Supervivencia de células Purkinje en cultivos de rebanadas de cerebeloso organotípico

El cultivo organotípico de la rebanada es una poderosa herramienta para estudiar el neurodesarrollo y los procesos degenerativos o regenerativos. Esta técnica se puede utilizar para examinar rápidamente las moléculas candidatas para su potencial neuroprotector. Este método imita estrechamente las condiciones in vivo, en comparación con los cultivos celulares primarios disociados, ya que la arquitectura del conjunto de tejidos y las conexiones de celdas nativas se conservan dentro de los planos de las secciones.

Aquí demostramos el estudio de la muerte celular de Purkinje en el cerebelo en desarrollo. Pero el cultivo de rebanadas organotípicas es igualmente adecuado para modelar enfermedades neurodegenerativas en casi todas las regiones del sistema nervioso central. Demostrando el procedimiento con Jennifer Rakotomamonjy estará Sean McDermott, un técnico de mi laboratorio.

Antes de cosechar las rodajas de cerebeloso, en un gabinete de bioseguridad esterilizado, llenar cada pozo de una placa de cultivo de seis pozos con un mililitro de medio de cultivo filtrado al vacío, y añadir el agente farmacológico de interés a los pozos de tratamiento, y un volumen igual de vehículo a los pozos de control. Usando fórceps estériles, coloque un inserto de filtro de membrana PTFE de 0,4 micrómetros en cada pozo, teniendo cuidado de evitar burbujas en la interfaz de cada membrana y el medio, y equilibre el medio en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados y 5% durante dos horas. Para cosechar el cerebelo, utilice fórceps de apósito recto para agarrar la cabeza del cachorro por la nariz, y use tijeras de ojo recto para cortar el cuero cabelludo desde el extremo posterior lateralmente a la línea media.

Abra el cráneo de la misma manera, apuntando las puntas de la tijera hacia afuera para evitar dañar el cerebelo, y use una espátula para transferir el cerebro a un plato de 60 milímetros que contenga HBSS frío y cinco miligramos por mililitro de glucosa. Utilice los fórceps de apósito recto para diseccionar cuidadosamente el cerebelo, y utilice fórceps finos curvos estériles para colocar el tejido en un disco de plástico en la mesa de corte de un cortante de tejido. Gire la mesa de corte para orientar el tejido para permitir la adquisición de secciones parasagitales, y tire de la perilla de liberación de la mesa hacia la derecha para mover la mesa de corte hasta que la hoja se coloque en el borde del tejido.

A continuación, ajuste el espesor de la rebanada a 350 micrómetros, y la velocidad de la hoja a medio, e inicie el helicóptero. Cuando todo el cerebelo haya sido cortado, apague el helicóptero. Usando fórceps estériles, sostenga el disco sobre un nuevo plato de 60 milímetros.

Utilice una pipeta de transferencia para lavar HBSS más glucosa sobre el disco de modo que las rodajas caigan en el plato. Luego, tocando las muestras lo menos posible, usa una microsonda para separar las rebanadas. Utilice la pipeta de transferencia para seleccionar secciones del cerebelo cerca del vermis en inserciones de cultivo celular individuales en la placa de seis pozos, y utilice la microsonda para colocar las rodajas en el centro de cada plaquita.

Cuando se hayan colocado todas las rodajas, aspirar cuidadosamente cualquier exceso de HBSS más glucosa, y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular. Para la tinción de inmunofluorescencia, retire el sobrenadante de cada pozo y lave las plaquitas con PBS. Fije las rodajas con un mililitro de frío 4%paraformaldehído en el pozo de cada plaquita, y 500 microlitros encima de cada plaquita durante una hora.

Al final de la fijación, lave las plaquitas cuatro veces durante 10 minutos con un mililitro de PBS fresco debajo de cada plaquita y 500 microlitros de PBS fresco en la parte superior de cada inserción por lavado en un agitador orbital. Rellene previamente cada pozo de una placa de 24 pozos con 500 microlitros de PBS-TB, y use un pincel para transferir las rodajas cerebelosas de cada inserto de cultivo celular en pozos individuales de una placa de 24 pozos. Permeabilizar y bloquear las rodajas a temperatura ambiente durante una hora.

Al final de la incubación, etiquete las células con 200 microlitros del anticuerpo primario de interés diluido en PBS-TB por pozo durante la noche a cuatro grados celsius en el agitador orbital. A la mañana siguiente, lave las rodajas cuatro veces durante 10 minutos y 500 microlitros de PBS fresco por lavado en la coctelera, antes de etiquetar las muestras con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo apropiados durante dos horas a temperatura ambiente en el agitador, protegidos de la luz. Al final de la incubación, contrate las secciones con 500 microlitros de una mancha nuclear adecuada por pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.

Y utilice una pipeta de transferencia para montar las rodajas en diapositivas de vidrio. A continuación, deje que las secciones se sequen completamente antes de rehidratarse con PBS y montar los tejidos con cubreobjetos recubiertos con aproximadamente 80 microlitros de medio de montaje. Una vez curado el medio de montaje, las secciones cerebelosas están listas para ser imagen.

En el día seis postnatal, la supervivencia de las células de Purkinje es baja en las muestras de control, consistente con su ventana de vulnerabilidad conocida. La supervivencia aumenta a medida que el animal donante envejece y sale de este período crítico. El tratamiento de las rodajas de cerebeloso con una alta concentración de cloruro de potasio resulta en una inducción exitosa de su despolarización y supervivencia.

Para obtener resultados consistentes y reproducibles, es fundamental seleccionar secciones cerebelosas saludables y realizar la configuración del cultivo de la manera más eficiente posible. Las aplicaciones post-cultivo van más allá de la inmunofluorescencia. Como se pueden utilizar rebanadas organotípicas para estudios de expresión de proteínas del genoma, y para monitorear la actividad del circuito neuronal utilizando electrofisiología e imágenes vivas de calcio.