Name: Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a generar organoides endometriales primarios humanos multicelulares para estudiar respuestas hormonales y mecanismos de enfermedad. Este método permite investigar factores de riesgo del cáncer endometrial en un modelo fisiológicamente relevante.

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Este estudio fue financiado por la subvención NIEHS/NIH/NCATS UG3 (ES029073) y el fondo Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge (JJK). Nos gustaría reconocer el Centro Básico de Patología del Noroeste para procesar los organoides fijos para la incrustación de parafina. Nos gustaría reconocer a todo el equipo de UG3, incluidos los laboratorios Woodruff, Burdette y Urbanek, por las discusiones y colaboraciones perspicaces.

Se recogieron muestras de endometriales de mujeres premenopáusicas sometidas a histerectomía de rutina para afecciones uterinas benignas en el Hospital de Mujeres de la Universidad Northwestern Prentice, de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todas las mujeres incluidas en el estudio.
1. Preparación de moldes de agarosa
<ol><li>Antes del inicio del aislamiento celular, moldee y equilibra 1.5% micromoldes de agarosa(Tabla de Materiales)para albergar los organoides de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>2. Generación de organoides endometriales
<ol><li>Cosecha de células estromales y epiteliales primarias
	<ol>
<li>En un gabinete de bioseguridad utilizando una técnica aséptica, prepare la solución enzimática (2,5 mg/ml de colagenasa tipo I + 0,1 mg/ml de DNase I en 10 ml de dosis [500 unidades]) a 37 oC, y filtre estérilmente la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,2 m en un tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>En un gabinete de bioseguridad utilizando una técnica aséptica, raspa el endometrio de las biopsias uterinas y el tejido picado bajo el capó en trozos muy pequeños con un bisturí. NOTA: Se requiere tejido endometrial de al menos 20 mm x 10 mm x 1 mm para generar un número suficiente de organoides.</li>
		<li>Poner tejido recién picado en la solución enzimática en un tubo cónico de 15 ml. Cierre la tapa y envuelva la tapa con una película de cera(Tabla de materiales)para evitar la contaminación.</li>
		<li>Coloque el tubo con tejido en un baño de agua o una incubadora a 37 oC durante 30 minutos con un suave temblor (80-100 rpm).</li>
		<li>Apilar un colador de células de 100 m en la parte superior de un colador de células de 20 m en un tubo cónico de 50 ml. Filtrar la solución a través de los dos coladores, y luego enjuagar el tubo cónico de 15 ml con 10 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS; Tabla de Materiales) y poner el lavado a través del colador para asegurarse de que todas las células se recogen. NOTA: El líquido de flujo a través contiene células estromales y glóbulos rojos (20 ml en total). Las células epiteliales se recogen en el colador de 20 m. Los trozos de tejido no digerido permanecen encima del colador de 100 m. Deseche el tejido no digerido en un contenedor de residuos peligrosos.</li>
		<li>Invierta el colador de células de 20 m del paso 2.1.5 en un nuevo tubo cónico de 50 ml y lave las células epiteliales del colador con 20 ml de medios organoides(Tabla de materiales)complementados con 1% de pluma/estreptococo.</li>
		<li>Centrifugar los tubos cónicos de los escalones 2.1.5 y 2.1.6 a 500 x g durante 5 min.</li>
		<li>Con las células estromales recogidas, retire el sobrenadante y resuspenda el pellet con 10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos.  Incubar a 37 oC durante 10 a 15 minutos. Centrifule el tubo cónico a 500 x g durante 5 min, retire el sobrenadante y resuspenda el pellet con 200 a 300 ml de medios organoides (consulte el paso 2.2.2 para obtener más instrucciones).</li>
		<li>Con las células epiteliales recogidas, retire el sobrenadante y vuelva a suspender con 100 s de medios organoides (consulte el paso 2.2.2 para obtener más instrucciones).</li>
	</ol></li>
	<li>Células de sembrado
	<ol>
<li>Después de equilibrar los moldes de agarosa del 1,5% en pozos (1 molde por pozo) de una placa de 24 pocillos, retire los medios organoides en el exterior de los moldes de agarosa e incline la placa de cultivo de tejido para que el medio de la cámara de sembración celular de los platos de agarosa también pueda ser cuidadosamente retirados.</li>
		<li>Vea las suspensiones celulares epiteliales (del paso 2.1.9) y estromales (del paso 2.1.8) bajo el microscopio.  Añadir más medios organoides a las suspensiones de células epiteliales o estromales 100 oL a la vez, de modo que las suspensiones sean aproximadamente iguales en densidad. NOTA: Las células epiteliales se aglutinarán, y no es aconsejable digerir/trippsinizar las células epiteliales en suspensiones de una sola célula.</li>
		<li>Combine 1 parte de las células estromales con 3 partes de células epiteliales por volumen.</li>
		<li>Pipetear 50 l (60.000 células) de la suspensión de celda combinada en la cámara de sembración celular del molde de agarosa.</li>
		<li>Una vez que los moldes de agarosa se llenan de células, agregue cuidadosamente 400 ml de medios organoides frescos en el pozo de la placa de 24 pocillos. NOTA: El medio llega justo debajo de la superficie de los platos de agarosa y no hará que las células flotan fuera de los moldes. Después de 2 a 3 días, las células se asentarán y comenzarán a formar organoides.</li>
		<li>Cambie el medio cada segundo día con 500 ml de medios organoides.</li>
		<li>Después de 2-3 días, cambiar medio a uno que se complementa con 0.1 nM estradiol (E) y 0.8 nM testosterona (T) para promover la organización de células epiteliales y estromales. NOTA: Aunque la organización de las células epiteliales y estromales puede ocurrir con o sin hormonas, más organoides se organizarán en presencia de hormonas.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cosecha de organoides endometriales para experimentos
NOTA: Una vez realizado el experimento, los organoides endometriales se pueden procesar para su histología o análisis de ARN. Los pasos siguientes describen cómo procesar los organoides.
<ol><li>
Histología
	<ol>
<li>Disolver 1.5% agarosa en solución salina con fosfato (PBS) por ebullición. Deje que el agarosa líquida se enfríe a aproximadamente 50 oC.</li>
		<li>Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pocillos y pipetee cuidadosamente el medio desde el exterior del molde de agarosa. Pipetear cuidadosamente el medio del interior del molde de agarosa para evitar interrumpir los organoides.</li>
		<li>Bajo un microscopio de disección, pipeta cuidadosamente 70-75 s de caliente (50 oC) 1.5% agarose en la cámara de la placa de agarosa. Tenga cuidado de no molestar a los organoides.</li>
		<li>Dejar enfriar a 4oC durante 5 min.</li>
		<li>Añadir un 4% de paraformaldehído (PFA) en cada pocal de la placa de 24 pocillos y fijar todo el molde de agarosa sellada que contiene organoides durante la noche a 4 oC. Luego almacenar en 70% etanol a 4 oC hasta que esté listo para procesar para la incrustación de parafina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento de ARN
	<ol>
<li>Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pocillos y pipetee cuidadosamente el medio de la cámara del molde de agarosa.</li>
		<li>Pipeta forzosa de 1 ml de medio organoide fresco directamente en el molde de agarosa para que los organoides se expulsen de los micropozos. Tenga cuidado de no crear demasiadas burbujas.</li>
		<li>Repita el pipeteo de nuevo con el mismo medio del paso 3.2.2.</li>
		<li>Recoger todo el medio que contiene los organoides. Centrifugar a la velocidad máxima para recoger los organoides y proceder a la extracción de ARN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidualization+of+the+human+endometrium%3A+mechanisms%2C+functions%2C+and+clinical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li>
<li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progesterone+receptor+regulates+implantation%2C+decidualization%2C+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li>
<li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li>
<li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+action+in+endometrial+cancer%2C+endometriosis%2C+uterine+fibroids%2C+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li>
<li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS%2FMS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos generado organoides endometriales humanos compuestos por células epiteliales y estromales del endometrio sin el uso de materiales de andamios exógenos. Si bien ya se ha demostrado que las células epiteliales endometriales primarias pueden formar organoides6,7, estas células se incrustaron en una matriz gelatinosa de proteínas secretadas por las células del sarcoma del ratón (ver Tabla de Materiales)para ayudar a forman estructuras esferoide...

El endometrio humano recubre la cavidad uterina y sirve como primer contacto para el embrión durante la implantación. El endometrio se compone de células epiteliales luminales y glandulares, fibroblastos estromales de apoyo, células endoteliales y células inmunitarias. Juntos, estos tipos de células conforman el tejido endometrial que es uno de los tejidos más sensibles a las hormonas esteroides sexuales1. Los cambios que ocurren durante cada ciclo menstrual son sorprendentes. Se requiere un crecimiento y remodelación adecuados del endometrio para permitir la implantación de embriones. Respuesta aberrante al estrógeno y la progesterona puede resultar en un endometrio refractario que no permite el establecimiento exitoso del embarazo e incluso puede resultar en enfermedades como la neoplasia endometrial.
Con el fin de estudiar las respuestas hormonales y los cambios esenciales que se producen en el endometrio, las células de los tejidos endometriales exhalados de los pacientes durante la cirugía o la biopsia endometrial se han propagado en el cultivo celular. Las células estromales endometriales proliferan y propagan fácilmente, y el proceso de diferenciación inducido por la progesterona puede recapitularse in vitro. Como resultado, mucho se ha aprendido durante este proceso de diferenciación, llamado decidualización2,3. El otro tipo de célula importante en el endometrio, las células epiteliales luminales y glandulares, sin embargo, no crecen bien como las monocapas tradicionales, perdiendo polaridad, convirtiéndose en senescente, y teniendo un potencial proliferativo limitado. Como resultado, se sabe menos de su biología y su papel en el endometrio humano. Como muchas neoplasias se originan a partir de las células epiteliales, los mecanismos asociados con la hiperplasia o la transformación a las células cancerosas siguen estando completamente definidos. Además, los estudios han establecido que la respuesta hormonal implica las acciones paracrinos íntimas entre las células epiteliales y estromales del endometrio4,5.
Recientemente, dos grupos independientes6,7,que son los primeros informes de organoides formados a partir de tejido endometrial, estableció un cultivo organoide tridimensional (3D) de células epiteliales endometriales. Estos organoides estaban compuestos de células epiteliales endometriales incrustadas dentro de una matriz proteica(Tabla de Materiales)y no incluían un compartimiento sensible hormonalmente importante del endometrio endometrial, los fibroblastos estromales. Como las proteínas de la matriz pueden variar de un lote a un lote y pueden desencadenar vías de señalización que no necesariamente se producen en el tejido, sería ideal reemplazar las proteínas de matriz con componentes del endometrio. En el estudio actual, se presenta un protocolo para generar organoides endometriales humanos libres de andamios de células epiteliales y estromales del endometrio humano. La presencia de células estromales no sólo proporciona el apoyo a las células epiteliales, sino que también proporciona las acciones paracrinos necesarias que se han establecido para ser importantes para la respuesta de la hormona endometrial4,8,9 .
El nuevo organoide endometrial multicelular ofrece un sistema modelo del endometrio que es fácil de generar y que incorpora células epiteliales y estromales. Estos organoides se pueden utilizar para estudiar cambios hormonales a largo plazo y eventos tempranos de enfermedad como la tumorigenesis debido a desequilibrio hormonal o insultos exógenos. La complejidad de estos organoides podría eventualmente ampliarse para incluir otros tipos celulares, incluyendo células endoteliales e inmunes con células posiblemente miometriales para imitar realmente la fisiología del tejido humano.

<table><tbody><tr><td>Agarosa HS, grado de biología molecular</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z764043</td><td>(https://www.microtissues.com/)</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio (NH4Cl)</td><td>Amresco</td><td>0621</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa, Tipo II, polvo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Corning</td><td>354235</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de eosina</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Receptor de estrógeno (SP1), anticuerpo monoclonal de conejo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-9101-S</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield con DAPI, medio de montaje para histología</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1x sin rojo, calcio, magnesio y fenol</td></tr><tr><td>Solución de tinción de hematoxilina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3530-32 Formulación Harris</td><td>modificada, solución</td></tr> de <tr><td>heparina</td> sin mercurio <td>Tecnologías</td> <td>STEMCELL07980</td><td>añadido a MammoCult media</td></tr><tr><td>Solución madre de hidrocortisona</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07925</td><td>añadido a MammoCult</td></tr><tr><td>media Organoid media - Mammocult</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05620</td><td>suplementado con 2 &micro; L/mL de heparina y 5 &micro; L/mL de hidrocortisona</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, solución al 16%</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Receptor de progesterona, PgR 1294, no conjugado, sobrenadante de cultivo</td><td>Agilent Technologies</td><td>M356801-2</td><td></td></tr><tr><td>matriz de proteínas - Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-E-cadherina purificado de ratón</td><td>BD Biociences 610181</td><td></td><td>36</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-vimentina recombinante [EPR3776]</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td></td></tr><tr><td>Kit de lisis y aislamiento de ARN</td><td>Zymo Research</td><td>R2060</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Testosterona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86500</td><td></td></tr><tr><td>Tinte tricrómico</td><td>Abcam</td><td>ab150686</td><td></td></tr><tr><td>Película de cera - Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

El endometrio humano es uno de los tejidos más hormonalmente sensibles en el cuerpo y es esencial para el establecimiento del embarazo. Este tejido también puede enfermarse y causar morbilidad e incluso la muerte. Los sistemas modelo para estudiar la biología endometrial humana se han limitado a los sistemas de cultivo in vitro de tipos de células únicas. Además, las células epiteliales, uno de los principales tipos celulares del endometrio, no propagan bien ni conservan sus rasgos fisiológicos en el cultivo, y por lo tanto nuestra comprensión de la biología endometrial sigue siendo limitada. Hemos generado, por primera vez, organoides endometriales que consisten en células epiteliales y estromales del endometrio humano. Estos organoides no requieren ningún material de andamio exógeno y se organizan específicamente para que las células epiteliales abarquen la estructura similar a los esferoides y se polarericen con células estromales en el centro que producen y secretan colágeno. Los receptores de estrógeno, progesterona y andrógenos se expresan en las células epiteliales y estromales y el tratamiento con niveles fisiológicos de estrógeno y testosterona promueven la organización de los organoides. Este nuevo sistema modelo se puede utilizar para estudiar la biología endometrial normal y la enfermedad de maneras que antes no eran posibles.

En la Figura 1se muestra un esquema del protocolo. El tejido uterino se obtuvo de la cirugía después de que fue examinado por los patólogos. El revestimiento endometrial se separó del miometrio raspando y el tejido endometrial se digería enzimáticamente a las células como se describe en el protocolo. Las células epiteliales y estromales se añadieron a los micropozos en los moldes de agarosa. Después de 7 días en cultivo, los organoides fueron tratados con E y T durante 7 a 14 días adicionale...

Se presenta un protocolo para generar organoides endometriales primarios humanos que consisten en células epiteliales y estromales y retienen las características del tejido endometrial nativo. Este protocolo describe los métodos desde la adquisición de tejido uterino hasta el procesamiento histológico de organoides endometriales.

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

El endometrio es un tejido que cambia cada mes en respuesta a las hormonas. El desequilibrio hormonal puede prevenir la unión de embriones y también causar enfermedades como el cáncer. Nuestro protocolo reconstruye el endometrio para que pueda ser estudiado fuera del cuerpo de la mujer de una manera fisiológica.La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una estructura 3D de células compuestas por dos tipos de células hormonalmente sensibles, las células epiteliales y estroma que se organizan y se comportan específicamente como lo hacen en el cuerpo. Dado que los organoides pueden imitar mejor el comportamiento del tejido, eventualmente se pueden utilizar para probar diferentes fármacos. Los organoides endometriales se pueden utilizar para estudiar los efectos directos de los factores de riesgo actualmente conocidos para el cáncer, incluyendo la obesidad y el síndrome de ovario policístico.Nuestros organoides enfatizan la importancia de las acciones paracrinas entre dos tipos de células. Es importante comenzar con una cantidad adecuada de tejido. Obtener la densidad correcta de las células epiteliales y estromales puede ser complicado.Además, los organoides son bastante pequeños y pueden ser difíciles de visualizar con tinción IHC. La visualización de este procedimiento es importante porque hay algunos pasos que serán mucho más fáciles de entender después de verlos. Estos incluyen obtener la capa de tejido correcta del útero, conseguir la densidad correcta de las células para combinar, y la siembra de los moldes de agarosa.Antes de comenzar el aislamiento celular, fundir y equilibrar micromoldeos de agarosa al 1,5% de acuerdo con las instrucciones del fabricante de albergar los organoides. En un gabinete de bioseguridad, utilice técnicas asépticas para preparar una solución enzimática a 37 grados Celsius y filtre la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros en un tubo cónico de 15 mililitros. Usando un bisturí, raspa el endometrio de las biopsias uterinas y pica el tejido en trozos muy pequeños.Coloque el tejido recién picado en el tubo cónico de 15 mililitros que contiene la solución enzimática. Cierre la tapa y envuelva la parte superior del tubo con una película de cera para evitar la contaminación. Coloque el tubo en un baño de agua o incubadora a 37 grados Centígrados durante 30 minutos con agitación suave.Después de esto, apile un colador celular de 100 micras encima de un colador celular de 20 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. Filtrar la solución a través de los dos coladores. Enjuague el tubo cónico de 15 mililitros con HBSS y coloque este lavado a través del colador para asegurarse de que todas las células se recogen.Luego, invierta el colador celular de 20 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y lave las células epiteliales del colador con 20 mililitros de medios organoides complementados con 1%penicilina y estreptomicina. Centrifugar los tubos cónicos a 500 G durante cinco minutos. Para las células estromales recogidas, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en 10 mililitros de tampón de lylisis de glóbulos rojos.Incubar a 37 grados centígrados durante 10 a 15 minutos. Centrifugar estas células a 500 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet con 200 a 300 microlitros de medios organoides.Para las células epiteliales recogidas, retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 100 microlitros de medios organoides. Después de que los moldes de 1,5% de agarosa estén equilibrados, retire el medio organoide en el exterior de los moldes de agarosa e incline la placa de cultivo de tejido para que el medio de la cámara de siembra celular de los platos de agarosa también se pueda eliminar cuidadosamente. Vea las suspensiones epiteliales y estromales bajo un microscopio y agregue más medios organoides a las suspensiones, asegurándose de agregar sólo 100 microlitros a la vez para que la suspensión sea aproximadamente igual en densidad.Luego combina una parte de las células estromales con tres partes de las células epiteliales por volumen. Pipetear 50 microlitros de la suspensión celular combinada en la cámara de siembra celular del molde de agarosa. Una vez que los moldes de agarosa están llenos de células, agregue cuidadosamente 400 microlitros de medios organoides frescos en los pozos de la placa de 24 pozos.Incubar a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono, asegurándose de cambiar el medio cada segundo día con 500 microlitros de medios organoides. Después de siete días, cambiar el medio a uno que se complementa con 0.1 estradiol nanomolar y 0.8 testosterona nanomolar para promover la organización de las células epiteliales y estromales. Primero, disolver 1.5% de agarosa en PBS por ebullición.Coloque la agarosa líquida en un vaso de agua caliente y deje que se enfríe a aproximadamente 50 grados centígrados. Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pozos y pipetee cuidadosamente el medio desde el exterior del molde de agarosa. A continuación, pipetee cuidadosamente el medio del interior del molde de agarosa para evitar interrumpir los organoides.Añadir cuidadosamente entre 70 y 75 microlitros de calor, 1,5% agarosa en la cámara de la agarosa, teniendo cuidado de no molestar a los organoides. Deje que la placa se enfríe a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de esto, agregue 4%paraformaldehído en cada pozo de la placa de 24 pozos y fije todo el molde de agarosa sellado durante la noche a cuatro grados Celsius.Al día siguiente, almacene la placa en 70% etanol a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para procesar para la incrustación de parafina. Para comenzar el aislamiento de ARN, vea la placa bajo un microscopio de disección. Incline la placa y pipetee cuidadosamente el medio de la cámara del molde de agarosa.Pipeteando con fuerza un mililitro de medio organoide fresco directamente en el molde de agarosa para que los organoides se expulsen de los micropocillos, teniendo cuidado de no crear demasiadas burbujas. Repita este proceso de pipeteo contundente una vez utilizando el mismo medio. Después de esto, recoger todo el medio que contiene los organoides.Centrifugar a 500 G para recoger los organoides, y proceder a la extracción de ARN. En este estudio, se generan organoides endometriales humanos compuestos por células epiteliales y estromales del endometrio sin el uso de materiales de andamios exógenos. Para el procesamiento histológico, los moldes de agarosa que contienen los organoides endometriales se sellan con agarosa, seguidos de fijación con 4%paraformaldehído durante la noche.Estos moldes se procesan para la incrustación de parafina estándar seccionada y teñida para histología, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica. La hematoxilina en la tinción de eosina revela una estructura similar a la esferoides con una sola capa de células que recubren el exterior y las células en el centro. Los marcadores específicos de células para células endometriales, epiteliales y estromales revelan células epiteliales que rodean el organoide con células estromales en el centro.Los marcadores de fisiología endometrial confirman que los organoides endometriales conservaron ciertas características del tejido nativo. La tinción de tri-cromo, que mancha el colágeno azul y los glóbulos rojos, muestra la presencia de colágeno dentro del centro donde residían las células estromales, demostrando la producción activa y secreción de colágeno por células estromales similares al tejido nativo. Además, la tinción inmunohistoquímica revela la presencia de receptores de estrógeno, receptores de andrógenos y receptores de progesterona en las células epiteliales y estromales.Es importante planchar las células densamente para que tengamos suficientes organoides para experimentos posteriores. Esto requerirá un poco de práctica. Los organoides endometriales se pueden cultivar en diferentes condiciones y luego cosecharse para experimentos como inmunohistoquímica o tinción de inmunofluorescencia para estudiar la expresión de proteínas o cosechar arneses para estudiar la expresión génica.Nuestro laboratorio investiga cómo el endometrio responde a los niveles hormonales alterados, que pueden conducir a la hiperplasia endometrial y el cáncer. Podemos utilizar estos organoides para tratamientos a largo plazo de las hormonas y agregar condiciones patológicas como el exceso de testosterona que se encuentra en el síndrome de ovario policístico, o señales de adipocitos para estudiar los cambios endometriales inducidos por la obesidad. Los tejidos humanos se consideran biopeligrosos, y será importante tomar las precauciones adecuadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Presentamos un protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir de dientes humanos. Los organoides son robustamente expandibles y recapitulan las células madre epiteliales del diente, incluida su capacidad de diferenciación de ameloblastos. El modelo organoide único proporciona una herramienta prometedora para estudiar la biología dental humana (células madre) con perspectivas para enfoques regenerativos de dientes.

Establecer organoides a partir de dientes humanos como una herramienta poderosa hacia la investigación mecanicista y la terapia regenerativa

Este protocolo describe metodologías para establecer organoides epiteliales endometriales de ratón para la expresión génica y análisis histológicos.

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

Este protocolo describe la generación de organoides hepáticos endodérmicos (eHEPOs) rápidos y reproducibles. Con este protocolo, los eHEPOs pueden producirse en 2 semanas y expandirse a largo plazo (más de 1 año) sin perder su diferenciación y funcionalidad.

Generación de organoides hepáticos endodérmicos funcionales

Este protocolo describe el establecimiento de organoides tisulares tridimensionales (3D) a partir de células primarias del epitelio de superficie ovárica humana (hOSE). El protocolo incluye el aislamiento de hOSE a partir de ovarios recién recolectados, la expansión celular de la hOSE, los procedimientos de criopreservación-descongelación y la derivación de organoides. Se incluyen la inmunofluorescencia, el análisis cuantitativo y la demostración de su utilidad como plataforma de cribado.

Organoides del epitelio de la superficie del ovario humano como plataforma para estudiar la regeneración de tejidos

En este trabajo se presenta un protocolo para aislar y cultivar células madre epiteliales endometriales (reESCs) de rata, generando organoides endometriales de rata. Este método facilita los estudios in vitro de las enfermedades endometriales, permitiendo la edición génica y otras manipulaciones celulares.

Generación y caracterización de organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales de rata

Presentamos un protocolo detallado para establecer y manipular genéticamente organoides cervicales humanos.

Generación y manipulación genética de organoides cervicales humanos

Este protocolo describe un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos que recapitulan características clave de la morfogénesis mamaria en un sistema de cultivo tridimensional controlado.

Un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos tridimensionales que recapitulan la morfogénesis mamaria

El modelado del desarrollo del cerebro humano se ha visto obstaculizado debido a la complejidad sin precedentes del tejido epitelial neural. Aquí, se describe un método para la generación robusta de organoides cerebrales para delinear eventos tempranos del desarrollo del cerebro humano y para modelar la microcefalia in vitro.

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

Aprende a generar organoides endometriales primarios humanos multicelulares para estudiar respuestas hormonales y mecanismos de enfermedad. Este método permite investigar factores de riesgo del cáncer endometrial en un modelo fisiológicamente relevante.

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

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