección grandes separadas.A continuación, lave las columnas de agotamiento grandes con un mililitro de tampón MCS y lave cada columna de selección grande dos veces con un mililitro de tampón MCS para cada lavado. Filtre las células a través de 35 tapas de colador de microlitros en tubos FACS de fondo redondo. Centrifugar estos tubos a 400 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para peletizar las células.Luego, vierta lentamente el sobrenadante y deslice el borde del tubo sobre papel tisú. Resuspender las células en cada tubo con 300 microlitros de tampón FACS. En primer lugar, agregue cinco microlitros de reactivos de bloque de receptores FC de ratón a cada tubo.Incubar sobre hielo durante cinco minutos. A continuación, agregue un microlitrotro de CD45 PE tamaño siete y un microlitrotro de CD11B BV421 a cada tubo. Incubar los tubos de una coctelera a temperatura ambiente durante 10 minutos.Después de esto, agregue dos mililitros de tampón FACS para lavar. Centrifugar a 400 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos para peletizar las células. Resuspender las células en cada tubo con 400 microlitros de tampón FACS que contienen un microlitro de inhibidor de la RSEa y 0,5 microlitros de yoduro de propidium.Siguiendo el procedimiento estándar de FACS, clasifúle una sola microglia viva con una boquilla de 100 micrómetros en placas PCR de 96 pozos que contienen cuatro microlitros de tampón de lelisis en cada pozo. Vóter brevemente las placas y girarlas hacia abajo usando una centrífuga de sobremesa. Guarde las placas a menos 80 grados centígrados hasta la preparación de la biblioteca.Cuando esté listo para proceder, descongele la placa sobre hielo. Utilice un ciclor térmico para realizar una primera transcripción para generar ADNc y amplificar el ADNc con un paso adicional de digestión de exonucleasa como se describe en el protocolo de texto. Después de esto, purifica el ADNC añadiendo 18 microlitros de cuentas magnéticas a cada pozo.Incubar la placa en un soporte magnético durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante y lave las muestras dos veces con 80% de etanol recién hecho usando 80 microlitros de etanol por pozo para cada lavado. Para realizar la etiquetado, utilice una pipeteadora de nanolitros para mezclar 0,4 microlitros de cada muestra de ADNn a 1,2 microlitros de reactivos de etiquetado Tn5 del kit de preparación de la biblioteca en una placa de 384 pozos a 55 grados Centígrados durante 10 minutos.Para detener la reacción de etiquetado, añada 0,4 microlitros de tampón de neutralización a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, en 384 índices y 1,2 microlitros de PCR mezclados con las muestras y amplificar las bibliotecas como se describe en el protocolo de texto. Agrupa todas las bibliotecas individuales de la misma placa de 384 pozos y usa cuentas magnéticas para purificar las bibliotecas agrupadas finales.En este estudio, la microglia se aísla de la corteza, el cerebelo, el hipocampo y el estriado del hemisferio cerebral de un ratón adulto. La suspensión celular preparada se examina bajo un microscopio mediante el uso de tripano azul y un hemocicómetro para estimar el rendimiento, la viabilidad celular y la eficacia de la eliminación de mielina antes de realizar la tinción de anticuerpos. El recuento total de células en este punto debe ser superior a 30.000 para la corteza y a más de 5.000 para los otros tejidos.Más del 90% de las células deben ser viables con pequeños desechos de mielina. Una máquina FACS se utiliza para ordenar la microglia, que son típicamente CD45 baja y CD11B positiva. El aislamiento exitoso debe generar más del 80%microglia de todas las células individuales vivas, al menos para el tejido cortical.Una vez que la microglia individual se captura en el búfer de lisis, el ARN se libera y posteriormente se transcribe inversamente a cDNA, que luego se amplifica durante 23 ciclos. Como plataforma de electroforesis capilar, el analizador de fragmentos y los kits de fragmentos NGS de alta sensibilidad proporcionan información rápida y precisa sobre la distribución del tamaño, así como la cantidad de moléculas de ADNd están presentes en cada pozo de una placa de 96 pozos. Las muestras que muestran un frotis entre 500 y 5.000 pares base y están por encima de un cierto umbral de concentración se pueden utilizar para hacer bibliotecas.Las muestras se secuencian a una profundidad de más de un millón de lecturas en bruto por célula, lo que satura el poder de detección de la metodología de secuenciación de ARN de una sola célula. Con una tasa de mapeo de aproximadamente 60% sobre 2.000 genes se pueden detectar por célula microglial. Los datos publicados anteriormente generados a partir de este método de aislamiento se reproducen a partir de experimentos independientes, lo que demuestra la sensibilidad para detectar genes específicos de microglia en toda la población secuenciada.Con la información de las transcripciones de microglia única, los investigadores pueden descubrir las poblaciones celulares únicas en el contexto de su interés, y estudiar más a fondo la relevancia funcional de estas poblaciones recién identificadas.

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Investigación

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Neurociencia

El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

El video muestra una técnica para aislar la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto. En primer lugar, la corteza se somete a segmentación y homogeneización para eliminar las neuronas y otras células gliales, preservando la microglía. Después de eso, la suspensión celular se expone a microesferas magnéticas antimielina y a un campo magnético, separando efectivamente la microglía y las células mieloides de los restos de mielina y las células que contienen mielina.

Aislamiento de la microglía de la corteza del cerebro de un ratón adulto

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Este protocolo describe la preparación detallada de muestras de bajo aporte para la secuenciación de un solo núcleo, incluida la disección de ganglios cervicales y estrellados superiores de ratón, disociación celular, criopreservación, aislamiento de núcleos y código de barras hashtag.

Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

El presente protocolo describe cómo aislar y purificar la microglía primaria del hipocampo de ratones adultos, seguido de instrucciones para realizar registros de patch-clamp de células completas en estas células agudamente aisladas.

Aislamiento y registro de microglía del hipocampo de ratones adultos

Este protocolo combina la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular para aislar y caracterizar los estados de las células microgliales en el cerebelo de los cerebros de ratones postnatales tempranos. Utiliza la disociación enzimática, la centrifugación de Percoll y la inmunotinción para revelar la heterogeneidad de la microglía y mejorar la comprensión de sus funciones en el desarrollo y la enfermedad del cerebelo.

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Aprende a aislar microglia de regiones cerebrales en ratón adulto mediante FACS para secuenciación de ARN de célula única. Este método revela la heterogeneidad molecular de microglia en condiciones de salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

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