Name: Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a crear un injerto de ingeniería de tejidos para reconstrucción esofágica circunferencial en ratas utilizando un andamio tubular de dos capas con nanofibras e impresión 3D. Este método combina anastomosis microvascular y bioreactor para minimizar fugas y mejorar la regeneración tisular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de I+D de La Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria Sanitaria de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de concesión: HI16C0362) y el Instituto de Investigación en Ciencias Básicas Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1C1B2011132). Los bioespecímenes y los datos utilizados en este estudio fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Universitario Nacional de Seúl, miembro de Korea Biobank Network.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC No 17-0164-S1A0) del Hospital Universitario Nacional de Seúl.
1. Fabricación de andamios
NOTA: Los andamios esofágicos de dos capas se fabrican combinando electrospinning e impresión 3D. La membrana interna del andamio tubular fue fabricada por poliuretano electrospinning (PU) con mandriles giratorios de acero inoxidable como los colectores9.
<ol><li>Para la preparación de nanofibras tubulares de PU, prepare una solución de polímero de PU al 20% (p/v) agitando en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 8 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque la solución de PU en la jeringa con una aguja de metal contundente (22 G) y electrospin en mandriles giratorios de acero inoxidable (diámetro de 2 mm) a una distancia de 30 cm entre la punta de la aguja y el colector giratorio. NOTA: La fuente de alimentación se establece en una corriente directa de alta tensión de 15 kV potencial. La velocidad de alimentación de la solución se fija a 0,5 ml/h utilizando una bomba de jeringa.</li>
	<li>Hacer una capa tubular de nanofibra en la superficie del mandril girando a 3,14 m/s.</li>
	<li>Seque la nanofibra de PU en un horno al vacío a 40 oC durante la noche para eliminar por completo el disolvente residual. NOTA: La pared exterior impresa en 3D del andamio esofágico se prepara utilizando un sistema de prototipado rápido. El equipo de impresión 3D consta de un dispensador, boquilla, controlador de compresión/calor, etapa de conversión de 3 ejes y sistema de software.</li>
	<li>Los pellets PCL se disuelven a 100 oC en un cilindro de calentamiento y luego se imprimen en la superficie de las nanofibras a alta presión (7 bar) bajo el control de un sistema de biotrazado. El tamaño de la boquilla es de 300 m y la distancia de la hebra es de 700 m.</li>
	<li>Después de retirar el andamio de dos capas del mandril, esteriliza dope en 70% de etanol bajo luz ultravioleta. NOTA: En estudios anteriores10se han notificado características más detalladas del andamio.</li>
</ol>2. Sembrado celular en los injertos y cultivo del biorreactor
NOTA: Las células madre mesenquimales derivadas de adiposos humanos (hCM) compradas a una empresa se utilizaron sin modificaciones.
<ol><li>Antes del trasplante de células, esterilizar el andamio esófago impreso en 3D durante 1 h bajo luz ultravioleta, mojarlo durante 10 minutos con etanol y lavarlo 3 veces con solución salina con fosfato (PBS).</li>
	<li>Cultivar y ampliar los hMSCs en medio de crecimiento (suplemento basal medio/crecimiento). Los andamios tubulares de dos capas se transfirieron a 24 placas de cultivo de tejido de pozos no adherentes.</li>
	<li>Para unir las células a la superficie interna del andamio, agregue suavemente la suspensión hMSC a una densidad de 1 x 106 células/ml en la matriz de membrana del sótano que contenga el medio de crecimiento.</li>
	<li>Deposite uniformemente la suspensión de la matriz de membrana del sótano en la superficie interna del andamio tubular de dos capas.</li>
	<li>Fije firmemente el andamio tubular con sede sin hMSC al soporte de acrílico en la cámara de cultivo del biorreactor utilizando un sistema de biorreactor de flujo pulsátil. NOTA: El sistema de biorreactor diseñado a medida consta de una bomba, trampa de burbujas, cámara de flujo, manómetro, válvula controlable y depósito medio. Al aplicar tensión de cizallamiento en la cámara de cultivo, permita un tiempo de descanso de 1-2 min11.</li>
	<li>Añada un medio de crecimiento a la cámara de cultivo y aplique una tensión de cizallamiento inducida por flujo de 0,1 dyne/cm2 bajo una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO210. NOTA: El valor de la tensión cortante inducida por el flujo se calculó simulando la peristalsis del tejido esofágico derivado del cuerpo humano de estudios anteriores10.</li>
	<li>Determinar las respuestas celulares en las superficies internas de los andamios tubulares de dos capas sin cultivo de biorreactor después de 5 días utilizando un kit de ensayo de viabilidad LIVE/DEAD de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Obtenga imágenes mediante microscopía confocal utilizando la herramienta Z-stack.</li>
	<li>Al tercer día, observe la morfología superficial del andamio tubular con semillas de hMSC a través de un microscopio electrónico de barrido (SEM).<ol>
<li>Fijar el andamio que fue incubado con hMSC con 2.5% glutaraldehído y OsO4 durante 24 h y deshidratar con etanol.</li>
		<li>Recubrir los hMSC fijos con platino utilizando una capa de esputo en condiciones atmosféricas de argón y obtener imágenes SEM a una tensión de aceleración de 25 kV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparación quirúrgica para cirugía animal
NOTA: Las preparaciones quirúrgicas se aplican antes de la gastrostomía y el trasplante de esófago.
<ol><li>Configurar los instrumentos quirúrgicos estériles: cuchilla de escalpelo, retractor Weitlaner, soporte de microaguja, fórceps de microsutura, fórceps de microtejido, microtijeras, porta agujas Mayo-Hegar, tijeras de operación, tijeras de iris, fórceps de vendaje, fórceps de tejido, Fórceps de astilla, fórceps de iris, jeringa de 5 ml (aguja de 21 G), jeringa de 10 ml (aguja de 22 G), sutura de poliamida 9-0, sutura de 4-0 poliglactina.</li>
	<li>Anestesiar al animal con una inyección intramuscular de tetiamina/zolazepam (dosis de 50 mg/g) y 2% de clorhidrato de xilazina (2 mg/kg de dosis). NOTA: Las ratas adultas Sprague-Dawley (SD) que pesan 398-420 g se utilizaron para el trasplante de esófago.</li>
	<li>Antes de transferirse a la cortina quirúrgica, compruebe la condición anestésica adecuada del animal pellizcando la cola con los fórceps.</li>
	<li>Coloque al animal en posición supina sobre la cortina estéril y use cortadoras para extraer el cabello del cuello (para trasplante de esófago) o abdomen (para gastrostomía). A continuación, frote el sitio quirúrgico con betadina y 70% de etanol.</li>
	<li>Antes de la incisión, inyectar por vía subcutánea un analgésico como la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) para aliviar el dolor.</li>
</ol>4. Cirugía de gastrostomía utilizando un tubo T en ratas
NOTA: Se realizó una gastrostomía modificada en todos los animales experimentales para permitir la alimentación temporal del tubo no oral de derivación (n.o 5).
<ol><li>Pida a las ratas que ayunan el día antes de la cirugía. Preparar la cirugía como en la sección 3.</li>
	<li>Exponga el estómago a través de una incisión de línea media de la piel y los músculos abdominales de las ratas anestesiadas.</li>
	<li>Cree un orificio de 3 mm en la pared gástrica anterior con una cuchilla de bisturí.</li>
	<li>Inserte la punta del tubo T de silicona en el lugar del defecto para fijarlo a la pared del estómago.</li>
	<li>Suturar correctamente para que el tubo T no se desprenda de la pared gástrica.</li>
	<li>Saque el extremo distal del tubo T implantado a través del túnel subcutáneo en la parte posterior del cuello.</li>
	<li>Inserte la tapa de heparina en el extremo del tubo T para evitar que el contenido del estómago fluya hacia atrás. NOTA: Utilice un angiocatéter para conectar el extremo del tubo T con la tapa de heparina.</li>
	<li>Sutura todas las capas de la pared abdominal y la piel usando 4-0 suturas de poliglactina.</li>
	<li>Mantenga todas las ratas experimentales separadas en una jaula metabólica después de que se haya completado la gastrostomía.</li>
</ol>5. Trasplante esofágico
NOTA: El trasplante esofágico del andamio tubular de dos capas se realiza 1 semana después de la gastrostomía (n.o 5). Antes del trasplante, inocular hMSC (densidad celular: 1 x 106 células/ml en la matriz de membrana del sótano) en la pared interna de cada andamio e incubar durante 3 días en el sistema de biorreactor. El procedimiento quirúrgico es el siguiente.
<ol><li>Retire el vello del cuello de los animales modelo y realice el drenaje estándar del sitio quirúrgico para la cirugía aséptica. NOTA: Se recomienda crear un área de afeitado grande para mantener la cirugía asceptica en el animal.</li>
	<li>Después de la incisión mediana anterior del cuello, separe los músculos de la correa y exponga la estructura traqueoesofágica.</li>
	<li>Diseccionar con rodeos el nervio vago del esófago antes de volver a sellar el segmento, de lo contrario la respiración del animal se vea comprometida.</li>
	<li>Bajo aumento, aísle el lado izquierdo del esófago de la tráquea y separe cuidadosamente la parte superior de la glándula tiroides.</li>
	<li>Crear un defecto circunferencial completo de 5 mm de largo que contenga todas las capas del esófago utilizando tijeras quirúrgicas. NOTA: Antes del trasplante de esófago, corte los andamios preparados con tijeras quirúrgicas para que coincidan con la longitud del sitio del trasplante.</li>
	<li>Bajo un microscopio, realice microanastomosis en ambos extremos del defecto esofágico distal utilizando un hilo de sutura 9-0. Coloque la primera sutura entre el margen inferoposterior derecho del remanente del esófago superior y el andamio. Continúe suturando de derecha a izquierda entre el remanente del esófago superior y el andamio. Anastomosa del andamio de la misma manera que el margen superior del remanente del esófago inferior. NOTA: Realizar anastomosis microvascular como se utiliza en la cirugía clínica para el trasplante de esófago. Trabaje con un microscopio para una sutura precisa y estanca del sitio del implante.</li>
	<li>Después, poner el colgajo de la glándula tiroides circundante sobre el sitio trasplantado para asegurar el mantenimiento estable y el suministro vascular a los injertos.</li>
	<li>Después del trasplante, coser el músculo subcutáneo y el tejido de la piel con una sutura de 4-0 vicryl.</li>
	<li>Mantener todas las ratas experimentales individualmente en jaulas metabólicas.</li>
</ol>6. Procedimientos postoperatorios
NOTA: Los procedimientos postoperatorios se realizan después de la gastrostomía y el trasplante de esófago.
<ol><li>Después del cierre de la herida abdominal, coloque las ratas en jaulas metabólicas individuales y coloque las jaulas en dispositivos de calentamiento infrarrojo para evitar la hipotermia.</li>
	<li>Monitoree a los animales hasta que logren y mantengan la recumbencia esternal (es decir, acostado sin corazón sobre el pecho).</li>
	<li>Para minimizar la inflamación en el sitio quirúrgico, administre diariamente el antibiótico gentamicina (20 mg/kg) a las ratas.</li>
	<li>Comience la alimentación líquida oral en el tercer día postoperatorio hasta la variable del estudio. Suministrar toda la fórmula nutricional (20,6 g/100 ml [g%] carbohidratos, 3,8 g% de proteína, 0,2 g% de grasa) a través de la tapa de heparina 3 veces al día a partir del día después de la cirugía.</li>
	<li>Compruebe la apariencia de los animales y el peso corporal diariamente. Compruebe el comportamiento, como el sitio de incisión autolesionante o la resistencia a la ingesta de tubos, así como varias complicaciones quirúrgicas. Cuando el peso corporal de los modelos de ratas disminuya rápidamente en un 20% o más, realice la eutanasia por inhalación deCO2.</li>
</ol>7. Histología e inmunohistoquímica
NOTA: Para el análisis histológico, todo el tejido esofágico de los animales eutanasiados se extrae mediante tijeras quirúrgicas. La tinción de hematoxilina y eosina y la tinción tricroma de Masson se realizaron utilizando técnicas histológicas estándar. La inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo.
<ol><li>Fije todo el esófago que contiene los sitios trasplantados en un 4% de paraformaldehído. Crea un bloque de parafina y corta secciones de 4 m de espesor.</li>
	<li>Desparaffinizar las secciones tisulares y deshidratarlas en una serie de etanol. Sumerja los portaobjetos en el tampón de citrato y caliente durante 10 minutos en el microondas. Enfríe las células con PBS frío durante 20 min. Sumergir en 3% peróxido de hidrógeno durante 6 min, y lavar con PBS durante 10 min.</li>
	<li>Incubar en albúmina sérica bovina (BSA) al 3% durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear reacciones inespecíficas de las secciones de tejido.</li>
	<li>Lavar 3x con PBS durante 5 min. Incubar con anticuerpos primarios contra Desmin (diluido a 1:200), queratina 13 (diluido a 1:100) y factor von Willebrand (vWF; diluido a 1:100) durante la noche a 4oC.</li>
	<li>Lavar 3x con PBS durante 15 min. Incubar con el anticuerpo secundario adecuado a una concentración de 1:500 para Desmin y Queratina 13 a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos. NOTA: Las secciones de tejido para vWF se incuban utilizando un kit conjugado con peroxidasa de rábano picante (ver Tabla de Materiales)y luego se visualizaron con 3,3'-diaminobenzidina (DAB).</li>
	<li>Montar con un cubrevidrio y 4',6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) que contiene medio de montaje.</li>
</ol>

<ol><li>Irino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+outcomes+after+replacement+of+the+esophagus+with+gastric%2C+colonic%2C+or+jejunal+conduits%3A+a+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+the+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review.</a> Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).</li>
<li>Flanagan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophagectomy+and+Gastric+Pull-through+Procedures%3A+Surgical+Techniques%2C+Imaging+Features%2C+and+Potential+Complications%5BTitle%5D)+AND+%22Radiographics%22%5BJournal%5D)">Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications.</a> Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).</li>
<li>Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+outcomes+of+different+approaches+to+esophageal+replacement+in+long-gap+esophageal+atresia%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine.+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review.</a> Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942(2017).</li>
<li>Luc, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+and+matured+esophageal+scaffold+for+circumferential+esophagus+replacement%3A+Proof+of+concept+in+a+pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model.</a> Biomaterials. 175, 1-18 (2018).</li>
<li>Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+oesophageal+muscle+layer+from+oesophagus+acellular+matrix+scaffold+using+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).</li>
<li>La Francesca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+regeneration+and+remodeling+of+the+pig+esophagus+after+circumferential+resection+using+a+retrievable+synthetic+scaffold+carrying+autologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4123(2018).</li>
<li>Ponten, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+severe+mediastinal+bleeding+after+esophagectomy%3A+a+potentially+lethal+complication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).</li>
<li>Catry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumferential+Esophageal+Replacement+by+a+Tissue-engineered+Substitute+Using+Mesenchymal+Stem+Cells%3A+An+Experimental+Study+in+Mini+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs.</a> Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).</li>
<li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+preparation+of+bio-tubular+scaffolds+for+fabricating+artificial+vascular+grafts+by+combining+electrospinning+and+a+3D+printing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).</li>
<li>Kim, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Engineered+Esophagus+via+Bioreactor+Cultivation+for+Circumferential+Esophageal+Reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinational+effects+of+mechanical+forces+and+substrate+surface+characteristics+on+esophageal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+A%22%5BJournal%5D)">Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation.</a> Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyurethane+scaffolds+seeded+with+autologous+cells+can+regenerate+long+esophageal+gaps%3A+An+esophageal+atresia+treatment+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).</li>
<li>Nakase, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathoracic+esophageal+replacement+by+in+situ+tissue-engineered+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus.</a> Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).</li>
<li>Kwiatek, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+the+esophagus+in+eosinophilic+esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis.</a> Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).</li>
<li>Anjum, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocomposite+nanofiber+matrices+to+support+ECM+remodeling+by+human+dermal+progenitors+and+enhanced+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10291(2017).</li>
<li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCL+and+PCL-gelatin+nanofibers+as+esophageal+tissue+scaffolds%3A+optimization%2C+characterization+and+cell-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions.</a> Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).</li>
</ol>

Se ha comercializado el sistema de biorreactor diseñado para este estudio (número de modelo: ACBF-100).

Los estudios en animales existentes sobre esofagia artificial siguen estando limitados por varios factores críticos. El andamio esofágico artificial ideal debe ser biocompatible y tener excelentes propiedades físicas. Debe ser capaz de regenerar el epitelio de la mucosa en el período postoperatorio temprano para evitar fugas anastomóticas. La regeneración de las capas musculares longitudinales circulares y externas internas también es importante para la peristalsis funcional12,<sup clas...

El tratamiento de los trastornos esofágicos, como las malformaciones congénitas y los carcinomas esofágicos, puede conducir a la pérdida del segmento estructural del esófago. En la mayoría de los casos, se han realizado injertos de reemplazo autólogos, como conductos de extracción gástricos o interposiciones de colon,1,2. Sin embargo, estos reemplazos esofágistas tienen una variedad de complicaciones quirúrgicas y riesgos de reoperación3. Por lo tanto, el uso de andamios de esófago con ingeniería de tejido imitando el esófago nativo puede ser una estrategia alternativa prometedora para regenerar finalmente los tejidos perdidos4,5,6.
Aunque un esófago con ingeniería de tejido potencialmente ofrece una alternativa a los tratamientos actuales de defectos esofágicos, existen barreras significativas para su aplicación in vivo. La fuga anastomótica postoperatoria y la necrosis del andamio esofágico implantado conducen inevitablemente a una infección letal del espacio aséptico circundante, como el mediastinum7. Por lo tanto, es extremadamente importante prevenir la contaminación de alimentos o saliva en la herida y el tubo nasogástrico. Se debe considerar la gastrostomía o la nutrición intravenosa hasta que se complete la cicatrización de la herida primaria. Hasta la fecha, la ingeniería de tejido esofágico se ha realizado en grandes modelos animales porque los animales grandes sólo pueden ser alimentados por hiperalimentación intravenosa durante 2-4 semanas después de la implantación del andamio8. Sin embargo, no se ha establecido tal modelo de alimentación no oral para la supervivencia temprana después del trasplante de esófago en animales pequeños. Esto se debe a que los animales eran extremadamente activos e incontrolables, por lo que no podían mantener el tubo de alimentación en sus estómagos durante un largo período de tiempo. Por esta razón, ha habido pocos casos de trasplante de esófago exitoso en animales pequeños.
En vista de las circunstancias de la ingeniería del tejido esofágico, diseñamos un andamio tubular de dos capas que consiste en nanofibras electrospun (capa interna; Figura 1A) y una hebra impresa en 3D (capa exterior; Figura 1B) incluyendo una técnica de gastrostomía modificada. La nanofibra interna está hecha de PU, un polímero no degradable, y evita la fuga de alimentos y saliva. Las hebras externas impresas en 3D están hechas de policaprolactona biodegradable (PCL), que puede proporcionar flexibilidad mecánica y adaptarse al movimiento peristáltico. Las células madre mesenquimales derivadas de los adiposos humanos (hAD-MSC) fueron sembradas en la capa interna del andamio para promover la reepitelización. La estructura de nanofibra puede facilitar la regeneración inicial de la mucosa proporcionando un entorno de matriz extracelular estructural (ECM) para la migración celular.
También hemos aumentado la tasa de supervivencia y la bioactividad de las células inoculadas a través del cultivo del biorreactor. El andamio implantado estaba cubierto con un colgajo de la glándula tiroides para permitir una regeneración más estable de la mucosa esofágica y la capa muscular. En este informe, describimos protocolos para técnicas de ingeniería de tejido esofágico, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores a base de células madre mesenquimales, una técnica de alimentación de bypass con gastrostomía modificada y una técnica de anastomosis para la reconstrucción esofágica circunferencial en un modelo de rata.

<table><tbody><tr><td>Jaula metabólica</td><td>TEUNGDO BIO & PLANTA</td><td>JD-C-66</td><td></td></tr><tr><td>Zoletil (dosis de 50 mg/g)</td><td>Virbac</td><td>1000000188</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2% clorhidrato de xilacina (Rumpun)</td><td>Byely</td><td>Q-0615-035</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehído</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP031</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl</td><td>ETHICON</td><td>W9443</td><td></td></tr><tr><td>9-0 Vicryl</td><td>ETHICON</td><td>W2813</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico gentamicina (Septopal).</td><td>Septopal</td><td>0409-1207-03</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de citrato, ph6.0, 10X</td><td>Sigma</td><td>C9999</td><td></td></tr><tr><td>DAB KIT DE SUSTRATO DE PEROXIDASA</td><td>VECTOR</td><td>SK4100</td><td></td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-23879</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción elástica</td><td>ScyTeK</td><td>ETS-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Etanol</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>Merck 64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovino Serun (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma</td><td>354400</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG (H+L) Anticuerpo secundario</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de heparina</td><td>Hyupsung Medical</td><td>HS-T-05</td><td></td></tr><tr><td>hMSC (STEMPRO) / medio de crecimiento (MesenPRO RSTM)</td><td>Invitrogen</td><td>R7788-110</td><td></td></tr><tr><td>Kit conjugado con peroxidasa de rábano picante (Vectastain)</td><td>VECTOR</td><td>PK7800</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>JUNSEI</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>Keratin13</td><td>Novus</td><td>NBP1-97797</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de ensayo de viabilidad</td><td>Sondas moleculares</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354262</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida (DMF)</td><td>Sigma</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos no adherentes .</td><td>Corning</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Sigma</td><td>O5500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Eppendorf</td><td>3072115</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 10X</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td> Polímero de policaprolactona <td></td></tr><tr><td>(PCL)</td><td>Sigma</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>Polímero de poliuretano (PU+A2:A24)</td><td>Lubrizol</td><td>2363-80AE</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación</td><td>NanoNC</td><td>HV100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Reactivo antidecoloración de oro con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Rumpun</td><td>Bayer</td><td>Q-0615-035</td><td></td></tr><tr><td>Tubo en T de silicona</td><td>Sewoon Medical</td><td>2206-005</td><td></td></tr><tr><td>Pomada ocular de terramicina</td><td>Pfizer Pharmaceutical Korea W01890011</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiletamina/Zolazepam (Zoletil)</td><td>Laboratorios Virbac</td><td>Q-0042-058</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción tricrómico</td><td>ScyTeK</td><td>TRM-1</td><td></td></tr><tr><td>von Willebrand Factor (vWF)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc 14014</td><td></td></tr></tbody></table>

injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

El uso de materiales biocompatibles para la reconstrucción esofágica circunferencial es una tarea técnicamente difícil en ratas y requiere una técnica de implante óptima con apoyo nutricional. Recientemente, ha habido muchos intentos de ingeniería de tejido esofágico, pero la tasa de éxito ha sido limitada debido a la dificultad en la epitelización temprana en el entorno especial de la peristalsis. Aquí, desarrollamos un esófago artificial que puede mejorar la regeneración de la mucosa esofágica y las capas musculares a través de un andamio tubular de dos capas, un sistema de biorreactor a base de células madre mesenquimales, y una técnica de alimentación de bypass con Gastrostomy. El andamio está hecho de nanofibras de poliuretano (PU) en forma cilíndrica con una hebra de policaprolactona impresa tridimensional (3D) envuelta alrededor de la pared exterior. Antes del trasplante, las células madre mesenquimales derivadas del ser humano se sembraban en el lumen del andamio, y se realizaba el cultivo del biorreactor para mejorar la reactividad celular. Mejoramos la tasa de supervivencia del injerto aplicando anastomosis quirúrgica y cubriendo la prótesis implantada con un colgajo de la glándula tiroides, seguido de la alimentación temporal de la gastrostomía no oral. Estos injertos fueron capaces de recapitular los hallazgos de epitelización inicial y regeneración muscular alrededor de los sitios implantados, como lo demuestra el análisis histológico. Además, se observaron un aumento de las fibras de elastina y la neovascularización en la periferia del injerto. Por lo tanto, este modelo presenta una nueva técnica potencial para la reconstrucción esofágica circunferencial.

La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del proceso de fabricación del andamio tubular de dos capas PU-PCL. La solución de PU fue electrospun de una aguja de 18 G para hacer una estructura interna cilíndrica con un espesor de 200 m. Luego, el PCL fundido se imprimió en la pared exterior de la nanofibra de la PU a intervalos regulares. La morfología superficial de las paredes internas y externas del andamio tubular completado se puede ver en las imágenes d...

La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.

Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

La reparación del esófago circunferencial es técnicamente difícil en un modelo de rata, lo que requiere el desarrollo de esófago diseñado por tejidos que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo sin fuga de anastomosis esofágica. Hemos implementado un andamio tubular de dos capas como modelo piloto, que consiste en nanofibra interna y una hebra externa de impresión 3D en combinación con una anastomosis microvascular para minimizar la fuga de saliva después del trasplante. La reconstrucción esofágica estándar convencional se asocia con una amplia gama de complicaciones y morbilidad.Por lo tanto, la ingeniería de tejidos esofágicos puede ser una estrategia alternativa prometedora para desarrollar modelos nativos de esófago para pacientes. La combinación de andamios híbridos, cultivo de biorreactor y un sistema de nutrición oral se puede aplicar a cualquier sistema que tenga un ambiente contaminado similar con su presión mecánica continua. Comience esterilizando un andamio de esófago impreso en 3D con una exposición de una hora a la luz ultravioleta, un remojo de 10 minutos en etanol y tres lavados con PBS.Después del último lavado, coloque el andamio tubular de dos capas en una placa de cultivo de tejido no adherente de 24 pozos, y agregue suavemente pero uniformemente una vez 10 a las seis células madre mesenquimales humanas derivadas de seis adiposos por mililitro de matriz de membrana del sótano complementada con medio de crecimiento a la superficie interna del andamio. Utilice un sistema de biorreactor de flujo pulstil para fijar firmemente el andamio tubular de semilla celular al soporte de acrílico en la cámara de cultivo del biorreactor, y agregue 500 mililitros de medio de crecimiento a la cámara. A continuación, aplique 1 dyne por centímetro cuadrado de tensión de cizallamiento inducida por el flujo bajo una atmósfera húmeda que contenga 5% de dióxido de carbono.Después de cinco días, utilice un kit de ensayo de viabilidad LIVE/DEAD para determinar las respuestas celulares en la superficie interna del andamio de acuerdo con los protocolos estándar, e imagine las células mediante microscopía confocal. Antes de comenzar el procedimiento quirúrgico, confirme la falta de respuesta al reflejo del pedal en la rata anestesiada y coloque al animal en la posición supina sobre una cortina estéril. Utilice cortadores para eliminar el cabello del sitio quirúrgico, y desinfectar la piel expuesta con BETADINE secuencial y exfoliaciones de etanol al 70%.Para la colocación del tubo T, haz una incisión muscular y de la piel de la línea media en el abdomen de la rata, y usa una cuchilla de bisturí para crear un orificio de tres milímetros en la pared gástrica anterior. Inserte la punta de un tubo T de silicona en el sitio del defecto para fijarlo a la pared del estómago, y sutura cuidadosamente el tubo al tejido muscular gástrico. Sutura de la pared abdominal con sutura VICRYL 4-0.Inserte cuidadosamente el extremo distal del tubo T implantado a través del túnel subcutáneo en la parte posterior del cuello, y utilice un angiocatéter para conectar una tapa de heparina al extremo del tubo T para evitar que el contenido del estómago fluya hacia atrás. Cuando la tapa esté en su lugar, utilice suturas de poliglactitina 4-0 para cerrar todas las capas de la piel abdominal, y coloque la rata en una jaula metabólica con monitoreo hasta la recumbencia completa. Una semana después de la colocación del tubo T, prepare la rata para la cirugía como se ha demostrado.Coloque la rata bajo el microscopio y haga una incisión anterior del cuello medio en la piel desinfectada expuesta. Separe los músculos de la correa para exponer la estructura traqueoesofágica. Aísle el lado izquierdo del esófago de la tráquea.Separe cuidadosamente la parte superior del esófago de la glándula tiroides, y use tijeras quirúrgicas para crear un defecto circunferencial completo de cinco milímetros de largo que contenga todas las capas del esófago. A continuación, inserte una sutura 9-0 entre el margen inferoposterior derecho del remanente y el andamio del escafgugu superior, y continúe suturando de derecha a izquierda entre el remanente del esófago superior y el andamio para crear una microanastomosis en el extremo superior del defecto esofágico distal. Luego, anastomose el andamio de la misma manera que el margen superior del remanente del esófago inferior.Cuando las anastomosas estén completas, poner el colgajo de la glándula tiroides circundante sobre el sitio trasplantado para asegurar un suministro vascular y un mantenimiento estable del injerto. Luego, coser el músculo subcutáneo y el tejido de la piel con una sutura 4-0 VICRYL, y colocar la rata en una jaula metabólica en un dispositivo de calentamiento infrarrojo con monitoreo hasta la recumbencia completa. Después de una aplicación uniforme a la pared interna del andamio mediante inyección, la matriz de membrana del sótano incrustada en células madre mesenquimales humanas demuestra la morfología esperada de las células madre mesenquimales evaluada por la microscopía electrónica de barrido.Después del trasplante esofágico en ratas con defectos esofágicos circunferenciales completos como se ha demostrado, el injerto se cubre con un colgajo de la glándula tiroides para una fijación estable y el suministro vascular al sitio implantado. Las ratas trasplantadas de esófago permanecen en 340 gramos hasta aproximadamente nueve días después del procedimiento, momento en el que los animales disminuyen rápidamente de peso debido a diversas causas, lo que resulta en la muerte para el día 15. Aunque la mayoría de las ratas desarrollan obstrucción no esofágica causada por bolas de pelo, en general no hay evidencia bruta de perforación, fuga de anastomosis con fístula, acumulación de seroma, formación de abscesos o necrosis de tejido blando circundante en cualquier animal experimental.La reepíterización del sitio de trasplante puede confirmarse mediante la tinción de inmunofluorescencia para la queratina, y la capa de colágeno regenerado y las fibras de elastina pueden ser observadas claramente por la tinción tricromática de Masson. La regeneración de la capa muscular esofágica también se evidencia por una abundante neovascularización evaluada por el análisis inmunohistoquímico desmina. El éxito de este procedimiento se basa en el mantenimiento estable del tubo T a través de la fijación detrás del cuello para proporcionar nutrición durante la reconstrucción del esófago.Para superar la mortalidad temprana típica de este procedimiento, se podría aplicar la tecnología de vascularización orgánica o temprana después de la implantación esofágica para ayudar en la reconstrucción esófago funcional.

tissue-engineered-graft-for-circumferential-esophageal-reconstruction

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Aquí se describe un procedimiento de cirugía cardiaca para implantar la ingeniería tisular en el auriculoventricular (AV) con ranura de un adulto de rata Lewis.

Implantación de la ingeniería tisular en el corazón de rata

Este artículo y el vídeo de acompañamiento presentar nuestro protocolo para la generación de tejido de ingeniería intestino en el ratón, utilizando un organoide unidades-on-andamio enfoque.

Ingeniería de tejidos del intestino en un modelo murino

En este video, demostramos la preparación de un andamio de esófago de cerdo descelularizado, con su arquitectura bioquímica y composición preservadas, para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Preparación de andamio esofágico porcino descelularizado: una técnica para generar andamio acelular a partir de un esófago de cerdo

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal.

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

Hasta la fecha, los defectos de tejido grueso se reconstruyen típicamente mediante la aplicación de colgajos de tejido autólogo o tejidos de ingeniería. En este protocolo, presentamos un nuevo método para diseñar un colgajo de tejido vascularizado con un pedículo autólogo, para que sirva como sustituto de los colgajos autólogos.

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

Aquí, presentamos un método modificado de electrospinning para fabricar injertos vasculares PCL con fibras gruesas y los poros grandes y para describir un protocolo para evaluar el desempeño en vivo en un modelo de rata de reemplazo de la aorta abdominal.

Implantación de injertos vasculares Electrospun con estructura optimizada en un modelo de rata

Estenosis del injerto constituye un obstáculo fundamental en ingeniería tisular de la vía aérea recambio. Para investigar los mecanismos celulares subyacentes estenosis, utilizamos un modelo murino de reemplazo traqueal ingeniería tisular con células mononucleares de médula ósea (BM-MNC). Aquí detallamos nuestro protocolo, incluyendo fabricación de andamio, BM-MNC aislamiento, siembra del injerto y la implantación.

Siembra e implantación de un injerto traqueal tejido-dirigida biosintético en un modelo murino

En el presente protocolo, se desarrolló una inducción de estenosis uretral en ratas Wistar, seguida de una reconstrucción uretral con un injerto de mucosa bucal. Se realizó un uretrograma retrógrado y una evaluación Doppler láser, validando la reconstrucción uretral (después de la formación de estenosis) y la colocación del injerto.

Inducción de estenosis uretral seguida de uretroplastia de injerto de mucosa bucal en un modelo de rata

En este trabajo se presenta un modelo animal de fibrosis inducida por transición endotelial-mesenquimatosa, como se observa en defectos cardíacos congénitos como la estenosis aórtica crítica o el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, que permite la evaluación histológica detallada del tejido, la identificación de vías de señalización reguladoras y la prueba de opciones de tratamiento.

Un modelo de trasplante de corazón de rata heterotópico neonatal para el estudio de la transición endotelial a mesenquimal

Este protocolo describe un modelo de trasplante intestinal basado en ratas con ileostomía para la evaluación de la evolución temporal de la intervención farmacológica en el rechazo del injerto.

Un modelo de rechazo de injerto de rata para trasplante intestinal con ileostomía exteriorizada para la evaluación del pronóstico longitudinal

Aprenda a crear un injerto de ingeniería de tejidos para reconstrucción esofágica circunferencial en ratas utilizando un andamio tubular de dos capas con nanofibras e impresión 3D. Este método combina anastomosis microvascular y bioreactor para minimizar fugas y mejorar la regeneración tisular.

Injerto con ingeniería de tejido para la reconstrucción esofágica circunferencial en ratas

Explorar más videos