Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

La reparación del esófago circunferencial es técnicamente difícil en un modelo de rata, lo que requiere el desarrollo de esófago diseñado por tejidos que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo sin fuga de anastomosis esofágica. Hemos implementado un andamio tubular de dos capas como modelo piloto, que consiste en nanofibra interna y una hebra externa de impresión 3D en combinación con una anastomosis microvascular para minimizar la fuga de saliva después del trasplante. La reconstrucción esofágica estándar convencional se asocia con una amplia gama de complicaciones y morbilidad.

Por lo tanto, la ingeniería de tejidos esofágicos puede ser una estrategia alternativa prometedora para desarrollar modelos nativos de esófago para pacientes. La combinación de andamios híbridos, cultivo de biorreactor y un sistema de nutrición oral se puede aplicar a cualquier sistema que tenga un ambiente contaminado similar con su presión mecánica continua. Comience esterilizando un andamio de esófago impreso en 3D con una exposición de una hora a la luz ultravioleta, un remojo de 10 minutos en etanol y tres lavados con PBS.

Después del último lavado, coloque el andamio tubular de dos capas en una placa de cultivo de tejido no adherente de 24 pozos, y agregue suavemente pero uniformemente una vez 10 a las seis células madre mesenquimales humanas derivadas de seis adiposos por mililitro de matriz de membrana del sótano complementada con medio de crecimiento a la superficie interna del andamio. Utilice un sistema de biorreactor de flujo pulstil para fijar firmemente el andamio tubular de semilla celular al soporte de acrílico en la cámara de cultivo del biorreactor, y agregue 500 mililitros de medio de crecimiento a la cámara. A continuación, aplique 1 dyne por centímetro cuadrado de tensión de cizallamiento inducida por el flujo bajo una atmósfera húmeda que contenga 5% de dióxido de carbono.

Después de cinco días, utilice un kit de ensayo de viabilidad LIVE/DEAD para determinar las respuestas celulares en la superficie interna del andamio de acuerdo con los protocolos estándar, e imagine las células mediante microscopía confocal. Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, confirme la falta de respuesta al reflejo del pedal en la rata anestesiada y coloque al animal en la posición supina sobre una cortina estéril. Utilice cortadores para eliminar el cabello del sitio quirúrgico, y desinfectar la piel expuesta con BETADINE secuencial y exfoliaciones de etanol al 70%.

Para la colocación del tubo T, haz una incisión muscular y de la piel de la línea media en el abdomen de la rata, y usa una cuchilla de bisturí para crear un orificio de tres milímetros en la pared gástrica anterior. Inserte la punta de un tubo T de silicona en el sitio del defecto para fijarlo a la pared del estómago, y sutura cuidadosamente el tubo al tejido muscular gástrico. Sutura de la pared abdominal con sutura VICRYL 4-0.

Inserte cuidadosamente el extremo distal del tubo T implantado a través del túnel subcutáneo en la parte posterior del cuello, y utilice un angiocatéter para conectar una tapa de heparina al extremo del tubo T para evitar que el contenido del estómago fluya hacia atrás. Cuando la tapa esté en su lugar, utilice suturas de poliglactitina 4-0 para cerrar todas las capas de la piel abdominal, y coloque la rata en una jaula metabólica con monitoreo hasta la recumbencia completa. Una semana después de la colocación del tubo T, prepare la rata para la cirugía como se ha demostrado.

Coloque la rata bajo el microscopio y haga una incisión anterior del cuello medio en la piel desinfectada expuesta. Separe los músculos de la correa para exponer la estructura traqueoesofágica. Aísle el lado izquierdo del esófago de la tráquea.

Separe cuidadosamente la parte superior del esófago de la glándula tiroides, y use tijeras quirúrgicas para crear un defecto circunferencial completo de cinco milímetros de largo que contenga todas las capas del esófago. A continuación, inserte una sutura 9-0 entre el margen inferoposterior derecho del remanente y el andamio del escafgugu superior, y continúe suturando de derecha a izquierda entre el remanente del esófago superior y el andamio para crear una microanastomosis en el extremo superior del defecto esofágico distal. Luego, anastomose el andamio de la misma manera que el margen superior del remanente del esófago inferior.

Cuando las anastomosas estén completas, poner el colgajo de la glándula tiroides circundante sobre el sitio trasplantado para asegurar un suministro vascular y un mantenimiento estable del injerto. Luego, coser el músculo subcutáneo y el tejido de la piel con una sutura 4-0 VICRYL, y colocar la rata en una jaula metabólica en un dispositivo de calentamiento infrarrojo con monitoreo hasta la recumbencia completa. Después de una aplicación uniforme a la pared interna del andamio mediante inyección, la matriz de membrana del sótano incrustada en células madre mesenquimales humanas demuestra la morfología esperada de las células madre mesenquimales evaluada por la microscopía electrónica de barrido.

Después del trasplante esofágico en ratas con defectos esofágicos circunferenciales completos como se ha demostrado, el injerto se cubre con un colgajo de la glándula tiroides para una fijación estable y el suministro vascular al sitio implantado. Las ratas trasplantadas de esófago permanecen en 340 gramos hasta aproximadamente nueve días después del procedimiento, momento en el que los animales disminuyen rápidamente de peso debido a diversas causas, lo que resulta en la muerte para el día 15. Aunque la mayoría de las ratas desarrollan obstrucción no esofágica causada por bolas de pelo, en general no hay evidencia bruta de perforación, fuga de anastomosis con fístula, acumulación de seroma, formación de abscesos o necrosis de tejido blando circundante en cualquier animal experimental.

La reepíterización del sitio de trasplante puede confirmarse mediante la tinción de inmunofluorescencia para la queratina, y la capa de colágeno regenerado y las fibras de elastina pueden ser observadas claramente por la tinción tricromática de Masson. La regeneración de la capa muscular esofágica también se evidencia por una abundante neovascularización evaluada por el análisis inmunohistoquímico desmina. El éxito de este procedimiento se basa en el mantenimiento estable del tubo T a través de la fijación detrás del cuello para proporcionar nutrición durante la reconstrucción del esófago.

Para superar la mortalidad temprana típica de este procedimiento, se podría aplicar la tecnología de vascularización orgánica o temprana después de la implantación esofágica para ayudar en la reconstrucción esófago funcional.